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neurociencias
Programa
●
Conociendo al pez cebra
●
Ventajas e inconvenientes del uso
del pez cebra en neurobiología
●
Dominios conductuales de interés
El pez cebra
●
Cyprinidae
●
Pequeño tamaño (2-4 cm adulto)
●
Originario del sudeste asiático
●
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●
Los huevos se desarrollan externamente
●
Embriones transparentes
Hamilton 1822
Parichy DM (2015). The Natural History of Model Organisms: Advancing biology through a deeper understanding of
zebrafish ecology and evolution. eLife 4: e05635
Ventajas del uso del pez cebra en neurobiología
●
Ventajas generales
– Desarollo rapido (2-3 meses post-fertilización)
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– Desarollo externo (larvas de nado libre en 4 dpf)
●
Obtención de imágenes / neuroanatomia
– Tamaño reducido ideal para microscopía
– Observación y manipulación neuronal no invasiva gracias a la transparencia de las larvas
●
Imágenes en vivo en tiempo real con resolución celular
●
Las investigaciones pueden incluir miles de larvas con adquisición y procesamiento
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Progr Neurobiol 93: 231-243
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Ventajas del uso del pez cebra en neurobiología
●
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●
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Inconvenientes del uso del pez cebra en
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●
Sin cepas consanguíneas
●
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●
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●
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●
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Rinkwitz S, Mourrain P, Becker TS (2010). Zebrafish: An integrative system for neurogenomics and neurosciences.
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Estudios comparativos, conservación evolutiva y
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●
Los linajes SAGFF70A y SAGFF120A
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●
Las neuronas 120A-Dm eran en su
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Sensibilización dependiente del tiempo como
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Cabeza de riñon (produccion de cortisol) Encéfalo
30’
90’
Cabeza de riñon (produccion de cortisol)
Mecanismos downstream
ODQ (bloqueador GC) 90’
despues de la exposición
Ivabradina (bloqueador
canales HCN) 90’ despues
de la exposición
Mecanismos upstream?
TRAM-34 (bloqueador de canales
IKCa, expressos en neuronios e
microglia) 30’ despues de la
exposición
En resumen...
●
La producción inicial e inmediata de óxido nítrico a través de NOS-1 ayuda en la primera
fase de consolidación, sensibilizando circuitos que aún no han sido definidos
●
La modulación de los receptores IKCa en microglía y neuronas conduce a la activación de
NOS-2
●
La activación de NOS-2 conduce a una elevación sostenida y retardada del óxido nítrico
●
El óxido nítrico activa la guanilato ciclasa, que eleva el GMPc; este GMPc sensibiliza los
circuitos de comportamiento defensivo a través de los canales HCN (quizás también estén
presentes otros mecanismos).
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Impacto del pez cebra en biología y neurociencias

  • 2. Programa ● Conociendo al pez cebra ● Ventajas e inconvenientes del uso del pez cebra en neurobiología ● Dominios conductuales de interés
  • 3. El pez cebra ● Cyprinidae ● Pequeño tamaño (2-4 cm adulto) ● Originario del sudeste asiático ● Vive en cardúmenes ● Los huevos se desarrollan externamente ● Embriones transparentes Hamilton 1822 Parichy DM (2015). The Natural History of Model Organisms: Advancing biology through a deeper understanding of zebrafish ecology and evolution. eLife 4: e05635
  • 4. Ventajas del uso del pez cebra en neurobiología ● Ventajas generales – Desarollo rapido (2-3 meses post-fertilización) – Alta densidad de alojamiento / costo comparativamente bajo – Desarollo externo (larvas de nado libre en 4 dpf) ● Obtención de imágenes / neuroanatomia – Tamaño reducido ideal para microscopía – Observación y manipulación neuronal no invasiva gracias a la transparencia de las larvas ● Imágenes en vivo en tiempo real con resolución celular ● Las investigaciones pueden incluir miles de larvas con adquisición y procesamiento – Conservación de los principales núcleos/regiones cerebrales: núcleo arqueado, hipocampo, amígdala, locus coeruleus, rafe...) – Red neuronal pequeña/compacta revelada a la vez por microscopia de dos fotones o confocal – Imágenes en vivo con GECI (indicador de calcio codificado genéticamente) – Cerebro adulto de pequeño tamaño (5 mm de longitud). Número reducido de secciones para análisis histológico y neurodegeneración Rinkwitz S, Mourrain P, Becker TS (2010). Zebrafish: An integrative system for neurogenomics and neurosciences. Progr Neurobiol 93: 231-243 Stewart AM, Braubach O, Spitsbergen J, gerlai R, Kalueff AV (2014). Zebrafish models for translational neuroscience research: From tank to bedside. Trends Neurosci 37: 264-278
