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Genética microbiana
Dr. Edson Soruco
INTRODUCCION
• Introducción a la ciencia de la genética y su análisis de la herencia de funciones
fisiológicas.
• el gen es la unidad básica de herencia, compuesto de ADN que codifica información
específica.
• Método tradicional de la genética: identificación de genes según su contribución al
fenotipo.
• Experimento de Griffith en la década de 1930, sugiriendo la participación del ADN
en la herencia.
• Descubrimiento de Avery, MacLeod y McCarty que confirma al ADN como el agente
transformador en la herencia.
Desarrollo de la tecnología del ADN recombinante entre 1960 y 1970,
revelando enzimas de restricción y plásmidos.
La función de los plásmidos como elementos genéticos capaces de
replicación independiente en bacterias y levaduras.
El uso de enzimas de restricción para amplificar y manipular
fragmentos de ADN.
Aplicaciones de la tecnología del ADN recombinante en la ingeniería
genética, tanto en células procariotas como eucariotas.Impacto
significativo en el avance médico contemporáneo.
1.La información genética en bacterias se almacena en forma de secuencia de bases de
ADN, que mayormente son bicatenarias con bases complementarias (A-T; G-C) unidas
por puentes de hidrógeno.
2.Las dos cadenas de ADN tienen una orientación antiparalela: una es 5′→ 3′ y la otra es
3′→ 5′.
3.La complementariedad de las bases permite la replicación y transcripción del ADN,
donde una cadena sirve como plantilla para la síntesis de ARN.
4.Las proteínas se unen al ADN para regular la expresión génica, principalmente en el
surco principal.
5.El ADN se compone de nucleótidos, cada uno formado por una base (A, T, C, G) unida a
una fosfo-2'-desoxirribosa.
6.La longitud del ADN se mide en pares de bases (kbp), siendo los genomas bacterianos
mucho más grandes que los de los virus.
7.El ARN, generalmente monocatenario, utiliza la base uracilo (U) en lugar de timina (T) y
puede formar estructuras compactas.
8.El ARN mensajero (ARNm) lleva la secuencia genética desde el ADN a los ribosomas
para la síntesis de proteínas.
9.El ARN ribosómico (ARNr) y el ARN de transferencia (ARNt) son esenciales en la
síntesis de proteínas, constituyendo la mayoría del ARN total en la célula.
10.Algunas moléculas de ARN actúan como enzimas (ribozimas), como el ARN 23S en la
ÁCIDOS NUCLEICOS Y SU
ORGANIZACIÓN EN GENOMAS
EUCARIÓTICO, PROCARIÓTICO Y VIRAL
GENOMA DE CELUAS EUCARIOTAS
1. El genoma es la totalidad de la información genética de un organismo, y en células eucariotas se transporta
en cromosomas lineales dentro del núcleo.
2. Las células eucariotas diploides tienen dos homólogos de cada cromosoma, lo que puede compensar
mutaciones y dificultar su detección.
3. Los genes pueden ser recesivos o dominantes dependiendo de su expresión fenotípica en presencia de su
homólogo.
4. Las células haploides, como las de levadura, son útiles para estudiar mutaciones ya que tienen una sola copia
de la mayoría de los genes.
5. Solo el 2% del genoma humano se considera codificante, el resto es DNA no codificante.
6. Las células eucariotas contienen mitocondrias y, en
algunos casos, cloroplastos, cada uno con su propio ADN
circular que contiene genes relacionados con la función
del organelo.
7. Algunas levaduras tienen DNA adicional en forma de
plásmidos, que son útiles en ingeniería genética debido a
su manipulabilidad.
8. El DNA repetitivo se encuentra en grandes cantidades
en células procariotas y eucariotas, principalmente en
regiones no codificantes, y puede estar asociado con
adaptación y variación genética.
9. Los intrones, secuencias de DNA que se eliminan en la
traducción del mRNA, son comunes en genes eucariotas
pero raros en eubacterias.
GENOMA DE LAS CELULAS PROCARIOTAS
1. Los genes en bacterias generalmente se encuentran en cromosomas bacterianos, que son haploides, aunque
algunas especies tienen dos cromosomas.
2. Los plásmidos, moléculas circulares de DNA, también contienen genes adicionales y pueden variar en tamaño
desde varios hasta 100 kbp.
3. Las células procariotas no tienen un núcleo, por lo que los genes bacterianos no están separados del citoplasma.
4. Algunas bacterias patógenas tienen genes específicos, como las islas de patogenicidad, que codifican genes de
virulencia y otros determinantes patógenos.
5. Los plásmidos pueden transportar genes de resistencia a antibióticos y otros genes que facilitan la movilización
genética entre bacterias.
6. Los transposones son elementos genéticos que pueden moverse a diferentes loci genéticos, creando mutaciones
de inserción.
.
GENOMA DE LAS CELULAS PROCARIOTAS
7. Los elementos de inserción son transposones cortos que solo transportan genes
para enzimas necesarias para su propia transposición.
8. Los plásmidos y los cromosomas pueden transportar elementos IS, que son
importantes para la formación de cepas recombinantes y la propagación de
resistencia a antibióticos.
9. Los transposones dependen de su integración física con un replicón bacteriano
para su propagación y suelen insertarse en regiones que codifican tRNA.
10. Los plásmidos pueden servir como vehículos para la diseminación de
transposones entre la población bacteriana
GENOMA VIRAL
1. Los virus dependen de una célula hospedadora para replicarse y sobrevivir.
2. La replicación viral requiere la energía metabólica y la maquinaria de síntesis de macromoléculas del
hospedador.
3. Para la propagación exitosa de los virus se necesitan formas estables para la supervivencia fuera del
hospedador, mecanismos de invasión celular, información genética para la replicación viral y para el
empaquetamiento y liberación de nuevos virus.
4. Los bacteriófagos son virus que infectan bacterias y constituyen el mayor grupo de todos los virus, con más de
5000 aislamientos conocidos.
5. Los bacteriófagos pueden contener diferentes tipos de ácido nucleico, como DNA bicatenario, RNA bicatenario,
ssRNA o DNA monocatenario.
GENOMA VIRAL
6. Existen bacteriófagos líticos que destruyen la célula hospedadora para liberar
nuevas partículas virales, y bacteriófagos moderados que pueden insertarse en el
cromosoma de la bacteria hospedadora.
7. Los bacteriófagos pueden diferenciarse por su modo de propagación en líticos y
moderados.
8. Los bacteriófagos filamentosos, como el bacteriófago M13 de E. coli, son
excepcionales en su comportamiento y se utilizan en ingeniería de DNA.
9. Las topoisomerasas son enzimas esenciales para alterar el superenrollado del DNA
y son el blanco de algunos antibióticos, como las quinolonas.
10. La replicación de DNA de plásmidos y la replicación de DNA bacteriano son
procesos similares, con topoisomerasas esenciales en ambos casos.
REPLICACION
El dsDNA se sintetiza por replicación semiconservadora. Conforme la
doble cadena original se desenrolla, cada cadena sirve como plantilla
(es decir, como la fuente de información de la secuencia) para la
replicación de DNA. Nuevas cadenas se sintetizan con la colocación de
bases en orden complementario a las cadenas preexistentes. Cuando se
ha completado la síntesis, cada molécula hija contiene una cadena
original y una cadena de síntesis reciente
ADN BACTERIANO
1. Los virus dependen de una célula hospedadora para replicarse y sobrevivir.
2. La replicación viral requiere la energía metabólica y la maquinaria de síntesis de macromoléculas del hospedador.
3. Para la propagación exitosa de los virus se necesitan formas estables para la supervivencia fuera del hospedador,
mecanismos de invasión celular, información genética para la replicación viral y para el empaquetamiento y
liberación de nuevos virus.
4. Los bacteriófagos son virus que infectan bacterias y constituyen el mayor grupo de todos los virus, con más de
5000 aislamientos conocidos.
5. Los bacteriófagos pueden contener diferentes tipos de ácido nucleico, como DNA bicatenario, RNA bicatenario,
ssRNA o DNA monocatenario.
6. Existen bacteriófagos líticos que destruyen la célula hospedadora para liberar nuevas partículas virales, y
bacteriófagos moderados que pueden insertarse en el cromosoma de la bacteria hospedadora.
7. Los bacteriófagos pueden diferenciarse por su modo de propagación en líticos y moderados.
8. Los bacteriófagos filamentosos, como el bacteriófago M13 de E. coli, son excepcionales en su
comportamiento y se utilizan en ingeniería de DNA.
9. Las topoisomerasas son enzimas esenciales para alterar el superenrollado del DNA y son el
blanco de algunos antibióticos, como las quinolonas.
10. La replicación de DNA de plásmidos y la replicación de DNA bacteriano son procesos similares,
con topoisomerasas esenciales en ambos casos.
ADN BACTERIANO
1. Los fagos muestran diversidad en su ácido nucleico y modos de replicación.
2. Los fagos líticos producen muchas copias de sí mismos durante un brote de
crecimiento, mientras que los fagos moderados pueden establecerse como profagos o
probacteriófagos.
