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Ricardo Benítez, Albert Ibarz ,
Jordi Pagan
• En los hidrolizados de proteína se potencian diversas
características funcionales, tales como viscosidad
baja, mayor capacidad de agitación, dispersión y alta
solubilidad, que les conceden ventajas para el uso en
muchos productos alimenticios, respecto a las
proteínas originales.
• Una de las aplicaciones más importantes de los
hidrolizados de proteínas es su utilización como fuente
de nitrógeno en la formulación de dietas enterales con
destino a la alimentación infantil y/o de adultos
enfermos.
Las características que deben cumplir estos hidrolizados
de proteínas para formar parte de una dieta enteral
son:
• No producir desequilibrios osmóticos ni alergias,
Los hidrolizados que se producen para su
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• Obtener la proteína purificada o sustrato purificado
• Separar la proteína de lípidos y carbohidratos
La hidrólisis proteica se realiza normalmente en un reactor, con
control de agitación
• pH,
• temperatura y
• tiempo del proceso
El sustrato se disuelve o re suspende en agua hasta que el
pH y la temperatura se estabilizan; a continuación se
agrega la proteasa dando inicio a la hidrólisis. En los casos
de hidrólisis enzimática el pH debe ser mantenido en el
óptimo de la enzima mediante la adición de base diluida.
Para finalizar la hidrólisis proteica la enzima puede ser
inactivada con calor, mediante una disminución del pH o
con una combinación de ambos. O también puede ser
retirada del medio mediante filtración y la proteína
finalmente precipitada.
Para la obtención de los hidrolizados proteicos puede ser de origen
animal, vegetal o bacteriano.
Entre los vegetales, los más usados son las proteínas de soja, trigo y
arroz. De los sustratos de origen animal se emplea el pescado.
También se han aprovechado las proteínas de residuos cárnicos como
tendones o huesos y de microorganismos, como algas. Para la
elección de una fuente proteínica adecuada debe tenerse en cuenta el
uso que vaya a tener el hidrolizado, así como el valor agregado del
producto final con respecto al sustrato inicial. Por ejemplo, para la
obtención de hidrolizados con propiedades gelificantes y
emulsificantes se suelen emplear colágeno y gelatina por su capacidad
para formar geles transparentes.
Como fuente de fermentación para el crecimiento de microorganismos,
se emplean los hidrolizados de levaduras o caseína: éstas también son
las fuentes cuando los hidrolizados se usan en cosmética.
• Estas proteasas pueden ser clasificadas, por su origen,
(animal, vegetal, bacteriano o fúngico), por su modo de
acción catalítica (endo- o exo-actividad) o con base en
su sitio catalítico. Las endoproteasas hidrolizan enlaces
amídicos dentro de la cadena de la proteína. Las
exoproteasas, por el contrario, eliminan aminoácidos
terminales de las proteínas o péptidos.
• La hidrólisis proteolítica no se desarrolla en una sola reacción. Se
trata de un conjunto de reacciones simultáneas de ruptura de
enlaces, con distintas especies cargadas en equilibrio, lo que da una
gran complejidad a este tipo de procesos.
• En el caso de proteínas globulares, la mayoría de los enlaces
peptídicos están localizados en el interior de la proteína y no son
accesibles para la enzima, por esto, se considera que para proteínas
globulares es necesario efectuar la desnaturalización de la proteína
antes de proceder a hidrolizarla, ya que después de la
desnaturalización estarán expuestos más enlaces peptídicos.
• HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS
• La hidrólisis proteica se realiza normalmente en un
reactor, con control de agitación, pH, temperatura y
tiempo del proceso. El sustrato se disuelve o resuspende
en agua hasta que el pH y la temperatura se establizan;
a continuación se agrega la proteasa dando inicio a la
hidrólisis. A medida que ésta progresa se produce una
disminución del pH debido a la rotura de los enlaces
peptídicos. En los casos de hidrólisis enzimática el pH
debe ser mantenido en el óptimo de la enzima mediante
la adición de base diluida. Para finalizar la hidrólisis
proteica la enzima puede ser inactivada con calor,
mediante una disminución del pH o con una combinación
de ambos.
