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MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS DE
ANÁLISIS
Métodos instrumentales
Ventajas:
 Selectividad y sensibilidad
 Determinación simultanea
de varios analitos
 Rápidos, baratos y de fácil
automatización
 PC (control del instrumento
y manejo de datos)
 Instrumentos inteligentes
Desventajas:
 Técnicos expertos
 Calibración previa del
equipo, a base de métodos
químicos
 La calibración suele ser cara
Técnicas instrumentales
Espectroscópicas
Electroquímicas
Cromatográficas
Acopladas o conjuntadas, diversas…..
Métodos
espectroscópicos
Radiación
electromagnética
Grupo de métodos analíticos que se basan
en las interacciones de la radiación
electromagnética con la materia.
Rapidez-automatización-instrumentaciòn
Radiación electromagnética es un tipo de
energía que toma varias formas: luz, calor
radiante, rayos gamma, rayos X, radiación
ultravioleta, de microondas y de
radiofrecuencia.
PRINCIPIOS BÁSICOS DE
LA ESPECTROCOPÍA
La luz: Partículas de energía que se mueven por el
espacio mostrando propiedades parecidas a las de las
ondas
La energía asociada con un rayo de luz no esta distribuida de manera
continua sino que está concentrada en paquetes discretos
CORPUSCULARONDULATORIA
Naturaleza de la luz
 Teoría ondulatoria:
Fenómenos asociados a
la propagación de luz
Interferencia
Difracción
Refracción
 Corpuscular:
Interacción de la luz con
la materia
 Espectroscopia de
absorción
 Espectroscopia de
emisión
Teoría ondulatoria
 Las propiedades ondulatorias de la radiación
electromagnética se describen en términos de:
Frecuencia
Longitud de onda
Amplitud de ondas
Campo eléctrico
(E)
Campo
magnético (B)
Amplitud
Ui = v λi
(Ui) Frecuencia de una onda: nº de oscilaciones que
en un punto dado experimenta la onda en un
segundo
(λ) Longitud de onda: Distancia entre 2 máximos
sucesivos
(v): Velocidad de propagación
(P): Periodo de una onda: Es la inversa a la
frecuencia. Tiempo en sg requerido para que 2
máximos sucesivos pasen por un punto dado
(Ui) Frecuencia de una onda electromagnética viene determinada por la
fuente de radiación y permanece constante cuando la onda atraviesa
medios diferentes
La (v): Velocidad de propagación de una onda, varia dependiendo del medio
a través del cual se propague la luz
La (λ) Longitud de onda varia en proporción a los cambios de la velocidad de
onda
 (A) Amplitud de la onda
 (P) Potencia radiante
 (I) Intensidad de la onda
Campo eléctrico (E)
Campo magnético
(B)
Amplitud(A)
Propagación de las ondas electromagnéticas
 FUENTES DE ONDA: Representa un conjunto de puntos, todos los cuales se
encuentran en fase
Para una fuente puntual de luz, un anillo concéntrico que atraviesa los
máximos rayos de luz adyacente representará una fuente de ondas
 TREN DE ONDA: Fuente de ondas que están todas ellas en fase. Cada
fuente de onda alcanzará una amplitud máxima en la mínima porción
de espacio
Indica que una serie de fotones en fase, sugieren la misma trayectoria
Describe la observación experimental de que cuando dos o más frentes de
onda se entrecruzan dan como resultado, en el punto de la intersección, una
onda instantánea cuya amplitud es la suma algebraica de las amplitudes de
onda individuales de dicho punto de intersección
• Máxima interferencia constructiva: Se da cuando las ondas se encuentran
completamente en fase. Los máximos de una onda se superponen con los
máximos de otra onda.
• Máximos de interferencia destructiva: Los máximos de una onda se superponen
con los mínimos de la otra onda.