3. La replicación del DNA de fagos líticos implica la formación de DNA circular a partir de
extremos de cohesión y su posterior desdoblamiento para la formación de progenie viral.
4. Los fagos filamentosos convierten su ssDNA en una forma circular bicatenaria para su
replicación.
5. Los fagos ssRNA, como el fago MS2, contienen genes que permiten su propia
replicación, incluyendo la codificación de proteínas de cubierta y polimerasas de RNA.
6. Los profagos, formas latentes de fagos moderados, contienen genes para la replicación
lítica, pero su expresión está reprimida mientras están en estado de profago.
7. La desrepresión de los profagos puede ser desencadenada por estímulos como la luz
ultravioleta, lo que lleva a la replicación vegetativa y la liberación de nuevas partículas
virales.
8. El cambio entre la lisogenia y el crecimiento de un fago vegetativo puede depender del
estado fisiológico de la célula hospedadora.
BACTERIOFAGOS
TRANSFERENCIA DE ADN
A pesar de la naturaleza haploide del genoma bacteriano, la distribución ubicua de
diversas bacterias en el medio ambiente contribuye a una notable diversidad genética.
El intercambio genético bacteriano implica la transferencia de fragmentos relativamente
pequeños de genoma donador a una célula receptora, seguida de la recombinación
genética.La recombinación genética bacteriana es diferente de la fusión de gametos en
células eucariotas, ya que el proceso implica que el DNA donador se replique en el
organismo receptor. La replicación del DNA donador puede lograrse mediante la
integración en el cromosoma del receptor o como un episoma independiente.Estos
mecanismos de intercambio genético contribuyen a la plasticidad genómica de las
bacterias y a su capacidad de adaptarse a diferentes condiciones ambientales.
RESTRICCION Y OTRAS LIMITANTES DE LA
TRANSFERENCIA GENICA
1. Las enzimas de restricción (endonucleasas de restricción) permiten a las bacterias diferenciar entre su
propio DNA y el DNA de otros organismos.
2. Estas enzimas cortan el DNA en sitios de restricción específicos que dependen de secuencias
específicas de DNA.
3. Cada cepa bacteriana tiene un sistema de restricción que puede modificar los sitios de reconocimiento
en su propio DNA mediante metilación o adición de residuos de citosina.
4. Los sistemas de modificación de restricción se dividen en dos grupos principales: tipo I, que combina
actividades de restricción y modificación en una proteína con varias subunidades, y tipo II, que consta de
endonucleasas y metilasas separadas.
5. La restricción biológica puede resultar en la separación del DNA donante antes de que pueda
integrarse como parte de un replicón recombinante, lo que hace que la bacteria sea "inmune" al DNA de
entrada.
RESTRICCION Y OTRAS LIMITANTES DE LA
TRANSFERENCIA GENICA
6. Algunos plásmidos tienen una especificidad de hospedador limitada y solo pueden
replicarse en un grupo estrecho de bacterias, mientras que otros plásmidos, como los de
resistencia a fármacos, pueden replicarse en una amplia variedad de géneros bacterianos.
7. En algunos casos, la coexistencia de dos o más plásmidos dentro de una bacteria puede
interferir con la replicación o la partición, lo que lleva a la pérdida de uno de los plásmidos
cuando la bacteria se divide.
8. Este fenómeno se conoce como incompatibilidad de plásmidos, donde dos plásmidos que
no pueden coexistir de manera estable pertenecen al mismo grupo de incompatibilidad
(Inc), mientras que dos plásmidos que pueden coexistir pertenecen a diferentes grupos Inc.
MECANISMOS DE RECOMBINACION
1. El DNA donador que no puede replicarse por sí mismo debe combinarse con el DNA del
receptor para establecerse en la cepa receptora.
2. La recombinación puede ser homóloga, que implica un intercambio entre secuencias de
DNA similares entre el donador y el receptor, o no homóloga, que involucra la
recombinación entre secuencias de DNA diferentes.
3. La recombinación homóloga generalmente implica el intercambio entre genes que
comparten ancestros comunes y requiere un grupo de genes designados como rec.
4. La recombinación no homóloga depende de enzimas codificadas por el DNA integrado y
se ilustra principalmente por la inserción de DNA en un receptor para formar una copia de
un transposón donador.
5. El mecanismo de recombinación mediado por los productos génicos del gen rec es
recíproco, lo que significa que la introducción de una secuencia donadora en un receptor
corresponde con la transferencia de una secuencia receptora homóloga en el DNA donador.
6. La comunidad científica está prestando cada vez más atención a la conversión génica,
que es la transferencia no recíproca de secuencias de DNA del donador al receptor, como un
mecanismo importante en la adquisición de diversidad genética.
1. La composición del DNA en los microorganismos es altamente fluida, lo que permite la
transferencia de DNA de un organismo a otro.
2. Este proceso se llama transferencia génica horizontal y es diferente de la herencia
vertical, que implica la herencia de genes de los progenitores.
3. Los tres mecanismos principales de transferencia de DNA entre células son la conjugación,
la transducción y la transformación.
4. En la conjugación, la célula donadora y receptora están en contacto directo, y se
transfiere una sola cadena de DNA.
5. La transducción implica que el DNA del donador se transporta en un fago y luego se
transfiere al receptor durante la infección por bacteriófagos.
6. La transformación implica la captación directa de DNA desnudo del donador por parte de
la célula receptora, que puede ocurrir de forma natural o ser inducida en el laboratorio.
7. La transformación forzada, inducida en el laboratorio, es un proceso fundamental en la
ingeniería genética, donde las bacterias se vuelven competentes para captar plásmidos
extracelulares después de un tratamiento específico.
MECANISMOS DE
TRANSFERENCIA GENICA
1. Los plásmidos se transfieren frecuentemente por
conjugación, donde los genes tra son responsables de
proporcionar las funciones necesarias para la
transferencia.
2. Los plásmidos autotransmisibles, que llevan los genes
tra, pueden movilizar otros plásmidos o porciones del
cromosoma para su transferencia.
3. El factor de fertilidad F+ en E. coli confiere
características específicas al donador, como la capacidad
de formar un puente con el receptor y transferir un
plásmido a la célula receptora.
4. Los donadores con el factor de fertilidad F+ pueden
integrarse en diversos locus cromosómicos, creando
donadores con recombinación de alta frecuencia (Hfr).
A)CONJUGACION
A)CONJUGACION
5. La conjugación Hfr ha permitido el mapeo genético de E. coli y otras bacterias, midiendo la
distancia entre los loci en minutos de transferencia durante la conjugación.
6. La integración del DNA cromosómico en un plásmido de conjugación puede producir un replicón
recombinante (F o R) en el cual el DNA cromosómico integrado puede replicarse
independientemente.
7. Los merodiploides, que son parcialmente diploides, pueden ser útiles para estudios de
complementación genética, pero son genéticamente inestables debido a la recombinación entre
plásmidos y cromosomas homólogos.
8. La genética microbiana convencional basada en la selección de plásmidos cebadores puede
utilizarse para aislar genes de organismos de crecimiento lento para su estudio en E. coli u otras
bacterias.
B)TRANSDUCCION
La transducción es un mecanismo de recombinación genética en bacterias
facilitado por bacteriófagos, donde el ácido nucleico bacteriano se
transporta dentro de la cápside de un fago. Las partículas de transducción
contienen DNA bacteriano en lugar de DNA viral y pueden utilizarse para
transferir genes de una bacteria a otra. Los fagos moderados son
preferidos para la transducción porque la infección bajo condiciones que
favorecen la lisogenia reduce la lisis celular, lo que aumenta la
supervivencia de las cepas recombinantes. La presencia de un profago en
la bacteria receptora puede proporcionar inmunidad celular y replicación,
lo que hace que los fagos moderados sean útiles para la ingeniería
genética. En la naturaleza, los fagos a menudo transportan islas de
patogenicidad, como en el caso de V. cholerae, donde los fagos pueden
transportar genes de toxinas y otros elementos virulentos que causan
enfermedades como el cólera epidémico.
C. Transformación
1. La transformación forzada, inicialmente concebida como un
procedimiento de laboratorio, se ha demostrado que ocurre
naturalmente y contribuye a la transferencia horizontal de genes (HGT)
en bacterias.
2. La HGT de baja frecuencia se relaciona con mecanismos comunes de
resistencia a los antibióticos en diversas especies bacterianas,
impulsada por la complejidad y densidad de la flora intestinal y las
biopelículas.
3. La administración terapéutica de antibióticos selecciona
microorganismos resistentes, lo que, combinado con otros factores,
crea condiciones propicias para la diseminación de material genético
entre diferentes especies bacterianas.
C. Transformación
4. La competencia natural para la transformación, donde las bacterias captan directamente el
ADN del donador, es rara pero importante en ciertos géneros bacterianos como Haemophilus
influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis y Streptococcus pneumoniae.
5. La transformación natural requiere proteínas específicas producidas por la célula receptora y
secuencias de ADN captadoras específicas de especie para incorporar el ADN.