Debido a la hidrólisis, las propiedades moleculares de las proteínas
cambian, produciéndose la disminución del peso molecular, el
aumento de la carga y la liberación de grupos hidrofóbicos, entre
otros fenómenos. Estos cambios moleculares pueden ser detectados
con varios métodos analíticos, los cuales reflejan una o varias
propiedades fisicoquímicas de las moléculas . Como resultado de los
cambios moleculares, las propiedades funcionales de las proteínas
se ven afectadas. Aunque el término propiedad funcional con
frecuencia se aplica solamente para indicar propiedades tecno-
funcionales de los hidrolizados, esto debería también abarcar
propiedades bio-funcionales, las cuales pueden ser subdivididas en
nutricionales y fisiológicas o funcionalidad biológica.
Determinación de la actividad
enzimática
• Método de Anson, En este método, se hidroliza hemoglobina
desnaturalizada con la proteasa deseada a pH 7.5, temperatura de
25 °C durante 10 min. La hemoglobina que no se hidrolizó se
precipita con ácido tricloroacético (TCA) y al sobrenadante, después
de filtrado, se le añade reactivo fenólico de Folin-Ciocalteu que
produce una coloración azul con tirosina, triptófano y en menor
grado con cistina, cisteína e histidina. La absorbancia se mide a 750
nm.
• Grado de Hidrólisis:
• El grado de hidrólisis es el parámetro clave para el seguimiento y
control de las reacciones de hidrólisis de proteínas. Representa la
proporción de enlaces peptídicos hidrolizados sobre el número total
de enlaces.
Determinación de los grupos α-amino
libres
• La cantidad de grupos α-amino liberados puede ser medida usando
reactivos que reaccionen específicamente con grupos amino,
produciendo derivados que pueden ser detectados
espectrofotométricamente.
• Para ello puede utilizarse la valoración con formol aunque el gran
número de interferencias que presenta este método lo desaconsejan
en el caso de los hidrolizados de proteínas pueden ser detectados
espectrofotométricamente.
Determinación de nitrógeno soluble
• En este caso las técnicas más usuales son el método Kjeldhal, la
reacción de
Biuret o la determinación espectrofotométrica en la región UV de
péptidos con grupos aromáticos.
Determinación de los protones liberados
mediante potenciometría
• El método sólo es aplicable a la hidrólisis enzimática de proteínas a
pH neutro, alcalino o fuertemente ácido (pH≤3) y puede ser realizado
de forma sencilla y precisa.
Determinación de la distribución aparente
de peso molecular
• La distribución de tamaños de los péptidos de un hidrolizado puede ser
útil para predecir la capacidad antigénica del mismo, así como para
mostrar diferencias en la actuación de distintos pretratamientos del
sustrato o enzimas utilizadas. Normalmente se utilizan métodos
cromatográficos o electroforéticos para este fin.
Separación e identificación de péptidos
y aminoácidos
Una correcta separación e identificación de los péptidos de
un hidrolizado de proteínas complementaría la
información dada por la determinación del grado de
hidrólisis y la distribución en pesos moleculares, y
ayudaría a un mejor conocimiento de la composición del
producto.
Lemieux y Amiot: evaluaron las distintas técnicas empleadas para la
separación de péptidos, concluyendo que la cromatografía líquida de
exclusión, SE-HPLC, es la técnica que mayor información aporta
sobre la composición del hidrolizado, ya que es el volumen
molecular el criterio de separación empleado, y no el estado de
ionización, la carga o la hidrofobicidad de los péptidos como en otras
técnicas, que no obstante pueden ser complementarias.
PROPIEDADES TECNO-FUNCIONALES
• Los cambios de las características moleculares que ocurren durante la
hidrólisis de la proteína pueden dar lugar al comportamiento tecno-
funcional modificado del hidrolizado cuando se lo compara con la
proteína intacta, por ejemplo solubilidad alterada, viscosidad,
características sensoriales, emulsión y características de la espuma.