Interferencia:
Fenómenos asociados a propagación de luz: INTERFERENCIA, DIFRACCIÓN Y REFRACCIÓN
NATURALEZA
CORPUSCULAR
 FOTONES: Partículas de energía que se mueven a través del espacio con propiedades
ondulatorias
(E=hv)
ENERGIA DE UN FOTÓN
EMISIÓN O ABSORCIÓN DE LA
RADIACIÓN
h: Constante de Pack
V: frecuencia de la onda asociada
Los fotones que comprenden una luz monocromática, que es la radiación electromagnética
compuesta por ondas que comprenden una misma frecuencia, son todos de energía equivalente
La LUMINOSIDAD de un haz de luz monocromática es el producto de los
fotones por la energía de cada fotón
Flujo de
fotones
Número de fotones que fluyen a través de un área,
unidad perpendicular al haz, por unidad de tiempo
Para variar la intensidad o
potencial radiante de un haz
de luz monocromático se
necesita modificar el flujo de
fotones
LOS ESTADOS DE ENERGÍA DE LA
MATERIA
 El contenido de energía potencial (energía
interna) varia por intervalos.
 En condiciones normales, los átomos están
en estado fundamental (energía más baja)
 Cuando los átomos en estado
fundamental ganan energía pasan a su
estado excitado
Cada molécula tiene limitaciones
respecto a sus niveles de energía,
por lo que existe una energía interna
específica para cada especie
atómica
Los niveles de energía de cualquier
átomo son característicos para
dicha especie
La diferencia de energía potencial
entre los niveles de energía interna
para cada especie, puede ser
usada cualitativamente como huella
dactilar
Las espectroscopias de emisión y absorción
CUALITATIVA, usan la determinación de las
diferencias relativas del compuesto incógnita
mediante la medida de transmisiones entre niveles
de energía permitidos
TRANSMISIONES ENTRE NIVELES DE
ENERGIA EN ESPECTROSCOPÌA
ABSORCIÓN DE
LA RADIACIÓN
EMISIÓN DE LA
RADIACIÓN
ABSORCIÓN DE LA RADIACIÓN
• Proceso en el que la energía procedente de un fotón en la
radiación electromagnética es transferida a la especie
absorbente
• Cuando un átomo absorbe un fotón de luz su energía
aumenta en una cantidad equivalente a la energía
contenida en ese fotón en particular pasando de un estado
menor de energía a un estado excitado
• Proceso CUANTITATIVO ya que la totalidad del fotón es
transferida a la especie absorbente
• Si se representa gráficamente la energía de los fotones frente a la
absorbancia relativa compuesta por fotones de la misma energía, se
observa un espectro de absorbancia característico cuya forma
viene dada por la absortividad relativa de los fotones de las distintas
energías
ABSORTIVIDAD: Es una constante de
proporcionalidad dependiente de la longitud de
onda, la cual, relaciona la concentración de la
especie absorbente con su absorbancia
experimentalmente medida bajo condiciones
definidas
EMISIÓN DE LA RADIACIÓN
 Fenómeno contrario a la absorción, dado que la energía es liberada de un átomo o
molécula en forma de fotón de radiación
 Una molécula elevada en estado excitado permanece en ese estado durante un
periodo muy corto de tiempo antes de relajarse y volver a su estado fundamental
 Existen diferentes procesos de relajación a través de los cuales la molécula
excitada puede disipar energía (colisiones con otras moléculas)
Las moléculas excitadas por absorción de luz UV y VIS perderán parte del exceso de
energía mediante la emisión de un fotón, lo que se conoce como FLUORESCENCIA o
FOSFORESCENCIA dependiendo de la naturaleza del estado excitado
En espectroscopia molecular de
fluorescencia, los fotones emitidos
desde la especie excitada serán de
menor energía y longitud de onda
más larga que los correspondientes
a los fotones que fueron absorbidos
en el proceso excitado
 Espectroscopia: Interacción de la radiación electromagnética con la materia
 Análisis espectroscópico: Rama de la espectroscopia usada para análisis cualitativo y
cuantitativo
 Métodos más comunes de análisis: UV, VIS, IR, espectroscopia de fluorescencia
molecular
 Fundamento: El contenido de la energía de la materia está cuantificado y los fotones de
la radiación pueden ser absorbidos o emitidos por la materia si la energía asociada al
fotón es igual a la diferencias de las energías para las transiciones permitidas de dicha
especie
 Los métodos difieren unos de otros con respecto a las longitudes de onda de las
radiaciones utilizadas en el análisis o la naturaleza molecular frente a la atómica del
analito
RESUMEN
Espectroscopia
ultravioleta, visible y de
fluorescencia
Espectroscopia UV-VIS: 200-700 nm
UV: 200-350 nm
Incolora al ojo
humano
VIS: 350-700 nm
Visible
(violeta-rojo)
FUNDAMENTO ESPECTROSCOPÍA DE
ABSORCIÓN
 OBJETIVO: Determinar la concentración de analito de una disolución
dada en la muestra
 DETERMINACIÓN: Medir la cantidad de luz de un haz de referencia
cuando este atraviesa la dilución de la muestra
 Analito absorbe la radiación en la región UV-VIS de forma natural
 Analito no absorbe la radiación y son modificados químicamente para
que observen la radiación a una longitud de onda
• El espectro en las regiones visible y ultravioleta está constituido
por bandas representativas de un gran número de transiciones
• la sensibilidad es relativamente alta, característica adecuada
para aplicaciones cuantitativas.