6. Las secuencias captadoras restringen el intercambio genético a una especie única, mientras
que el ADN no incorporado puede degradarse y usarse como fuente de nutrientes.
7. La transformación genética es una fuerza importante en la evolución microbiana,
contribuyendo a la diversidad genética y la adaptación de las bacterias a su entorno.
MUTACIONES Y REORDENACION GENETICA
Mutaciones espontáneas
1. Las mutaciones espontáneas para un gen dado en un entorno natural ocurren con una
frecuencia de aproximadamente 10^-6 a 10^-8 en una población derivada de una sola
bacteria.
2. Las mutaciones pueden incluir sustituciones de bases, deleciones, inserciones y
reordenamientos, siendo las sustituciones de bases las más comunes.
3. Las sustituciones de bases pueden surgir durante la replicación debido a la colocación
inapropiada de pares de bases entre bases complementarias.
4. Las enzimas de reparación de errores corrigen las sustituciones de bases y otras
anomalías durante la replicación, asegurando la integridad del ADN.
5. La respuesta SOS es un sistema de reparación de ADN que se activa cuando el daño del
ADN es extenso, permitiendo que la replicación continúe con errores en ciertas
circunstancias.
6. Muchas mutaciones de sustitución de base no alteran
significativamente la función de los productos génicos y
pueden pasar desapercibidas a nivel fenotípico.
7. Las mutaciones interruptoras o finalizadoras
interrumpen la síntesis de proteínas y pueden resultar en
productos génicos inactivos.
8. Los reordenamientos genéticos pueden ocurrir debido
a deleciones, duplicaciones o inversiones de segmentos
de ADN, y pueden ser causados por recombinación entre
secuencias repetidas directamente.
9. Los reordenamientos grandes, como las deleciones
extensas, casi nunca se revierten y pueden alterar
permanentemente el genoma bacteriano.
10. Las mutaciones de duplicación son comunes pero
inestables y tienden a revertirse fácilmente.
11. Los reordenamientos genéticos pueden fijarse en
poblaciones naturales de bacterias, lo que indica que la
disposición lineal de los loci en el cromosoma no limita
completamente las interacciones entre ellos.
1. La frecuencia de mutaciones se incrementa significativamente por la exposición a
mutágenos, como la luz ultravioleta (UV) y mutágenos químicos.
2. La luz ultravioleta (UV) daña el ADN al formar dímeros de timina, lo que puede introducir
errores de secuencia durante la reparación enzimática.
3. Los mutágenos químicos pueden alterar la estructura física o química del ADN, como el
ácido nitroso (HNO2), que sustituye grupos hidroxilo por aminoácidos en las bases del ADN.
4. Los compuestos químicos reactivos pueden causar desplazamientos del marco de lectura,
una mutación genética que resulta de inserciones o deleciones de un número de
nucleótidos no divisible entre tres.
5. La exposición a colorantes acridínicos, como el naranja de acridina, facilita el
deslizamiento del marco de lectura al intercalarse entre las bases del ADN.
6. El efecto directo de los mutágenos químicos o físicos es el daño al ADN, lo que puede
llevar a mutaciones durante el proceso de replicación y escape de la reparación por
enzimas.
7. Las mutaciones que afectan la actividad de replicación o las enzimas de reparación
pueden hacer que las bacterias sean más susceptibles a los mutágenos biológicos y se
conocen como cepas mutantes.
Mutágenos
La recuperación de la actividad perdida como resultado de una mutación se conoce como
reversión fenotípica. La reversión fenotípica puede o no implicar el restablecimiento de la
secuencia original de ADN, lo que sería necesario para una reversión genotípica.En muchos
casos, una mutación en un segundo locus puede restablecer la actividad perdida, un
fenómeno conocido como mutación de supresión. La supresión intragenética ocurre cuando
una segunda mutación en un sitio diferente en los genes de la enzima restaura la estructura
necesaria para la actividad enzimática. La supresión extragénica ocurre cuando una segunda
mutación que se encuentra fuera del gen originalmente afectado restablece la actividad
perdida.
REVISION Y SUPRESION
1. A pesar de la notoria separación evolutiva entre
células eucariotas y procariotas, comparten algunos
mecanismos de expresión génica.
2. Ambos grupos almacenan información genética en el
ADN, que se transcribe en ARN mensajero (ARNm) y
luego se traduce en proteínas.
3. Durante la transcripción, la ARN polimerasa sintetiza
una cadena de ARNm utilizando el ADN como plantilla.
4. Los aminoácidos se activan y se unen a moléculas
adaptadoras específicas de ARN llamadas ARN de
transferencia (ARNt), que tienen un anticodón
complementario al codón del ARNm.
5. Durante la traducción, el ARNm y el ARNt se
encuentran en los ribosomas, donde se ensambla la
cadena de aminoácidos para formar una proteína.
EXPRESION GENICA
EXPRESION GENICA
6. En las células procariotas, los genes suelen estar agrupados en operones, y la
transcripción y la traducción están acopladas, permitiendo una rápida respuesta a los
cambios ambientales.
7. En las células eucariotas, los genes raramente están agrupados, y la transcripción y la
traducción están desacopladas. Además, los genes eucariotas contienen intrones que
deben eliminarse durante el procesamiento del ARN.
8. Los ribosomas eucariotas y procariotas difieren en tamaño y composición, y los
ribosomas procariotas son más susceptibles a ciertos antibióticos que los ribosomas
eucariotas.
9. Los ribosomas de las mitocondrias en las células eucariotas se asemejan a los de las
células procariotas y pueden ser sensibles a ciertos antibióticos.
Regulación de la expresión
génica en células procariotas
1. Las proteínas específicas, productos de genes
reguladores, controlan la expresión de genes
estructurales codificantes de enzimas.
2. La transcripción del ADN a ARNm comienza en el
promotor, una secuencia de ADN que se une a la ARN
polimerasa.
3. El nivel de expresión génica depende de la capacidad
del promotor para unirse a la polimerasa y la eficacia
intrínseca de los promotores varía ampliamente.
4. Las proteínas reguladoras adicionales pueden unirse a
regiones de ADN cercanas a los promotores para ejercer
control adicional sobre la expresión génica.
5. Muchos genes estructurales procarióticos están
agrupados en operones, como el operón trp de E. coli,
que codifica para la biosíntesis de triptófano.
Regulación de la expresión génica en células
procariotas
6. La expresión del operón trp está regulada por mecanismos de represión y atenuación. La represión
ocurre cuando una proteína represora se une al operador, mientras que la atenuación controla la
eficiencia de la transcripción después de su inicio.
7. El operón lac también está regulado, pero de manera positiva en respuesta a la presencia de
alolactosa, un metabolito de la lactosa.
8. La proteína transportadora de AMP cíclico (CAP) ejerce control positivo sobre la expresión del operón
lac al aumentar la actividad de la ARN polimerasa.
9. Otros nucleótidos, como el ppGpp, también pueden influir en la expresión génica en E. coli, por
ejemplo, en respuesta a la ausencia de aminoácidos o al daño del ADN.
INGENIERIA GENETICA
1. La bioingeniería basada en la genética bacteriana ha
transformado la biología en los últimos 40 años.
2. Es posible aislar fragmentos específicos de ADN y
amplificarlos, y sus genes pueden expresarse en
concentraciones elevadas.
3. La especificidad de los nucleótidos permite el
desdoblamiento de las enzimas de restricción, lo que
permite unir fragmentos de genes a plásmidos (vectores)
que se utilizan para transformar células bacterianas.
4. Las colonias bacterianas o clonas pueden portar genes
específicos que se pueden identificar mediante
hibridación de ADN o ARN con sondas marcadas.
5. Los productos proteínicos codificados por los genes pueden identificarse por actividad
enzimática o técnicas inmunológicas.
6. Las técnicas de ingeniería genética permiten aislar prácticamente cualquier gen para
estudiar o explotar sus propiedades bioquímicas identificables.
7. Los genes aislados pueden utilizarse para mutagénesis de sitio dirigido, alterando
secuencias de ADN específicas.
8. Las técnicas de hibridación permiten usar el ADN como sonda para detectar secuencias
complementarias de ácidos nucleicos.
9. Los productos proteínicos de genes virales aislados ofrecen promesa como vacunas.
10. Proteínas útiles, como la insulina, pueden producirse en grandes cantidades a partir de
bacterias que expresan genes clonados.
INGENIERIA GENETICA
1. Las bacterias muestran una amplia diversidad genética reflejada en su variedad de
enzimas de restricción, las cuales tienen una notable selectividad para identificar regiones
específicas de ADN para su corte.
2. Las secuencias de ADN reconocidas por enzimas de restricción son predominantemente
palíndromos, con repeticiones invertidas.
3. Por ejemplo, la enzima EcoR1 reconoce la secuencia palindrómica GAATTC, que se
refleja como AAG en la cadena opuesta.
PREPARACIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA CON ENZIMAS DE
RESTRICCIÓN
4. La longitud de los fragmentos de ADN producidos por enzimas de restricción varía según la
secuencia de ADN específica reconocida por cada enzima.