• SOLUBILIDAD
• En el punto isoeléctrico (pI) de la proteína, la solubilidad
generalmente aumenta con la hidrólisis, ya que es principalmente el
resultado de la reducción en peso molecular y del aumento en el
número de grupos polares.
• El efecto de la hidrólisis sobre la solubilidad a otros valores de pH
depende de la proteína estudiada. Los caseinatos por ejemplo, son
muy solubles en los valores de pH sobre y debajo del pI .
• Un efecto secundario negativo importante de la hidrólisis de la proteína
es la liberación de los péptidos generalmente con sabor más amargo
que la proteína nativa . Se ha demostrado que el sabor amargo de los
péptidos puros, a pesar de depender de la fuente de proteína y de la
especificidad de la enzima, está relacionado con la presencia y posición
de aminoácidos hidrofóbicos en los péptidos del hidrolizado.
• EMULSIONES Y ESPUMA
• Las características de la emulsión y de formación de espuma de la
proteína y de los hidrolizados de la proteína dependen del pH del
sistema y de la enzima empleada para la hidrólisis.
• Dentro de las técnicas, se determinan el índice de actividad de la
emulsión (EAI) que mide la turbiedad de las emulsiones con cierta
fracción de aceite, mientras que la capacidad de emulsionar (EC)
determina la cantidad de aceite que se puede dispersar por cierta
cantidad de proteína o de hidrolizado.
• La hidrólisis de proteínas resulta un método muy útil sobre
todo en la industria alimentaria.
• Los productos de la misma se clasifican para su uso según
su grado de hidrólisis, los de bajo grado(1-10%) para
mejorar propiedades funcionales, los de grado variable
como saborizantes y los hidrolizados extensivos(mayor a
10%) para alimentación especializada.
• La cromatografía de exclusión por tamaño se utiliza para
comparar la acción hidrolitica de varias proteasas o
caracterizar hidrolizados hipoalergenicos. Es la técnica que
da mas información sobre la composición del hidrolizado.
• La cromatografía de fase reversa detalla la complejidad
de los hidrolizados.
• Seria importante el desarrollo de nuevas técnicas
capaces de separar y cuantificar péptidos de pesos
moleculares inferiores a 1000 Da, especialmente si el
hidrolizado se va usar en formulación de dietas
enterales, ya que las técnicas mencionadas en el trabajo
son inespecíficas para péptidos de bajo peso
molecular(menor a 1000 Da).
• Actualmente para la identificación, el método mas
utilizado es la espectrometría de masas, a través de la
cual identificamos péptidos y aminoácidos.
• La hidrólisis enzimática de proteínas es un método
actualmente muy utilizado en la tecnología alimentaria,
debido a que los productos presentan propiedades
nutricionales y funcionales (viscosidad baja, mayor
capacidad de agitación, dispersión y alta solubilidad)
muy útiles en el área. En otras palabras, por hidrólisis las
propiedades moleculares de la proteína nativa cambian,
disminuye el peso molecular, aumenta la carga y se
liberan grupos hidrofóbicos. Además, aumenta la
digestibilidad y disminuye la alergenicidad.
• La composición final del producto de la hidrólisis
depende de la fuente proteica, la proteasa utilizada,
condiciones y grado de hidrólisis alcanzado en la
reacción (este ultimo será determinante para fijar su
posible uso).
• El grado de hidrólisis es el % de enlaces peptidicos rotos
en relación a la proteína nativa. Depende de: [sustrato],
relación enzima/sustrato, temperatura de incubación, pH,
temperatura y naturaleza de la enzima.
• Básicamente la hidrólisis sigue este esquema: Enzima-
Sustrato, Rotura de enlace amídico y por ultimo,
liberación del péptido.