Haz incidente Haz emergente
 La disolución afecta a la cantidad de radiación transmitida a través de la dn y por
tanto la absorbancia o trasmitancia de la dilución puede ser usada como indicador
de la concentración del analito
 La dn se encuentra en una célula de absorción que se dispone en la trayectoria de
la radiación de una longitud de onda determinada
 Se mide la radiación que atraviesa la muestra en comparación con la muestra de
referencia
Haz incidente (P0) Haz emergente (P)
TRANSMITANCIA: Proporción entre P y P0 (T= P/P0) (%T= (P/P0)/100)
ABSORBANCIA: Es directamente proporcional a la concentración de la especie
absorbente presente en la dn (A=Log (P0/P)
Ley de Beer
Relación entre la absorbancia de la disolución y la
concentración de la especie absorbente
A= abc
A: absorbancia
a: absortividad
c: concentración de la especie absorbente
Camino óptico a través de la dn en cm
Absortividad: constante
de proporcionalidad
dependiente de las
propiedades
moleculares de la
especie
Ley aplicable hasta diluciones
diluidas hasta
aproximadamente 10mM
COMPONENTES DE UN
ESPECTOFOTOMETRO
Fuente de
radiación
Separación
de
longitudes
de onda
Soporte
para la
célula de
muestra y
de
referencia
Detector
fotoeléctrico
Dispositivo
de lectura
de salida
Fuente de
alimentación
INSTRUMENTACIÓN
 Fuente de luz
 Monocromador
 Soporte de la muestra o la referencia
 Detector de la radiación
 Dispositivo de lectura
FUENTE DE LUZ:
 Deben emitir, de manera continua, una intensa banda de radiación que
abarque la longitud de onda para las cuales está diseñado el instrumento
 La más corriente el la lámpara de filamentos de Wolframio (300-2500nm) (IR) o
las lámparas de deuterio de descarga eléctrica (160-375nm )(UV)
MONOCROMADOR:
 Separar el grupo específico, estrecho y continuo de longitudes de onda para
ser utilizado en el ensayo espectroscópico
 La anchura de banda efectiva de un monocroador viene determinada por la
anchura de la rendija y por la calidad de su elemento dispersante
DETECTOR:
 Cuantifica la luz transmitida a través de la célula de referencia o de la célula
de la muestra
 Un detector ideal daría una señal directamente proporcional a la potencia
radiante del haz que incide sobre él, poseería una relación señal-ruido alta y
presentaría una respuesta relativamente constante.
 Los detectores más usados:
 Fototubo
 Tubo fotomultiplicador
 fotodiodos
ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA
Es un tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la
fluorescencia de una muestra.
Mide la radiación electromagnética emitida por un analito
cuando este se relaja desde un nivel de energía electrónico
excitado hasta el correspondiente estado fundamental
En los fluorimetros son necesarios dos detectores de longitudes
de onda uno para el haz de excitación y otro par el haz de
emisión
Las especies objeto de examen tendrán un
estado electrónico basal de interés, y un estado
electrónico excitado de mayor energía. Dentro
de cada uno de estos estados electrónicos hay
diferentes estados vibracionales.
Se excita la muestra mediante la absorción de un fotón
de luz, desde su estado electrónico basal a uno de los
distintos estados vibracionales del estado electrónico
excitado.
Las colisiones con otras moléculas causan que la
molécula excitada pierda energía vibracional hasta
que alcanza el estado vibracional más bajo del
estado electrónico excitado.