5. Las enzimas de restricción pueden reconocer cuatro, seis, ocho, o incluso más secuencias de
bases, lo que afecta la longitud promedio de los fragmentos de ADN producidos.
6. Las enzimas que reconocen cuatro bases suelen producir fragmentos de aproximadamente 250
pares de bases, útiles para análisis o manipulación de fragmentos génicos.
7. Las enzimas que reconocen seis o más bases pueden producir fragmentos más grandes, lo que
es útil para el análisis de regiones genéticas extensas o la construcción de mapas físicos y
tipificación molecular.
8. El uso de enzimas de restricción es fundamental en técnicas de biología molecular como la
clonación y la construcción de mapas genéticos.
PREPARACIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA CON
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Separación física de fragmentos de DNA de tamaño
diferente
1. La electroforesis en gel permite la separación de fragmentos de ADN según su
tamaño, con fragmentos más pequeños migrando más rápidamente a través del
gel.
2. La tasa de migración y el intervalo óptimo de tamaño para la separación
pueden ser determinados por la naturaleza química del gel y el grado de
formación de enlaces cruzados.
3. Los geles con alto grado de enlaces cruzados optimizan la separación de
fragmentos pequeños de ADN.
Separación física de fragmentos de DNA de tamaño
diferente
4. El colorante bromuro de etidio forma un complejo fluorescente con el ADN, lo que
permite la visualización de los fragmentos separados en el gel.
5. Los fragmentos específicos de ADN pueden ser identificados mediante sondas que
contienen secuencias complementarias.
6. La electroforesis en gel de campo pulsado permite la separación de fragmentos de
ADN de hasta 100 kbp en geles de poliacrilamida de alta resolución.
7. Esta técnica ha sido fundamental en la construcción de mapas físicos para los
cromosomas de diversas especies bacterianas y en la identificación de huellas
genéticas de aislados bacterianos relacionados con brotes epidémicos de
enfermedades infecciosas.
Clonación de fragmentos de
restricción de DNA
1. Muchas enzimas de restricción producen fragmentos de
ADN con extremos cohesivos que pueden hibridizarse con
otros fragmentos.
2. Estos fragmentos de ADN pueden ser utilizados como
donadores con un plásmido receptor para formar un
plásmido recombinante.
3. Por ejemplo, el desdoblamiento de ADN con la enzima
EcoR1 produce extremos cohesivos con secuencias AATT en
un extremo y su complemento TTAA en el otro extremo.
4. La eliminación enzimática de los grupos fosfato libres
asegura que los extremos cohesivos no se unan para formar
el plásmido circular original.
5. La ligadura en presencia de otros fragmentos de ADN que
contienen grupos fosfato libres genera plásmidos
recombinantes con fragmentos de ADN insertados.
Clonación de fragmentos de restricción de
DNA
6. Los plásmidos recombinantes, que contienen fragmentos de ADN insertados, deben ser circulares para
replicarse dentro de la bacteria hospedadora.
7. Los plásmidos recombinantes pueden ser introducidos en la bacteria hospedadora, como E. coli,
mediante transformación forzada o electroporación.
8. Las células transformadas pueden seleccionarse según factores de resistencia a fármacos codificados
por los genes de los plásmidos.
9. La población bacteriana resultante contiene una biblioteca de plásmidos recombinantes que portan
varios fragmentos de ADN insertados derivados del donador.
10. Las técnicas de hibridación pueden utilizarse para identificar colonias bacterianas portadoras de
fragmentos de ADN específicos, o las colonias pueden tamizarse para el producto génico si el plásmido
expresa el gen insertado.
MAPA DE RESTRICCION
1.Comprensión de la secuencia de ácidos nucleicos: La manipulación del ADN clonado
requiere comprender su secuencia de nucleótidos.
2.Mapa de restricción como paso inicial: La preparación de un mapa de restricción es la
primera etapa para obtener conocimiento sobre la secuencia de ADN.
MAPA DE RESTRICCION
3.Construcción del mapa de restricción: Se construye como un rompecabezas a partir de
fragmentos producidos por digestión con enzimas de restricción individuales.
4.Utilidad en la secuenciación de ADN: Los mapas de restricción son útiles como paso inicial hacia
la secuenciación de ADN porque identifican fragmentos que pueden someterse a un análisis más
riguroso, incluida la secuenciación.
5.Identificación de fragmentos asociados con funciones génicas: Los mapas de restricción
proporcionan información específica sobre las bases que permite asociar fragmentos de ADN,
identificados por tamaño, con funciones génicas específicas.
Secuenciación
1.Secuenciación de ADN y estructura génica: Permite a
los investigadores deducir la secuencia de aminoácidos
de los productos génicos, lo que facilita la comprensión y
la manipulación de los genes para alterar su función.
2.Análisis de secuencias de ADN: Revela regiones
reguladoras que controlan la expresión génica y "puntos
calientes" genéticos susceptibles a mutaciones. La
comparación de secuencias revela relaciones evolutivas
que ayudan en la clasificación de especies bacterianas.
3.Métodos de secuenciación: Se ha utilizado la técnica
de Maxam-Gilbert y el método de Sanger (terminación
dideoxi), siendo este último más ampliamente utilizado
debido a su simplicidad.
Secuenciación
4.Facilitación de la secuenciación por ingeniería genética: El uso del bacteriófago M13 de E. coli, que
contiene ADN monocatenario, facilita la secuenciación mediante la producción de DNA replicativo que
contiene secuencias insertadas.
5.Uso de oligonucleótidos y PCR: Los oligonucleótidos sintetizados químicamente pueden servir como
cebadores para la PCR, permitiendo la amplificación y secuenciación del ADN entre ellos sin necesidad de
clonación.
6.Secuenciación de genomas completos: La tecnología ha permitido la secuenciación y análisis de genomas
completos, desde virus hasta seres humanos, utilizando técnicas como el "escopetazo". Esto ha llevado al
estudio de la patogenia molecular y al desarrollo de vacunas y estrategias terapéuticas mejoradas.
ANÁLISIS CON DNA CLONADO: SONDAS DE
HIBRIDACIÓN
1.Utilidad de las sondas de hibridación: Se utilizan para la clonación de ADN y
la detección de colonias bacterianas que contienen genes clonados. También
se emplean para la detección de ARNm mediante ADN complementario (cADN)
y para analizar la síntesis de ARN por hibridación de ADN a ARN (método de
Northern).
2.Métodos de detección de sondas: Se utilizan técnicas como la transferencia
de Southern para detectar secuencias de ADN y la transferencia de Western
para detectar proteínas expresadas por los genes clonados.
3.Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP): Se emplean
sondas de oligonucleótidos para identificar regiones genéticas relacionadas
con enfermedades genéticas y en aplicaciones forenses.
ANÁLISIS CON DNA CLONADO: SONDAS DE
HIBRIDACIÓN
4.Diagnóstico de enfermedades y detección de patógenos: Las
sondas de ADN permiten la identificación rápida de microorganismos
difíciles de cultivar en muestras clínicas y la detección directa de
agentes patógenos en tejidos infectados.
5.Mejoras en los métodos de diagnóstico molecular: Se han
desarrollado tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos como
la PCR en tiempo real, que permite la detección y cuantificación de
amplicones en tiempo real, lo que acelera significativamente el
proceso de diagnóstico.
6.Consideraciones sobre el diseño de sondas: Las sondas pueden ser
fragmentos grandes de ADN clonado o oligonucleótidos más
pequeños. Las sondas grandes proporcionan precisión pero son más
lentas, mientras que las sondas pequeñas son más rápidas pero
menos sensibles a los cambios de una sola base. La amplificación de
regiones de interés mediante PCR seguida de detección con sondas
ha demostrado ser más sensible que los métodos de detección
directa.
1.Reacciones adversas públicas: Los avances científicos, especialmente en ingeniería genética, pueden generar
preocupación pública y reacciones adversas. Es importante considerar las posibles consecuencias y riesgos de
estos avances.
2.Contención de patógenos: Los laboratorios deben tomar precauciones especiales para contener los
microorganismos modificados genéticamente, especialmente los patógenos. Se deben separar los genes
relacionados con la función específica de los genes de replicación o toxicidad.
3.Beneficios y riesgos ambientales: Algunos microorganismos modificados genéticamente pueden ofrecer
beneficios sociales si se introducen en el medio ambiente. Sin embargo, también pueden plantear riesgos
potenciales para el medio ambiente y la salud humana.
.
Cepas recombinantes en
el medio ambiente
4.Ejemplo de bacterias Pseudomonas: Se menciona el ejemplo de cepas de Pseudomonas
modificadas genéticamente para producir proteínas que favorecen la formación de cristales de hielo.
Aunque pueden ser útiles en ciertos contextos, como para los dueños de estaciones de esquí,
también pueden causar daños a los cultivos, como la lechuga.
5.Protestas y controversias: La introducción de microorganismos modificados genéticamente en el
medio ambiente puede generar protestas y controversias. Los estudios de campo a menudo están
sujetos a procesos legales prolongados y costosos.