  • 5. Ventajas del uso del pez cebra en neurobiología ● Recursos genômicos / genéticos – Más de 12.000 patrones de expresión génica anotados (incluidos los miARN) – Transgénesis con vectores retrovirales y transposones (miles de líneas de líneas generadas) – Mutagénesis rápida (TILLING, pruebas ENU, mutagénesis insercional, zinc finger nucleasas) – Amplia colección de mutantes – Eliminación rápida de genes mediante morfolinos antisentido ● Farmacología y fisiología – Screening de fármacos en formato de 96 pocillos – Conservación de la mayoría de las dianas farmacológicas – Conservación de neurotransmisores rápidos clásicos (glicina, GABA, – glutamato, monoaminas: dopamina, norepinefrina, epinefrina, – serotonina, melatonina) – Conservación de la mayoría de los neuropéptidos (por ejemplo, MCH2) – Conservación de genes tempranos inmediatos (por ejemplo, cFos, Jun, krox24, bdnf, homer) Rinkwitz S, Mourrain P, Becker TS (2010). Zebrafish: An integrative system for neurogenomics and neurosciences. Progr Neurobiol 93: 231-243 Rihel J et al. (2010). Zebrafish Behavioral Profiling Links Drugs to Biological Targets and Rest/Wake Regulation. Science 327: 348-351
  • 6. Inconvenientes del uso del pez cebra en neurobiología ● Sin cepas consanguíneas ● Tamaño reducido para muestras de tejidos ● Evolutivamente distante del ser humano ● Fisiológicamente diferentes ● Sin recombinación homóloga ● Algunos neuropéptidos no se conservan (por ejemplo, NPS) ● No se encuentran algunos genes tempranos inmediatos (ARC) ● No hay electroencefalograma; no hay resonancia magnética funcional ● No hay neocórtex estratificado ● Algunos núcleos son difíciles de identificar o aún no se han encontrado (por ejemplo, el núcleo accumbens) ● Neuropatología/trastornos neurológicos aún no bien definido en pez cebra Rinkwitz S, Mourrain P, Becker TS (2010). Zebrafish: An integrative system for neurogenomics and neurosciences. Progr Neurobiol 93: 231-243
  • 7. Estudios comparativos, conservación evolutiva y similitud funcional ● Algunos comportamientos, enfermedades, trastornos o procesos neurobiológicos podrían no estar conservados evolutivamente (es decir, no existe homología histórica) ● Los procesos neurobiológicos que se observan en varias especies diferentes son probablemente homólogos, o bien analogías lo suficientemente buenas como para producir hipótesis en otros organismos Gerlai R (2014). Fish in behavior research: Unique tools with a great promise! J Neurosci Methods 234: 54-58
  • 8. Un ejemplo de analogías sin conservación evolutiva: el papel de la serotonina en el comportamiento tipo-ansioso Maximino C, Costa BP, Lima MG (2016). A review of monoaminergic neuropsychopharmacology in zebrafish, 6 years later: Towards paradoxes and their solution. Curr Psychopharmacol 5: 96-138
  • 9. Utilización de herramientas genéticas para estudiar la función neuroconductual
  • 10. Utilización de herramientas genéticas para estudiar la función neuroconductual ● ¿Qué regiones cerebrales están asociadas al aprendizaje aversivo? ¿Qué neuronas son responsables? ● Creación de líneas de peces transgénicos que expresan Gal4FF, una versión modificada del activador de la transcripción Gal4, en regiones específicas del cerebro ● Se cruzaron estos peces que expresaban Gal4FF con la línea efectora que portaba el gen de la neurotoxina botulínica (inactiva la exocitosis) de la secuencia de unión de Gal4 UAS, y se analizaron los peces transgénicos dobles para el condicionamiento del miedo por evitación activa evitación activa ● Dos de estos linajes tenían expresión de Gal4 en poblaciones de neuronas localizadas en subregiones de la Dm (= BLA), que se denominaron neuronas 120A-Dm
  • 11. Utilización de herramientas genéticas para estudiar la función neuroconductual ● Los linajes SAGFF70A y SAGFF120A se identificaron como líneas de potenciadores del gen emx3 ● Las neuronas 120A-Dm eran en su mayoría glutamatérgicas y tenían proyecciones a otras regiones cerebrales, como el hipotálamo y el telencéfalo ventral.
  • 12. Sensibilización dependiente del tiempo como modelo del TEPT Lima MG et al. (2016). Time-dependent sensitization of stress responses in zebrafish: A putative model for post-traumatic stress disorder. Behav Proc 128: 70- 82 0 h 24 h Análisis conductual Exposición
  • 13. Papel del óxido nítrico en la sensibilización dependiente del tiempo Lima MG et al. (2015). Putative involvement of the nitrergic system on the consolidation, but not initiation, of behavioral sensitization after conspecific alarm substance in zebrafish. Pharmacol Biochem Behav 139B: 127-133
  • 14. Isoformas envolvidas 7-NI (bloqueador NOS-1) 30’ despues de la exposición AG (bloqueador NOS-2) 30’ despues de la exposición AG (bloqueador NOS-2) 90’ despues de la exposición
  • 15. Cabeza de riñon (produccion de cortisol) Encéfalo 30’ 90’ Cabeza de riñon (produccion de cortisol)
  • 16. Mecanismos downstream ODQ (bloqueador GC) 90’ despues de la exposición Ivabradina (bloqueador canales HCN) 90’ despues de la exposición
  • 17. Mecanismos upstream? TRAM-34 (bloqueador de canales IKCa, expressos en neuronios e microglia) 30’ despues de la exposición
  • 18. En resumen... ● La producción inicial e inmediata de óxido nítrico a través de NOS-1 ayuda en la primera fase de consolidación, sensibilizando circuitos que aún no han sido definidos ● La modulación de los receptores IKCa en microglía y neuronas conduce a la activación de NOS-2 ● La activación de NOS-2 conduce a una elevación sostenida y retardada del óxido nítrico ● El óxido nítrico activa la guanilato ciclasa, que eleva el GMPc; este GMPc sensibiliza los circuitos de comportamiento defensivo a través de los canales HCN (quizás también estén presentes otros mecanismos).
  • 19. Muito obrigado pela atenção!