= FOTÓN DE LUZ
Consta de una fuente de luz y de un sistema de selección de
longitud de onda de excitación.
Cuando la muestra es excitada con radiación de energía apropiada
emite radiación en todas las direcciones del espacio.
No obstante la luz emitida se detecta mejor en ángulo recto con respecto al
haz de excitación ya que se evitan problemas de dispersión de la luz y
también el haz de luz excitante que es de mucha mayor intensidad que el
haz de luz emitida.
Potencia radiante (Pf): Es proporcional al numero de fotones absorbidos por la muestra
Pf= φ (P0-P)
(Pf): potencia radiante del haz emitido por la célula fluorescente
(φ): eficancia cuántica: proporción entre el numero total de fotones
emitidos y el numero total de fotones emitidos
1.) Una sensibilidad entre 1 y 3 órdenes de magnitud mayor.
2.) Mayor intervalo de respuesta lineal. Sin embargo, los
métodos de fluorescencia se aplican menos que los de
absorción ya que no todos los sistemas químicos son
capaces de fluorescer y el equipamiento es más costoso
que los de espectroscopías de absorción.
RESUMEN
 Las medidas cualitativas se basan en que cada analito presenta un conjunto de
diferencias de energía el cual determinará su espectro de absorción o de emisión
 Las medidas cualitativas se basan en el análisis del espectro de emisión o de
absorción del analito
 Los ensayos cuantitativos se basan en la medición de absorbancia o fluorescencia
de la solución del analito a una longitud de onda dada
 En los ensayos cuantitativos la absorbacia de la dn depende de la concentración
del analito
RESUMEN
 Ley de Beer: Existe una relación directa entre la absorbancia de una dilución
la concentración del analito
 La aplicación de la ley de Beer a cualquier ensayo siempre debe ser verificada
experimentalmente mediante una curva de calibrado (realizada al mimo
tiempo y en las mismas condiciones)
 La concentración de analito en la disolución problema debe ser estimada a
partir de la curva de calibrado establecida
RESUMEN
 Los métodos de fluorescencia molecular están basados en la medida de
la radiación emitida por las moléculas excitadas del analito, cuando se
relajan a niveles de energía inferiores
 Los analitos son promocionados a estado excitado como resultado de la
absorción de un fotón
 Los procesos de absorción de un fotón y de emisión de la fluorescencia
tienen lugar simultáneamente en el transcurso del ensayo
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Metodos espectroscopicos

  • 2. Métodos instrumentales Ventajas:  Selectividad y sensibilidad  Determinación simultanea de varios analitos  Rápidos, baratos y de fácil automatización  PC (control del instrumento y manejo de datos)  Instrumentos inteligentes Desventajas:  Técnicos expertos  Calibración previa del equipo, a base de métodos químicos  La calibración suele ser cara
  • 4. Métodos espectroscópicos Radiación electromagnética Grupo de métodos analíticos que se basan en las interacciones de la radiación electromagnética con la materia. Rapidez-automatización-instrumentaciòn Radiación electromagnética es un tipo de energía que toma varias formas: luz, calor radiante, rayos gamma, rayos X, radiación ultravioleta, de microondas y de radiofrecuencia.