6Precedentes legales: Los precedentes legales establecidos a partir de casos de uso de
microorganismos modificados genéticamente pueden guiar futuras aplicaciones y ayudar a
determinar cuándo es justificada la precaución extrema.
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  • 2. INTRODUCCION • Introducción a la ciencia de la genética y su análisis de la herencia de funciones fisiológicas. • el gen es la unidad básica de herencia, compuesto de ADN que codifica información específica. • Método tradicional de la genética: identificación de genes según su contribución al fenotipo. • Experimento de Griffith en la década de 1930, sugiriendo la participación del ADN en la herencia. • Descubrimiento de Avery, MacLeod y McCarty que confirma al ADN como el agente transformador en la herencia.
  • 3. Desarrollo de la tecnología del ADN recombinante entre 1960 y 1970, revelando enzimas de restricción y plásmidos. La función de los plásmidos como elementos genéticos capaces de replicación independiente en bacterias y levaduras. El uso de enzimas de restricción para amplificar y manipular fragmentos de ADN. Aplicaciones de la tecnología del ADN recombinante en la ingeniería genética, tanto en células procariotas como eucariotas.Impacto significativo en el avance médico contemporáneo.
  • 4. 1.La información genética en bacterias se almacena en forma de secuencia de bases de ADN, que mayormente son bicatenarias con bases complementarias (A-T; G-C) unidas por puentes de hidrógeno. 2.Las dos cadenas de ADN tienen una orientación antiparalela: una es 5′→ 3′ y la otra es 3′→ 5′. 3.La complementariedad de las bases permite la replicación y transcripción del ADN, donde una cadena sirve como plantilla para la síntesis de ARN. 4.Las proteínas se unen al ADN para regular la expresión génica, principalmente en el surco principal. 5.El ADN se compone de nucleótidos, cada uno formado por una base (A, T, C, G) unida a una fosfo-2'-desoxirribosa. 6.La longitud del ADN se mide en pares de bases (kbp), siendo los genomas bacterianos mucho más grandes que los de los virus. 7.El ARN, generalmente monocatenario, utiliza la base uracilo (U) en lugar de timina (T) y puede formar estructuras compactas. 8.El ARN mensajero (ARNm) lleva la secuencia genética desde el ADN a los ribosomas para la síntesis de proteínas. 9.El ARN ribosómico (ARNr) y el ARN de transferencia (ARNt) son esenciales en la síntesis de proteínas, constituyendo la mayoría del ARN total en la célula. 10.Algunas moléculas de ARN actúan como enzimas (ribozimas), como el ARN 23S en la ÁCIDOS NUCLEICOS Y SU ORGANIZACIÓN EN GENOMAS EUCARIÓTICO, PROCARIÓTICO Y VIRAL
  • 5. GENOMA DE CELUAS EUCARIOTAS 1. El genoma es la totalidad de la información genética de un organismo, y en células eucariotas se transporta en cromosomas lineales dentro del núcleo. 2. Las células eucariotas diploides tienen dos homólogos de cada cromosoma, lo que puede compensar mutaciones y dificultar su detección. 3. Los genes pueden ser recesivos o dominantes dependiendo de su expresión fenotípica en presencia de su homólogo. 4. Las células haploides, como las de levadura, son útiles para estudiar mutaciones ya que tienen una sola copia de la mayoría de los genes. 5. Solo el 2% del genoma humano se considera codificante, el resto es DNA no codificante.
  • 6. 6. Las células eucariotas contienen mitocondrias y, en algunos casos, cloroplastos, cada uno con su propio ADN circular que contiene genes relacionados con la función del organelo. 7. Algunas levaduras tienen DNA adicional en forma de plásmidos, que son útiles en ingeniería genética debido a su manipulabilidad. 8. El DNA repetitivo se encuentra en grandes cantidades en células procariotas y eucariotas, principalmente en regiones no codificantes, y puede estar asociado con adaptación y variación genética. 9. Los intrones, secuencias de DNA que se eliminan en la traducción del mRNA, son comunes en genes eucariotas pero raros en eubacterias.
  • 7. GENOMA DE LAS CELULAS PROCARIOTAS 1. Los genes en bacterias generalmente se encuentran en cromosomas bacterianos, que son haploides, aunque algunas especies tienen dos cromosomas. 2. Los plásmidos, moléculas circulares de DNA, también contienen genes adicionales y pueden variar en tamaño desde varios hasta 100 kbp. 3. Las células procariotas no tienen un núcleo, por lo que los genes bacterianos no están separados del citoplasma. 4. Algunas bacterias patógenas tienen genes específicos, como las islas de patogenicidad, que codifican genes de virulencia y otros determinantes patógenos. 5. Los plásmidos pueden transportar genes de resistencia a antibióticos y otros genes que facilitan la movilización genética entre bacterias. 6. Los transposones son elementos genéticos que pueden moverse a diferentes loci genéticos, creando mutaciones de inserción. .
  • 8. GENOMA DE LAS CELULAS PROCARIOTAS 7. Los elementos de inserción son transposones cortos que solo transportan genes para enzimas necesarias para su propia transposición. 8. Los plásmidos y los cromosomas pueden transportar elementos IS, que son importantes para la formación de cepas recombinantes y la propagación de resistencia a antibióticos. 9. Los transposones dependen de su integración física con un replicón bacteriano para su propagación y suelen insertarse en regiones que codifican tRNA. 10. Los plásmidos pueden servir como vehículos para la diseminación de transposones entre la población bacteriana
  • 9. GENOMA VIRAL 1. Los virus dependen de una célula hospedadora para replicarse y sobrevivir. 2. La replicación viral requiere la energía metabólica y la maquinaria de síntesis de macromoléculas del hospedador. 3. Para la propagación exitosa de los virus se necesitan formas estables para la supervivencia fuera del hospedador, mecanismos de invasión celular, información genética para la replicación viral y para el empaquetamiento y liberación de nuevos virus. 4. Los bacteriófagos son virus que infectan bacterias y constituyen el mayor grupo de todos los virus, con más de 5000 aislamientos conocidos. 5. Los bacteriófagos pueden contener diferentes tipos de ácido nucleico, como DNA bicatenario, RNA bicatenario, ssRNA o DNA monocatenario.
  • 10. GENOMA VIRAL 6. Existen bacteriófagos líticos que destruyen la célula hospedadora para liberar nuevas partículas virales, y bacteriófagos moderados que pueden insertarse en el cromosoma de la bacteria hospedadora. 7. Los bacteriófagos pueden diferenciarse por su modo de propagación en líticos y moderados. 8. Los bacteriófagos filamentosos, como el bacteriófago M13 de E. coli, son excepcionales en su comportamiento y se utilizan en ingeniería de DNA. 9. Las topoisomerasas son enzimas esenciales para alterar el superenrollado del DNA y son el blanco de algunos antibióticos, como las quinolonas. 10. La replicación de DNA de plásmidos y la replicación de DNA bacteriano son procesos similares, con topoisomerasas esenciales en ambos casos.
  • 11. REPLICACION El dsDNA se sintetiza por replicación semiconservadora. Conforme la doble cadena original se desenrolla, cada cadena sirve como plantilla (es decir, como la fuente de información de la secuencia) para la replicación de DNA. Nuevas cadenas se sintetizan con la colocación de bases en orden complementario a las cadenas preexistentes. Cuando se ha completado la síntesis, cada molécula hija contiene una cadena original y una cadena de síntesis reciente
  • 12. ADN BACTERIANO 1. Los virus dependen de una célula hospedadora para replicarse y sobrevivir. 2. La replicación viral requiere la energía metabólica y la maquinaria de síntesis de macromoléculas del hospedador. 3. Para la propagación exitosa de los virus se necesitan formas estables para la supervivencia fuera del hospedador, mecanismos de invasión celular, información genética para la replicación viral y para el empaquetamiento y liberación de nuevos virus. 4. Los bacteriófagos son virus que infectan bacterias y constituyen el mayor grupo de todos los virus, con más de 5000 aislamientos conocidos. 5. Los bacteriófagos pueden contener diferentes tipos de ácido nucleico, como DNA bicatenario, RNA bicatenario, ssRNA o DNA monocatenario. 6. Existen bacteriófagos líticos que destruyen la célula hospedadora para liberar nuevas partículas virales, y bacteriófagos moderados que pueden insertarse en el cromosoma de la bacteria hospedadora.