• La separación de péptidos y aminoácidos se realiza a
través de diversos métodos cromatograficos y
finalmente, la identificación se logra por espectrometría
de masas, cromatografía de gases, análisis de la
secuencia o determinación de aminoácidos.
 hidrolizados de proteinas procesos y aplicaciones

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hidrolizados de proteinas procesos y aplicaciones

  • 1. Ricardo Benítez, Albert Ibarz , Jordi Pagan
  • 2. • En los hidrolizados de proteína se potencian diversas características funcionales, tales como viscosidad baja, mayor capacidad de agitación, dispersión y alta solubilidad, que les conceden ventajas para el uso en muchos productos alimenticios, respecto a las proteínas originales. • Una de las aplicaciones más importantes de los hidrolizados de proteínas es su utilización como fuente de nitrógeno en la formulación de dietas enterales con destino a la alimentación infantil y/o de adultos enfermos. Las características que deben cumplir estos hidrolizados de proteínas para formar parte de una dieta enteral son: • No producir desequilibrios osmóticos ni alergias,
  • 3. Los hidrolizados que se producen para su uso en alimentación Se pueden agrupar en: Hidrolizados con bajo grado de hidrólisis Hidrolizados con grados de hidrólisis variable para su uso como saborizantes Hidrolizados extensivos
  • 4. • Obtener la proteína purificada o sustrato purificado • Separar la proteína de lípidos y carbohidratos
  • 5. La hidrólisis proteica se realiza normalmente en un reactor, con control de agitación • pH, • temperatura y • tiempo del proceso El sustrato se disuelve o re suspende en agua hasta que el pH y la temperatura se estabilizan; a continuación se agrega la proteasa dando inicio a la hidrólisis. En los casos de hidrólisis enzimática el pH debe ser mantenido en el óptimo de la enzima mediante la adición de base diluida. Para finalizar la hidrólisis proteica la enzima puede ser inactivada con calor, mediante una disminución del pH o con una combinación de ambos. O también puede ser retirada del medio mediante filtración y la proteína finalmente precipitada.
  • 6. Para la obtención de los hidrolizados proteicos puede ser de origen animal, vegetal o bacteriano. Entre los vegetales, los más usados son las proteínas de soja, trigo y arroz. De los sustratos de origen animal se emplea el pescado. También se han aprovechado las proteínas de residuos cárnicos como tendones o huesos y de microorganismos, como algas. Para la elección de una fuente proteínica adecuada debe tenerse en cuenta el uso que vaya a tener el hidrolizado, así como el valor agregado del producto final con respecto al sustrato inicial. Por ejemplo, para la obtención de hidrolizados con propiedades gelificantes y emulsificantes se suelen emplear colágeno y gelatina por su capacidad para formar geles transparentes. Como fuente de fermentación para el crecimiento de microorganismos, se emplean los hidrolizados de levaduras o caseína: éstas también son las fuentes cuando los hidrolizados se usan en cosmética.
  • 7. • Estas proteasas pueden ser clasificadas, por su origen, (animal, vegetal, bacteriano o fúngico), por su modo de acción catalítica (endo- o exo-actividad) o con base en su sitio catalítico. Las endoproteasas hidrolizan enlaces amídicos dentro de la cadena de la proteína. Las exoproteasas, por el contrario, eliminan aminoácidos terminales de las proteínas o péptidos.
  • 8. • La hidrólisis proteolítica no se desarrolla en una sola reacción. Se trata de un conjunto de reacciones simultáneas de ruptura de enlaces, con distintas especies cargadas en equilibrio, lo que da una gran complejidad a este tipo de procesos.
  • 9. • En el caso de proteínas globulares, la mayoría de los enlaces peptídicos están localizados en el interior de la proteína y no son accesibles para la enzima, por esto, se considera que para proteínas globulares es necesario efectuar la desnaturalización de la proteína antes de proceder a hidrolizarla, ya que después de la desnaturalización estarán expuestos más enlaces peptídicos.