  • 5. PRINCIPIOS BÁSICOS DE LA ESPECTROCOPÍA
  • 6. La luz: Partículas de energía que se mueven por el espacio mostrando propiedades parecidas a las de las ondas La energía asociada con un rayo de luz no esta distribuida de manera continua sino que está concentrada en paquetes discretos CORPUSCULARONDULATORIA
  • 7. Naturaleza de la luz  Teoría ondulatoria: Fenómenos asociados a la propagación de luz Interferencia Difracción Refracción  Corpuscular: Interacción de la luz con la materia  Espectroscopia de absorción  Espectroscopia de emisión
  • 8. Teoría ondulatoria  Las propiedades ondulatorias de la radiación electromagnética se describen en términos de: Frecuencia Longitud de onda Amplitud de ondas
  • 9. Campo eléctrico (E) Campo magnético (B) Amplitud Ui = v λi (Ui) Frecuencia de una onda: nº de oscilaciones que en un punto dado experimenta la onda en un segundo (λ) Longitud de onda: Distancia entre 2 máximos sucesivos (v): Velocidad de propagación (P): Periodo de una onda: Es la inversa a la frecuencia. Tiempo en sg requerido para que 2 máximos sucesivos pasen por un punto dado
  • 10. (Ui) Frecuencia de una onda electromagnética viene determinada por la fuente de radiación y permanece constante cuando la onda atraviesa medios diferentes La (v): Velocidad de propagación de una onda, varia dependiendo del medio a través del cual se propague la luz La (λ) Longitud de onda varia en proporción a los cambios de la velocidad de onda  (A) Amplitud de la onda  (P) Potencia radiante  (I) Intensidad de la onda Campo eléctrico (E) Campo magnético (B) Amplitud(A)
  • 11. Propagación de las ondas electromagnéticas  FUENTES DE ONDA: Representa un conjunto de puntos, todos los cuales se encuentran en fase Para una fuente puntual de luz, un anillo concéntrico que atraviesa los máximos rayos de luz adyacente representará una fuente de ondas  TREN DE ONDA: Fuente de ondas que están todas ellas en fase. Cada fuente de onda alcanzará una amplitud máxima en la mínima porción de espacio Indica que una serie de fotones en fase, sugieren la misma trayectoria
  • 12. Describe la observación experimental de que cuando dos o más frentes de onda se entrecruzan dan como resultado, en el punto de la intersección, una onda instantánea cuya amplitud es la suma algebraica de las amplitudes de onda individuales de dicho punto de intersección • Máxima interferencia constructiva: Se da cuando las ondas se encuentran completamente en fase. Los máximos de una onda se superponen con los máximos de otra onda. • Máximos de interferencia destructiva: Los máximos de una onda se superponen con los mínimos de la otra onda. Interferencia: Fenómenos asociados a propagación de luz: INTERFERENCIA, DIFRACCIÓN Y REFRACCIÓN
  • 13. NATURALEZA CORPUSCULAR  FOTONES: Partículas de energía que se mueven a través del espacio con propiedades ondulatorias (E=hv) ENERGIA DE UN FOTÓN EMISIÓN O ABSORCIÓN DE LA RADIACIÓN h: Constante de Pack V: frecuencia de la onda asociada Los fotones que comprenden una luz monocromática, que es la radiación electromagnética compuesta por ondas que comprenden una misma frecuencia, son todos de energía equivalente La LUMINOSIDAD de un haz de luz monocromática es el producto de los fotones por la energía de cada fotón
  • 14. Flujo de fotones Número de fotones que fluyen a través de un área, unidad perpendicular al haz, por unidad de tiempo Para variar la intensidad o potencial radiante de un haz de luz monocromático se necesita modificar el flujo de fotones
  • 15. LOS ESTADOS DE ENERGÍA DE LA MATERIA  El contenido de energía potencial (energía interna) varia por intervalos.  En condiciones normales, los átomos están en estado fundamental (energía más baja)  Cuando los átomos en estado fundamental ganan energía pasan a su estado excitado
  • 16. Cada molécula tiene limitaciones respecto a sus niveles de energía, por lo que existe una energía interna específica para cada especie atómica Los niveles de energía de cualquier átomo son característicos para dicha especie La diferencia de energía potencial entre los niveles de energía interna para cada especie, puede ser usada cualitativamente como huella dactilar Las espectroscopias de emisión y absorción CUALITATIVA, usan la determinación de las diferencias relativas del compuesto incógnita mediante la medida de transmisiones entre niveles de energía permitidos
  • 17. TRANSMISIONES ENTRE NIVELES DE ENERGIA EN ESPECTROSCOPÌA ABSORCIÓN DE LA RADIACIÓN EMISIÓN DE LA RADIACIÓN
  • 18. ABSORCIÓN DE LA RADIACIÓN • Proceso en el que la energía procedente de un fotón en la radiación electromagnética es transferida a la especie absorbente • Cuando un átomo absorbe un fotón de luz su energía aumenta en una cantidad equivalente a la energía contenida en ese fotón en particular pasando de un estado menor de energía a un estado excitado • Proceso CUANTITATIVO ya que la totalidad del fotón es transferida a la especie absorbente
  • 19. • Si se representa gráficamente la energía de los fotones frente a la absorbancia relativa compuesta por fotones de la misma energía, se observa un espectro de absorbancia característico cuya forma viene dada por la absortividad relativa de los fotones de las distintas energías ABSORTIVIDAD: Es una constante de proporcionalidad dependiente de la longitud de onda, la cual, relaciona la concentración de la especie absorbente con su absorbancia experimentalmente medida bajo condiciones definidas
  • 20. EMISIÓN DE LA RADIACIÓN  Fenómeno contrario a la absorción, dado que la energía es liberada de un átomo o molécula en forma de fotón de radiación  Una molécula elevada en estado excitado permanece en ese estado durante un periodo muy corto de tiempo antes de relajarse y volver a su estado fundamental  Existen diferentes procesos de relajación a través de los cuales la molécula excitada puede disipar energía (colisiones con otras moléculas)
  • 21. Las moléculas excitadas por absorción de luz UV y VIS perderán parte del exceso de energía mediante la emisión de un fotón, lo que se conoce como FLUORESCENCIA o FOSFORESCENCIA dependiendo de la naturaleza del estado excitado En espectroscopia molecular de fluorescencia, los fotones emitidos desde la especie excitada serán de menor energía y longitud de onda más larga que los correspondientes a los fotones que fueron absorbidos en el proceso excitado
  • 22.