  • 13. 7. Los bacteriófagos pueden diferenciarse por su modo de propagación en líticos y moderados. 8. Los bacteriófagos filamentosos, como el bacteriófago M13 de E. coli, son excepcionales en su comportamiento y se utilizan en ingeniería de DNA. 9. Las topoisomerasas son enzimas esenciales para alterar el superenrollado del DNA y son el blanco de algunos antibióticos, como las quinolonas. 10. La replicación de DNA de plásmidos y la replicación de DNA bacteriano son procesos similares, con topoisomerasas esenciales en ambos casos. ADN BACTERIANO
  • 14. 1. Los fagos muestran diversidad en su ácido nucleico y modos de replicación. 2. Los fagos líticos producen muchas copias de sí mismos durante un brote de crecimiento, mientras que los fagos moderados pueden establecerse como profagos o probacteriófagos. 3. La replicación del DNA de fagos líticos implica la formación de DNA circular a partir de extremos de cohesión y su posterior desdoblamiento para la formación de progenie viral. 4. Los fagos filamentosos convierten su ssDNA en una forma circular bicatenaria para su replicación. 5. Los fagos ssRNA, como el fago MS2, contienen genes que permiten su propia replicación, incluyendo la codificación de proteínas de cubierta y polimerasas de RNA. 6. Los profagos, formas latentes de fagos moderados, contienen genes para la replicación lítica, pero su expresión está reprimida mientras están en estado de profago. 7. La desrepresión de los profagos puede ser desencadenada por estímulos como la luz ultravioleta, lo que lleva a la replicación vegetativa y la liberación de nuevas partículas virales. 8. El cambio entre la lisogenia y el crecimiento de un fago vegetativo puede depender del estado fisiológico de la célula hospedadora. BACTERIOFAGOS
  • 15. TRANSFERENCIA DE ADN A pesar de la naturaleza haploide del genoma bacteriano, la distribución ubicua de diversas bacterias en el medio ambiente contribuye a una notable diversidad genética. El intercambio genético bacteriano implica la transferencia de fragmentos relativamente pequeños de genoma donador a una célula receptora, seguida de la recombinación genética.La recombinación genética bacteriana es diferente de la fusión de gametos en células eucariotas, ya que el proceso implica que el DNA donador se replique en el organismo receptor. La replicación del DNA donador puede lograrse mediante la integración en el cromosoma del receptor o como un episoma independiente.Estos mecanismos de intercambio genético contribuyen a la plasticidad genómica de las bacterias y a su capacidad de adaptarse a diferentes condiciones ambientales.
  • 16. RESTRICCION Y OTRAS LIMITANTES DE LA TRANSFERENCIA GENICA 1. Las enzimas de restricción (endonucleasas de restricción) permiten a las bacterias diferenciar entre su propio DNA y el DNA de otros organismos. 2. Estas enzimas cortan el DNA en sitios de restricción específicos que dependen de secuencias específicas de DNA. 3. Cada cepa bacteriana tiene un sistema de restricción que puede modificar los sitios de reconocimiento en su propio DNA mediante metilación o adición de residuos de citosina. 4. Los sistemas de modificación de restricción se dividen en dos grupos principales: tipo I, que combina actividades de restricción y modificación en una proteína con varias subunidades, y tipo II, que consta de endonucleasas y metilasas separadas. 5. La restricción biológica puede resultar en la separación del DNA donante antes de que pueda integrarse como parte de un replicón recombinante, lo que hace que la bacteria sea "inmune" al DNA de entrada.
  • 17. RESTRICCION Y OTRAS LIMITANTES DE LA TRANSFERENCIA GENICA 6. Algunos plásmidos tienen una especificidad de hospedador limitada y solo pueden replicarse en un grupo estrecho de bacterias, mientras que otros plásmidos, como los de resistencia a fármacos, pueden replicarse en una amplia variedad de géneros bacterianos. 7. En algunos casos, la coexistencia de dos o más plásmidos dentro de una bacteria puede interferir con la replicación o la partición, lo que lleva a la pérdida de uno de los plásmidos cuando la bacteria se divide. 8. Este fenómeno se conoce como incompatibilidad de plásmidos, donde dos plásmidos que no pueden coexistir de manera estable pertenecen al mismo grupo de incompatibilidad (Inc), mientras que dos plásmidos que pueden coexistir pertenecen a diferentes grupos Inc.
  • 18. MECANISMOS DE RECOMBINACION 1. El DNA donador que no puede replicarse por sí mismo debe combinarse con el DNA del receptor para establecerse en la cepa receptora. 2. La recombinación puede ser homóloga, que implica un intercambio entre secuencias de DNA similares entre el donador y el receptor, o no homóloga, que involucra la recombinación entre secuencias de DNA diferentes. 3. La recombinación homóloga generalmente implica el intercambio entre genes que comparten ancestros comunes y requiere un grupo de genes designados como rec.
  • 19. 4. La recombinación no homóloga depende de enzimas codificadas por el DNA integrado y se ilustra principalmente por la inserción de DNA en un receptor para formar una copia de un transposón donador. 5. El mecanismo de recombinación mediado por los productos génicos del gen rec es recíproco, lo que significa que la introducción de una secuencia donadora en un receptor corresponde con la transferencia de una secuencia receptora homóloga en el DNA donador. 6. La comunidad científica está prestando cada vez más atención a la conversión génica, que es la transferencia no recíproca de secuencias de DNA del donador al receptor, como un mecanismo importante en la adquisición de diversidad genética.
  • 20. 1. La composición del DNA en los microorganismos es altamente fluida, lo que permite la transferencia de DNA de un organismo a otro. 2. Este proceso se llama transferencia génica horizontal y es diferente de la herencia vertical, que implica la herencia de genes de los progenitores. 3. Los tres mecanismos principales de transferencia de DNA entre células son la conjugación, la transducción y la transformación. 4. En la conjugación, la célula donadora y receptora están en contacto directo, y se transfiere una sola cadena de DNA. 5. La transducción implica que el DNA del donador se transporta en un fago y luego se transfiere al receptor durante la infección por bacteriófagos. 6. La transformación implica la captación directa de DNA desnudo del donador por parte de la célula receptora, que puede ocurrir de forma natural o ser inducida en el laboratorio. 7. La transformación forzada, inducida en el laboratorio, es un proceso fundamental en la ingeniería genética, donde las bacterias se vuelven competentes para captar plásmidos extracelulares después de un tratamiento específico. MECANISMOS DE TRANSFERENCIA GENICA
  • 21. 1. Los plásmidos se transfieren frecuentemente por conjugación, donde los genes tra son responsables de proporcionar las funciones necesarias para la transferencia. 2. Los plásmidos autotransmisibles, que llevan los genes tra, pueden movilizar otros plásmidos o porciones del cromosoma para su transferencia. 3. El factor de fertilidad F+ en E. coli confiere características específicas al donador, como la capacidad de formar un puente con el receptor y transferir un plásmido a la célula receptora. 4. Los donadores con el factor de fertilidad F+ pueden integrarse en diversos locus cromosómicos, creando donadores con recombinación de alta frecuencia (Hfr). A)CONJUGACION
  • 22. A)CONJUGACION 5. La conjugación Hfr ha permitido el mapeo genético de E. coli y otras bacterias, midiendo la distancia entre los loci en minutos de transferencia durante la conjugación. 6. La integración del DNA cromosómico en un plásmido de conjugación puede producir un replicón recombinante (F o R) en el cual el DNA cromosómico integrado puede replicarse independientemente. 7. Los merodiploides, que son parcialmente diploides, pueden ser útiles para estudios de complementación genética, pero son genéticamente inestables debido a la recombinación entre plásmidos y cromosomas homólogos. 8. La genética microbiana convencional basada en la selección de plásmidos cebadores puede utilizarse para aislar genes de organismos de crecimiento lento para su estudio en E. coli u otras bacterias.
  • 23. B)TRANSDUCCION La transducción es un mecanismo de recombinación genética en bacterias facilitado por bacteriófagos, donde el ácido nucleico bacteriano se transporta dentro de la cápside de un fago. Las partículas de transducción contienen DNA bacteriano en lugar de DNA viral y pueden utilizarse para transferir genes de una bacteria a otra. Los fagos moderados son preferidos para la transducción porque la infección bajo condiciones que favorecen la lisogenia reduce la lisis celular, lo que aumenta la supervivencia de las cepas recombinantes. La presencia de un profago en la bacteria receptora puede proporcionar inmunidad celular y replicación, lo que hace que los fagos moderados sean útiles para la ingeniería genética. En la naturaleza, los fagos a menudo transportan islas de patogenicidad, como en el caso de V. cholerae, donde los fagos pueden transportar genes de toxinas y otros elementos virulentos que causan enfermedades como el cólera epidémico.
  • 24. C. Transformación 1. La transformación forzada, inicialmente concebida como un procedimiento de laboratorio, se ha demostrado que ocurre naturalmente y contribuye a la transferencia horizontal de genes (HGT) en bacterias. 2. La HGT de baja frecuencia se relaciona con mecanismos comunes de resistencia a los antibióticos en diversas especies bacterianas, impulsada por la complejidad y densidad de la flora intestinal y las biopelículas. 3. La administración terapéutica de antibióticos selecciona microorganismos resistentes, lo que, combinado con otros factores, crea condiciones propicias para la diseminación de material genético entre diferentes especies bacterianas.
  • 25. C. Transformación 4. La competencia natural para la transformación, donde las bacterias captan directamente el ADN del donador, es rara pero importante en ciertos géneros bacterianos como Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis y Streptococcus pneumoniae. 5. La transformación natural requiere proteínas específicas producidas por la célula receptora y secuencias de ADN captadoras específicas de especie para incorporar el ADN. 6. Las secuencias captadoras restringen el intercambio genético a una especie única, mientras que el ADN no incorporado puede degradarse y usarse como fuente de nutrientes. 7. La transformación genética es una fuerza importante en la evolución microbiana, contribuyendo a la diversidad genética y la adaptación de las bacterias a su entorno.