  • 10. • HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS • La hidrólisis proteica se realiza normalmente en un reactor, con control de agitación, pH, temperatura y tiempo del proceso. El sustrato se disuelve o resuspende en agua hasta que el pH y la temperatura se establizan; a continuación se agrega la proteasa dando inicio a la hidrólisis. A medida que ésta progresa se produce una disminución del pH debido a la rotura de los enlaces peptídicos. En los casos de hidrólisis enzimática el pH debe ser mantenido en el óptimo de la enzima mediante la adición de base diluida. Para finalizar la hidrólisis proteica la enzima puede ser inactivada con calor, mediante una disminución del pH o con una combinación de ambos.
  • 11. Debido a la hidrólisis, las propiedades moleculares de las proteínas cambian, produciéndose la disminución del peso molecular, el aumento de la carga y la liberación de grupos hidrofóbicos, entre otros fenómenos. Estos cambios moleculares pueden ser detectados con varios métodos analíticos, los cuales reflejan una o varias propiedades fisicoquímicas de las moléculas . Como resultado de los cambios moleculares, las propiedades funcionales de las proteínas se ven afectadas. Aunque el término propiedad funcional con frecuencia se aplica solamente para indicar propiedades tecno- funcionales de los hidrolizados, esto debería también abarcar propiedades bio-funcionales, las cuales pueden ser subdivididas en nutricionales y fisiológicas o funcionalidad biológica.
  • 12. Determinación de la actividad enzimática • Método de Anson, En este método, se hidroliza hemoglobina desnaturalizada con la proteasa deseada a pH 7.5, temperatura de 25 °C durante 10 min. La hemoglobina que no se hidrolizó se precipita con ácido tricloroacético (TCA) y al sobrenadante, después de filtrado, se le añade reactivo fenólico de Folin-Ciocalteu que produce una coloración azul con tirosina, triptófano y en menor grado con cistina, cisteína e histidina. La absorbancia se mide a 750 nm. • Grado de Hidrólisis: • El grado de hidrólisis es el parámetro clave para el seguimiento y control de las reacciones de hidrólisis de proteínas. Representa la proporción de enlaces peptídicos hidrolizados sobre el número total de enlaces.
  • 13. Determinación de los grupos α-amino libres • La cantidad de grupos α-amino liberados puede ser medida usando reactivos que reaccionen específicamente con grupos amino, produciendo derivados que pueden ser detectados espectrofotométricamente. • Para ello puede utilizarse la valoración con formol aunque el gran número de interferencias que presenta este método lo desaconsejan en el caso de los hidrolizados de proteínas pueden ser detectados espectrofotométricamente.
  • 14. Determinación de nitrógeno soluble • En este caso las técnicas más usuales son el método Kjeldhal, la reacción de Biuret o la determinación espectrofotométrica en la región UV de péptidos con grupos aromáticos. Determinación de los protones liberados mediante potenciometría • El método sólo es aplicable a la hidrólisis enzimática de proteínas a pH neutro, alcalino o fuertemente ácido (pH≤3) y puede ser realizado de forma sencilla y precisa. Determinación de la distribución aparente de peso molecular • La distribución de tamaños de los péptidos de un hidrolizado puede ser útil para predecir la capacidad antigénica del mismo, así como para mostrar diferencias en la actuación de distintos pretratamientos del sustrato o enzimas utilizadas. Normalmente se utilizan métodos cromatográficos o electroforéticos para este fin.
  • 15. Separación e identificación de péptidos y aminoácidos Una correcta separación e identificación de los péptidos de un hidrolizado de proteínas complementaría la información dada por la determinación del grado de hidrólisis y la distribución en pesos moleculares, y ayudaría a un mejor conocimiento de la composición del producto. Lemieux y Amiot: evaluaron las distintas técnicas empleadas para la separación de péptidos, concluyendo que la cromatografía líquida de exclusión, SE-HPLC, es la técnica que mayor información aporta sobre la composición del hidrolizado, ya que es el volumen molecular el criterio de separación empleado, y no el estado de ionización, la carga o la hidrofobicidad de los péptidos como en otras técnicas, que no obstante pueden ser complementarias.