  • 23.  Espectroscopia: Interacción de la radiación electromagnética con la materia  Análisis espectroscópico: Rama de la espectroscopia usada para análisis cualitativo y cuantitativo  Métodos más comunes de análisis: UV, VIS, IR, espectroscopia de fluorescencia molecular  Fundamento: El contenido de la energía de la materia está cuantificado y los fotones de la radiación pueden ser absorbidos o emitidos por la materia si la energía asociada al fotón es igual a la diferencias de las energías para las transiciones permitidas de dicha especie  Los métodos difieren unos de otros con respecto a las longitudes de onda de las radiaciones utilizadas en el análisis o la naturaleza molecular frente a la atómica del analito RESUMEN
  • 25. Espectroscopia UV-VIS: 200-700 nm UV: 200-350 nm Incolora al ojo humano VIS: 350-700 nm Visible (violeta-rojo)
  • 26. FUNDAMENTO ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN  OBJETIVO: Determinar la concentración de analito de una disolución dada en la muestra  DETERMINACIÓN: Medir la cantidad de luz de un haz de referencia cuando este atraviesa la dilución de la muestra  Analito absorbe la radiación en la región UV-VIS de forma natural  Analito no absorbe la radiación y son modificados químicamente para que observen la radiación a una longitud de onda
  • 27. • El espectro en las regiones visible y ultravioleta está constituido por bandas representativas de un gran número de transiciones • la sensibilidad es relativamente alta, característica adecuada para aplicaciones cuantitativas.
  • 28. Haz incidente Haz emergente  La disolución afecta a la cantidad de radiación transmitida a través de la dn y por tanto la absorbancia o trasmitancia de la dilución puede ser usada como indicador de la concentración del analito  La dn se encuentra en una célula de absorción que se dispone en la trayectoria de la radiación de una longitud de onda determinada  Se mide la radiación que atraviesa la muestra en comparación con la muestra de referencia
  • 29. Haz incidente (P0) Haz emergente (P) TRANSMITANCIA: Proporción entre P y P0 (T= P/P0) (%T= (P/P0)/100) ABSORBANCIA: Es directamente proporcional a la concentración de la especie absorbente presente en la dn (A=Log (P0/P)
  • 30. Ley de Beer Relación entre la absorbancia de la disolución y la concentración de la especie absorbente A= abc A: absorbancia a: absortividad c: concentración de la especie absorbente Camino óptico a través de la dn en cm Absortividad: constante de proporcionalidad dependiente de las propiedades moleculares de la especie Ley aplicable hasta diluciones diluidas hasta aproximadamente 10mM
  • 31. COMPONENTES DE UN ESPECTOFOTOMETRO Fuente de radiación Separación de longitudes de onda Soporte para la célula de muestra y de referencia Detector fotoeléctrico Dispositivo de lectura de salida Fuente de alimentación
  • 32. INSTRUMENTACIÓN  Fuente de luz  Monocromador  Soporte de la muestra o la referencia  Detector de la radiación  Dispositivo de lectura
  • 33. FUENTE DE LUZ:  Deben emitir, de manera continua, una intensa banda de radiación que abarque la longitud de onda para las cuales está diseñado el instrumento  La más corriente el la lámpara de filamentos de Wolframio (300-2500nm) (IR) o las lámparas de deuterio de descarga eléctrica (160-375nm )(UV) MONOCROMADOR:  Separar el grupo específico, estrecho y continuo de longitudes de onda para ser utilizado en el ensayo espectroscópico  La anchura de banda efectiva de un monocroador viene determinada por la anchura de la rendija y por la calidad de su elemento dispersante