  • 26. MUTACIONES Y REORDENACION GENETICA Mutaciones espontáneas 1. Las mutaciones espontáneas para un gen dado en un entorno natural ocurren con una frecuencia de aproximadamente 10^-6 a 10^-8 en una población derivada de una sola bacteria. 2. Las mutaciones pueden incluir sustituciones de bases, deleciones, inserciones y reordenamientos, siendo las sustituciones de bases las más comunes. 3. Las sustituciones de bases pueden surgir durante la replicación debido a la colocación inapropiada de pares de bases entre bases complementarias. 4. Las enzimas de reparación de errores corrigen las sustituciones de bases y otras anomalías durante la replicación, asegurando la integridad del ADN. 5. La respuesta SOS es un sistema de reparación de ADN que se activa cuando el daño del ADN es extenso, permitiendo que la replicación continúe con errores en ciertas circunstancias.
  • 27. 6. Muchas mutaciones de sustitución de base no alteran significativamente la función de los productos génicos y pueden pasar desapercibidas a nivel fenotípico. 7. Las mutaciones interruptoras o finalizadoras interrumpen la síntesis de proteínas y pueden resultar en productos génicos inactivos. 8. Los reordenamientos genéticos pueden ocurrir debido a deleciones, duplicaciones o inversiones de segmentos de ADN, y pueden ser causados por recombinación entre secuencias repetidas directamente. 9. Los reordenamientos grandes, como las deleciones extensas, casi nunca se revierten y pueden alterar permanentemente el genoma bacteriano. 10. Las mutaciones de duplicación son comunes pero inestables y tienden a revertirse fácilmente. 11. Los reordenamientos genéticos pueden fijarse en poblaciones naturales de bacterias, lo que indica que la disposición lineal de los loci en el cromosoma no limita completamente las interacciones entre ellos.
  • 28. 1. La frecuencia de mutaciones se incrementa significativamente por la exposición a mutágenos, como la luz ultravioleta (UV) y mutágenos químicos. 2. La luz ultravioleta (UV) daña el ADN al formar dímeros de timina, lo que puede introducir errores de secuencia durante la reparación enzimática. 3. Los mutágenos químicos pueden alterar la estructura física o química del ADN, como el ácido nitroso (HNO2), que sustituye grupos hidroxilo por aminoácidos en las bases del ADN. 4. Los compuestos químicos reactivos pueden causar desplazamientos del marco de lectura, una mutación genética que resulta de inserciones o deleciones de un número de nucleótidos no divisible entre tres. 5. La exposición a colorantes acridínicos, como el naranja de acridina, facilita el deslizamiento del marco de lectura al intercalarse entre las bases del ADN. 6. El efecto directo de los mutágenos químicos o físicos es el daño al ADN, lo que puede llevar a mutaciones durante el proceso de replicación y escape de la reparación por enzimas. 7. Las mutaciones que afectan la actividad de replicación o las enzimas de reparación pueden hacer que las bacterias sean más susceptibles a los mutágenos biológicos y se conocen como cepas mutantes. Mutágenos
  • 29. La recuperación de la actividad perdida como resultado de una mutación se conoce como reversión fenotípica. La reversión fenotípica puede o no implicar el restablecimiento de la secuencia original de ADN, lo que sería necesario para una reversión genotípica.En muchos casos, una mutación en un segundo locus puede restablecer la actividad perdida, un fenómeno conocido como mutación de supresión. La supresión intragenética ocurre cuando una segunda mutación en un sitio diferente en los genes de la enzima restaura la estructura necesaria para la actividad enzimática. La supresión extragénica ocurre cuando una segunda mutación que se encuentra fuera del gen originalmente afectado restablece la actividad perdida. REVISION Y SUPRESION
  • 30. 1. A pesar de la notoria separación evolutiva entre células eucariotas y procariotas, comparten algunos mecanismos de expresión génica. 2. Ambos grupos almacenan información genética en el ADN, que se transcribe en ARN mensajero (ARNm) y luego se traduce en proteínas. 3. Durante la transcripción, la ARN polimerasa sintetiza una cadena de ARNm utilizando el ADN como plantilla. 4. Los aminoácidos se activan y se unen a moléculas adaptadoras específicas de ARN llamadas ARN de transferencia (ARNt), que tienen un anticodón complementario al codón del ARNm. 5. Durante la traducción, el ARNm y el ARNt se encuentran en los ribosomas, donde se ensambla la cadena de aminoácidos para formar una proteína. EXPRESION GENICA
  • 31. EXPRESION GENICA 6. En las células procariotas, los genes suelen estar agrupados en operones, y la transcripción y la traducción están acopladas, permitiendo una rápida respuesta a los cambios ambientales. 7. En las células eucariotas, los genes raramente están agrupados, y la transcripción y la traducción están desacopladas. Además, los genes eucariotas contienen intrones que deben eliminarse durante el procesamiento del ARN. 8. Los ribosomas eucariotas y procariotas difieren en tamaño y composición, y los ribosomas procariotas son más susceptibles a ciertos antibióticos que los ribosomas eucariotas. 9. Los ribosomas de las mitocondrias en las células eucariotas se asemejan a los de las células procariotas y pueden ser sensibles a ciertos antibióticos.
  • 32. Regulación de la expresión génica en células procariotas 1. Las proteínas específicas, productos de genes reguladores, controlan la expresión de genes estructurales codificantes de enzimas. 2. La transcripción del ADN a ARNm comienza en el promotor, una secuencia de ADN que se une a la ARN polimerasa. 3. El nivel de expresión génica depende de la capacidad del promotor para unirse a la polimerasa y la eficacia intrínseca de los promotores varía ampliamente. 4. Las proteínas reguladoras adicionales pueden unirse a regiones de ADN cercanas a los promotores para ejercer control adicional sobre la expresión génica. 5. Muchos genes estructurales procarióticos están agrupados en operones, como el operón trp de E. coli, que codifica para la biosíntesis de triptófano.
  • 33. Regulación de la expresión génica en células procariotas 6. La expresión del operón trp está regulada por mecanismos de represión y atenuación. La represión ocurre cuando una proteína represora se une al operador, mientras que la atenuación controla la eficiencia de la transcripción después de su inicio. 7. El operón lac también está regulado, pero de manera positiva en respuesta a la presencia de alolactosa, un metabolito de la lactosa. 8. La proteína transportadora de AMP cíclico (CAP) ejerce control positivo sobre la expresión del operón lac al aumentar la actividad de la ARN polimerasa. 9. Otros nucleótidos, como el ppGpp, también pueden influir en la expresión génica en E. coli, por ejemplo, en respuesta a la ausencia de aminoácidos o al daño del ADN.
  • 34. INGENIERIA GENETICA 1. La bioingeniería basada en la genética bacteriana ha transformado la biología en los últimos 40 años. 2. Es posible aislar fragmentos específicos de ADN y amplificarlos, y sus genes pueden expresarse en concentraciones elevadas. 3. La especificidad de los nucleótidos permite el desdoblamiento de las enzimas de restricción, lo que permite unir fragmentos de genes a plásmidos (vectores) que se utilizan para transformar células bacterianas. 4. Las colonias bacterianas o clonas pueden portar genes específicos que se pueden identificar mediante hibridación de ADN o ARN con sondas marcadas.
  • 35. 5. Los productos proteínicos codificados por los genes pueden identificarse por actividad enzimática o técnicas inmunológicas. 6. Las técnicas de ingeniería genética permiten aislar prácticamente cualquier gen para estudiar o explotar sus propiedades bioquímicas identificables. 7. Los genes aislados pueden utilizarse para mutagénesis de sitio dirigido, alterando secuencias de ADN específicas. 8. Las técnicas de hibridación permiten usar el ADN como sonda para detectar secuencias complementarias de ácidos nucleicos. 9. Los productos proteínicos de genes virales aislados ofrecen promesa como vacunas. 10. Proteínas útiles, como la insulina, pueden producirse en grandes cantidades a partir de bacterias que expresan genes clonados. INGENIERIA GENETICA
  • 36. 1. Las bacterias muestran una amplia diversidad genética reflejada en su variedad de enzimas de restricción, las cuales tienen una notable selectividad para identificar regiones específicas de ADN para su corte. 2. Las secuencias de ADN reconocidas por enzimas de restricción son predominantemente palíndromos, con repeticiones invertidas. 3. Por ejemplo, la enzima EcoR1 reconoce la secuencia palindrómica GAATTC, que se refleja como AAG en la cadena opuesta. PREPARACIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
  • 37. 4. La longitud de los fragmentos de ADN producidos por enzimas de restricción varía según la secuencia de ADN específica reconocida por cada enzima. 5. Las enzimas de restricción pueden reconocer cuatro, seis, ocho, o incluso más secuencias de bases, lo que afecta la longitud promedio de los fragmentos de ADN producidos. 6. Las enzimas que reconocen cuatro bases suelen producir fragmentos de aproximadamente 250 pares de bases, útiles para análisis o manipulación de fragmentos génicos. 7. Las enzimas que reconocen seis o más bases pueden producir fragmentos más grandes, lo que es útil para el análisis de regiones genéticas extensas o la construcción de mapas físicos y tipificación molecular. 8. El uso de enzimas de restricción es fundamental en técnicas de biología molecular como la clonación y la construcción de mapas genéticos. PREPARACIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
  • 38. Separación física de fragmentos de DNA de tamaño diferente 1. La electroforesis en gel permite la separación de fragmentos de ADN según su tamaño, con fragmentos más pequeños migrando más rápidamente a través del gel. 2. La tasa de migración y el intervalo óptimo de tamaño para la separación pueden ser determinados por la naturaleza química del gel y el grado de formación de enlaces cruzados. 3. Los geles con alto grado de enlaces cruzados optimizan la separación de fragmentos pequeños de ADN.