  • 16. PROPIEDADES TECNO-FUNCIONALES • Los cambios de las características moleculares que ocurren durante la hidrólisis de la proteína pueden dar lugar al comportamiento tecno- funcional modificado del hidrolizado cuando se lo compara con la proteína intacta, por ejemplo solubilidad alterada, viscosidad, características sensoriales, emulsión y características de la espuma. • SOLUBILIDAD • En el punto isoeléctrico (pI) de la proteína, la solubilidad generalmente aumenta con la hidrólisis, ya que es principalmente el resultado de la reducción en peso molecular y del aumento en el número de grupos polares. • El efecto de la hidrólisis sobre la solubilidad a otros valores de pH depende de la proteína estudiada. Los caseinatos por ejemplo, son muy solubles en los valores de pH sobre y debajo del pI .
  • 17. • Un efecto secundario negativo importante de la hidrólisis de la proteína es la liberación de los péptidos generalmente con sabor más amargo que la proteína nativa . Se ha demostrado que el sabor amargo de los péptidos puros, a pesar de depender de la fuente de proteína y de la especificidad de la enzima, está relacionado con la presencia y posición de aminoácidos hidrofóbicos en los péptidos del hidrolizado. • EMULSIONES Y ESPUMA • Las características de la emulsión y de formación de espuma de la proteína y de los hidrolizados de la proteína dependen del pH del sistema y de la enzima empleada para la hidrólisis. • Dentro de las técnicas, se determinan el índice de actividad de la emulsión (EAI) que mide la turbiedad de las emulsiones con cierta fracción de aceite, mientras que la capacidad de emulsionar (EC) determina la cantidad de aceite que se puede dispersar por cierta cantidad de proteína o de hidrolizado.
  • 18. • La hidrólisis de proteínas resulta un método muy útil sobre todo en la industria alimentaria. • Los productos de la misma se clasifican para su uso según su grado de hidrólisis, los de bajo grado(1-10%) para mejorar propiedades funcionales, los de grado variable como saborizantes y los hidrolizados extensivos(mayor a 10%) para alimentación especializada. • La cromatografía de exclusión por tamaño se utiliza para comparar la acción hidrolitica de varias proteasas o caracterizar hidrolizados hipoalergenicos. Es la técnica que da mas información sobre la composición del hidrolizado.
  • 19. • La cromatografía de fase reversa detalla la complejidad de los hidrolizados. • Seria importante el desarrollo de nuevas técnicas capaces de separar y cuantificar péptidos de pesos moleculares inferiores a 1000 Da, especialmente si el hidrolizado se va usar en formulación de dietas enterales, ya que las técnicas mencionadas en el trabajo son inespecíficas para péptidos de bajo peso molecular(menor a 1000 Da). • Actualmente para la identificación, el método mas utilizado es la espectrometría de masas, a través de la cual identificamos péptidos y aminoácidos.
  • 20. • La hidrólisis enzimática de proteínas es un método actualmente muy utilizado en la tecnología alimentaria, debido a que los productos presentan propiedades nutricionales y funcionales (viscosidad baja, mayor capacidad de agitación, dispersión y alta solubilidad) muy útiles en el área. En otras palabras, por hidrólisis las propiedades moleculares de la proteína nativa cambian, disminuye el peso molecular, aumenta la carga y se liberan grupos hidrofóbicos. Además, aumenta la digestibilidad y disminuye la alergenicidad. • La composición final del producto de la hidrólisis depende de la fuente proteica, la proteasa utilizada, condiciones y grado de hidrólisis alcanzado en la reacción (este ultimo será determinante para fijar su posible uso).
  • 21. • El grado de hidrólisis es el % de enlaces peptidicos rotos en relación a la proteína nativa. Depende de: [sustrato], relación enzima/sustrato, temperatura de incubación, pH, temperatura y naturaleza de la enzima. • Básicamente la hidrólisis sigue este esquema: Enzima- Sustrato, Rotura de enlace amídico y por ultimo, liberación del péptido. • La separación de péptidos y aminoácidos se realiza a través de diversos métodos cromatograficos y finalmente, la identificación se logra por espectrometría de masas, cromatografía de gases, análisis de la secuencia o determinación de aminoácidos.