  • 34. DETECTOR:  Cuantifica la luz transmitida a través de la célula de referencia o de la célula de la muestra  Un detector ideal daría una señal directamente proporcional a la potencia radiante del haz que incide sobre él, poseería una relación señal-ruido alta y presentaría una respuesta relativamente constante.  Los detectores más usados:  Fototubo  Tubo fotomultiplicador  fotodiodos
  • 35. ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA Es un tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la fluorescencia de una muestra. Mide la radiación electromagnética emitida por un analito cuando este se relaja desde un nivel de energía electrónico excitado hasta el correspondiente estado fundamental En los fluorimetros son necesarios dos detectores de longitudes de onda uno para el haz de excitación y otro par el haz de emisión
  • 36. Las especies objeto de examen tendrán un estado electrónico basal de interés, y un estado electrónico excitado de mayor energía. Dentro de cada uno de estos estados electrónicos hay diferentes estados vibracionales. Se excita la muestra mediante la absorción de un fotón de luz, desde su estado electrónico basal a uno de los distintos estados vibracionales del estado electrónico excitado. Las colisiones con otras moléculas causan que la molécula excitada pierda energía vibracional hasta que alcanza el estado vibracional más bajo del estado electrónico excitado. = FOTÓN DE LUZ
  • 37.
  • 38. Consta de una fuente de luz y de un sistema de selección de longitud de onda de excitación. Cuando la muestra es excitada con radiación de energía apropiada emite radiación en todas las direcciones del espacio. No obstante la luz emitida se detecta mejor en ángulo recto con respecto al haz de excitación ya que se evitan problemas de dispersión de la luz y también el haz de luz excitante que es de mucha mayor intensidad que el haz de luz emitida.
  • 39. Potencia radiante (Pf): Es proporcional al numero de fotones absorbidos por la muestra Pf= φ (P0-P) (Pf): potencia radiante del haz emitido por la célula fluorescente (φ): eficancia cuántica: proporción entre el numero total de fotones emitidos y el numero total de fotones emitidos
  • 40. 1.) Una sensibilidad entre 1 y 3 órdenes de magnitud mayor. 2.) Mayor intervalo de respuesta lineal. Sin embargo, los métodos de fluorescencia se aplican menos que los de absorción ya que no todos los sistemas químicos son capaces de fluorescer y el equipamiento es más costoso que los de espectroscopías de absorción.
  • 41. RESUMEN  Las medidas cualitativas se basan en que cada analito presenta un conjunto de diferencias de energía el cual determinará su espectro de absorción o de emisión  Las medidas cualitativas se basan en el análisis del espectro de emisión o de absorción del analito  Los ensayos cuantitativos se basan en la medición de absorbancia o fluorescencia de la solución del analito a una longitud de onda dada  En los ensayos cuantitativos la absorbacia de la dn depende de la concentración del analito
  • 42. RESUMEN  Ley de Beer: Existe una relación directa entre la absorbancia de una dilución la concentración del analito  La aplicación de la ley de Beer a cualquier ensayo siempre debe ser verificada experimentalmente mediante una curva de calibrado (realizada al mimo tiempo y en las mismas condiciones)  La concentración de analito en la disolución problema debe ser estimada a partir de la curva de calibrado establecida
  • 43. RESUMEN  Los métodos de fluorescencia molecular están basados en la medida de la radiación emitida por las moléculas excitadas del analito, cuando se relajan a niveles de energía inferiores  Los analitos son promocionados a estado excitado como resultado de la absorción de un fotón  Los procesos de absorción de un fotón y de emisión de la fluorescencia tienen lugar simultáneamente en el transcurso del ensayo