  • 39. Separación física de fragmentos de DNA de tamaño diferente 4. El colorante bromuro de etidio forma un complejo fluorescente con el ADN, lo que permite la visualización de los fragmentos separados en el gel. 5. Los fragmentos específicos de ADN pueden ser identificados mediante sondas que contienen secuencias complementarias. 6. La electroforesis en gel de campo pulsado permite la separación de fragmentos de ADN de hasta 100 kbp en geles de poliacrilamida de alta resolución. 7. Esta técnica ha sido fundamental en la construcción de mapas físicos para los cromosomas de diversas especies bacterianas y en la identificación de huellas genéticas de aislados bacterianos relacionados con brotes epidémicos de enfermedades infecciosas.
  • 40. Clonación de fragmentos de restricción de DNA 1. Muchas enzimas de restricción producen fragmentos de ADN con extremos cohesivos que pueden hibridizarse con otros fragmentos. 2. Estos fragmentos de ADN pueden ser utilizados como donadores con un plásmido receptor para formar un plásmido recombinante. 3. Por ejemplo, el desdoblamiento de ADN con la enzima EcoR1 produce extremos cohesivos con secuencias AATT en un extremo y su complemento TTAA en el otro extremo. 4. La eliminación enzimática de los grupos fosfato libres asegura que los extremos cohesivos no se unan para formar el plásmido circular original. 5. La ligadura en presencia de otros fragmentos de ADN que contienen grupos fosfato libres genera plásmidos recombinantes con fragmentos de ADN insertados.
  • 41. Clonación de fragmentos de restricción de DNA 6. Los plásmidos recombinantes, que contienen fragmentos de ADN insertados, deben ser circulares para replicarse dentro de la bacteria hospedadora. 7. Los plásmidos recombinantes pueden ser introducidos en la bacteria hospedadora, como E. coli, mediante transformación forzada o electroporación. 8. Las células transformadas pueden seleccionarse según factores de resistencia a fármacos codificados por los genes de los plásmidos. 9. La población bacteriana resultante contiene una biblioteca de plásmidos recombinantes que portan varios fragmentos de ADN insertados derivados del donador. 10. Las técnicas de hibridación pueden utilizarse para identificar colonias bacterianas portadoras de fragmentos de ADN específicos, o las colonias pueden tamizarse para el producto génico si el plásmido expresa el gen insertado.
  • 42. MAPA DE RESTRICCION 1.Comprensión de la secuencia de ácidos nucleicos: La manipulación del ADN clonado requiere comprender su secuencia de nucleótidos. 2.Mapa de restricción como paso inicial: La preparación de un mapa de restricción es la primera etapa para obtener conocimiento sobre la secuencia de ADN.
  • 43. MAPA DE RESTRICCION 3.Construcción del mapa de restricción: Se construye como un rompecabezas a partir de fragmentos producidos por digestión con enzimas de restricción individuales. 4.Utilidad en la secuenciación de ADN: Los mapas de restricción son útiles como paso inicial hacia la secuenciación de ADN porque identifican fragmentos que pueden someterse a un análisis más riguroso, incluida la secuenciación. 5.Identificación de fragmentos asociados con funciones génicas: Los mapas de restricción proporcionan información específica sobre las bases que permite asociar fragmentos de ADN, identificados por tamaño, con funciones génicas específicas.
  • 44. Secuenciación 1.Secuenciación de ADN y estructura génica: Permite a los investigadores deducir la secuencia de aminoácidos de los productos génicos, lo que facilita la comprensión y la manipulación de los genes para alterar su función. 2.Análisis de secuencias de ADN: Revela regiones reguladoras que controlan la expresión génica y "puntos calientes" genéticos susceptibles a mutaciones. La comparación de secuencias revela relaciones evolutivas que ayudan en la clasificación de especies bacterianas. 3.Métodos de secuenciación: Se ha utilizado la técnica de Maxam-Gilbert y el método de Sanger (terminación dideoxi), siendo este último más ampliamente utilizado debido a su simplicidad.
  • 45. Secuenciación 4.Facilitación de la secuenciación por ingeniería genética: El uso del bacteriófago M13 de E. coli, que contiene ADN monocatenario, facilita la secuenciación mediante la producción de DNA replicativo que contiene secuencias insertadas. 5.Uso de oligonucleótidos y PCR: Los oligonucleótidos sintetizados químicamente pueden servir como cebadores para la PCR, permitiendo la amplificación y secuenciación del ADN entre ellos sin necesidad de clonación. 6.Secuenciación de genomas completos: La tecnología ha permitido la secuenciación y análisis de genomas completos, desde virus hasta seres humanos, utilizando técnicas como el "escopetazo". Esto ha llevado al estudio de la patogenia molecular y al desarrollo de vacunas y estrategias terapéuticas mejoradas.
  • 46. ANÁLISIS CON DNA CLONADO: SONDAS DE HIBRIDACIÓN 1.Utilidad de las sondas de hibridación: Se utilizan para la clonación de ADN y la detección de colonias bacterianas que contienen genes clonados. También se emplean para la detección de ARNm mediante ADN complementario (cADN) y para analizar la síntesis de ARN por hibridación de ADN a ARN (método de Northern). 2.Métodos de detección de sondas: Se utilizan técnicas como la transferencia de Southern para detectar secuencias de ADN y la transferencia de Western para detectar proteínas expresadas por los genes clonados. 3.Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP): Se emplean sondas de oligonucleótidos para identificar regiones genéticas relacionadas con enfermedades genéticas y en aplicaciones forenses.
  • 47. ANÁLISIS CON DNA CLONADO: SONDAS DE HIBRIDACIÓN 4.Diagnóstico de enfermedades y detección de patógenos: Las sondas de ADN permiten la identificación rápida de microorganismos difíciles de cultivar en muestras clínicas y la detección directa de agentes patógenos en tejidos infectados. 5.Mejoras en los métodos de diagnóstico molecular: Se han desarrollado tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos como la PCR en tiempo real, que permite la detección y cuantificación de amplicones en tiempo real, lo que acelera significativamente el proceso de diagnóstico. 6.Consideraciones sobre el diseño de sondas: Las sondas pueden ser fragmentos grandes de ADN clonado o oligonucleótidos más pequeños. Las sondas grandes proporcionan precisión pero son más lentas, mientras que las sondas pequeñas son más rápidas pero menos sensibles a los cambios de una sola base. La amplificación de regiones de interés mediante PCR seguida de detección con sondas ha demostrado ser más sensible que los métodos de detección directa.
  • 48. 1.Reacciones adversas públicas: Los avances científicos, especialmente en ingeniería genética, pueden generar preocupación pública y reacciones adversas. Es importante considerar las posibles consecuencias y riesgos de estos avances. 2.Contención de patógenos: Los laboratorios deben tomar precauciones especiales para contener los microorganismos modificados genéticamente, especialmente los patógenos. Se deben separar los genes relacionados con la función específica de los genes de replicación o toxicidad. 3.Beneficios y riesgos ambientales: Algunos microorganismos modificados genéticamente pueden ofrecer beneficios sociales si se introducen en el medio ambiente. Sin embargo, también pueden plantear riesgos potenciales para el medio ambiente y la salud humana. . Cepas recombinantes en el medio ambiente
  • 49. 4.Ejemplo de bacterias Pseudomonas: Se menciona el ejemplo de cepas de Pseudomonas modificadas genéticamente para producir proteínas que favorecen la formación de cristales de hielo. Aunque pueden ser útiles en ciertos contextos, como para los dueños de estaciones de esquí, también pueden causar daños a los cultivos, como la lechuga. 5.Protestas y controversias: La introducción de microorganismos modificados genéticamente en el medio ambiente puede generar protestas y controversias. Los estudios de campo a menudo están sujetos a procesos legales prolongados y costosos. 6Precedentes legales: Los precedentes legales establecidos a partir de casos de uso de microorganismos modificados genéticamente pueden guiar futuras aplicaciones y ayudar a determinar cuándo es justificada la precaución extrema.