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Universidad Autónóma de Queretaró
Licenciatura en microbiología, Campus Aeropuerto
Reporte de Practica #1:
Preparación de Medios de Cultivo
Laboratorio de Biodiversidad de los
Microorganismos
Profesora:
Erika Beatriz Álvarez Hidalgo
Equipo #9:
Alma Marina Peralta Ruiz
Rebeca Alejandra Oloarte Pulido
Juana María López Martínez
4 de septiembre del 2013
INTRODUCCIÓN
Microorganismos de todo tipo abundan en la naturaleza, pero para efecto de
este reporte solo vamos a referirnos a las bacterias las cuales se encuentran en
todas partes e incluso algunas habitan en las superficies interior y exterior del cuerpo
humano, éstos pueden ser microorganismos patógenos o bacterias que habitan en
nosotros sin causar ninguna enfermedad, como parte de nuestra flora.
Hasta 1882, los organismos microbianos se aislaron mediante la preparación
de diluciones seriadas de las muestras en un medio líquido. En 1882, Walther Hesse
y Angelina Fannie quienes trabajaban en el laboratorio del médico alemán Robert
Koch desarrollaron agar para su uso como un agente solidificante en los medios de
cultivo; así, los medios de cultivo que contienen agar proporcionan una superficie
sólida para crecer y aislar una amplia variedad de microorganismos.
Las bacterias crecen en prácticamente cualquier fuente de alimentación
ecológica que proporcione carbono. En la naturaleza, las bacterias pueden
descomponer sustancias sólidas e insolubles por la liberación de las enzimas en el
sustrato en el que están creciendo. Así, estas sustancias se descomponen o se
transforman en sustancias más simples en un proceso llamado digestión
extracelular, ya que se lleva a cabo fuera de las células bacterianas.
El agar es una cadena de polímero que comprende unidades de hidratos de
carbono de la galactosa azúcar. El agar se disuelve en agua hirviendo y luego se
deja enfriar para de esta forma ser gelificado a una temperatura de entre 34° C y 36°
C, formando una masa gelatinosa que se mantiene firme incluso a temperaturas
como los 65° C; Dicho agar también mantiene una resistencia considerable capaz de
soportar las fuerzas de cizallamiento, por lo que los geles producidos conservan su
firmeza en condiciones normales de laboratorio, alguien podría pensar que la
gelatina tiene propiedades similares al agar en cuanto a gelificación se refiere, sin
embargo la gelatina no es resistente al ataque de las enzimas bacterianas cuando
por el contrario, el agar no se ve afectado por dichas enzimas y esto permite que se
pueda preparar un medio de cultivo sin necesidad del uso de inhibidores de
bacterias que en un momento dado podrían interferir con el crecimiento del
organismo que queremos reproducir en el medio.
Desde el desarrollo de la placa de agar en el laboratorio de Robert Koch, varios
métodos se han utilizado para lograr una distribución uniforme del crecimiento
bacteriano sobre o dentro del agar.
OBJETIVO
Aprender a elaborar medios de cultivo simples, enriquecidos y
selectivos/diferenciales para el cultivo de microorganismos, destacando la
importancia del calentamiento, pH, distribución, esterilización y almacenamiento
adecuado y de esa manera, obtener las condiciones óptimas para el crecimiento
microbiano en dicho medio de cultivo.
MATERIALES
Caldo Soya Tripticaseína
(CST): Activar cepas
2 Huevos 1 probeta de 500 ml.
Agar Soya Tripticaseína
(AST): Estriar, extender y
VP
Telurito de potasio al 1% 6 matraces de 1000 ml.
Agar Eosina Azul de
Metileno (EMB): Estriar
50 ml. de Sangre
desfibrilada
2 vasos precipitado de
250 ml.
Agar Baird Parker (ABP):
Extender
250 Cajas Petri
desechables
5 frascos schott de 500
ml.
Agar Sangre (AS): estriar 100 Tubos de 13x100 mm 8 charolas p/pesar o
papel aluminio
Agar Pseudomonas:
estriar
1 Micropipeta de 10 mL 8 Espátulas
Medio SIM: picadura
(movilidad)
1 Micropipeta de 1 mL 6 Agitadores magnéticos
Solución salina al .85% 1 caja de puntas
p/micropipeta de 10 y de 1
ml.
1 potenciómetro
4 platos calientes 6 L de agua destilada 100 ml. de agua de llave
estéril
Cloro
METODOLOGÍA
Pasos para preparar un medio de cultivo sólido Baird – Parker (ABP)
1. Suspender 60g. de polvo para preparar agar Baird – Parker en
un litro de agua purificada.
2. Mezclar perfectamente, checar que el pH de la mezcla este en
el rango permitido
3. Calentar con agitación frecuente
4. Hervir durante un minuto hasta disolución completa
5. Distribuir y esterilizar a 121° C durante 15 minutos.
6. Enfriar a 45° C – 50° C
7. Adicionar 10 ml. (por litro) De solución estéril al 1 % de Telurito
8. Agregar 50 ml. (por litro) De emulsión de yema de huevo
estéril.
9. Mezclar bien
10.Vaciar en placas Petri.
Diagrama de flujo para la elaboración de un medio de cultivo
sólido de Agar Baird – Parker (ABP)
Inicio
Establecer proporción de
Agar Baird – Parker y
agua destilada a preparar
Adicionar medio a un
matraz Erlenmeyer
Adicionar la cantidad
proporcional de agua destilada
y agitar hasta deshacer grumos
Pesar agar en
balanza analítica
El pH está
dentro del
rango
Adicionar ácido
clorhídrico o
hidróxido de sodio
Introducir un
agitador magnético
al matraz
Calentar tapado en
plato caliente con
agitación constante
Llevar a ebullición por
un total de un minuto
La espuma
del líquido
sube
Retirar del fuego
hasta que baje la
espuma
Esterilizar con olla
de presión o
autoclave a 121° C
Desinfectar el
huevo y un
cuchillo
Pasar a un frasco schott,
etiquetar, cerrar (sin que sea a
presión), poner cinta testigo
Encender la campana
de flujo laminar
Material
estéril y/o
desinfectado
Si
Si
Si
No
No
No
Llevar el material a la campana
de flujo laminar para preparar
la emulsión de yema de huevo
Con ayuda del cuchillo abrir el huevo
y separar la yema, ponerla en una
probeta previamente esterilizada
Agregar solución
salina al 85%
Emulsionar
Checar la temperatura del frasco
schott con el agar Baird – Parker
ya esterilizado
Temperatura
aproximada
45° – 50°C
Esperar a que tenga
una temperatura
templada
Agregar 10ml de
solución estéril a 1% de
Telurito y 50ml de
emulsión de yema de
huevo (por litro) al agar
ya esterilizado
Esperar dentro de la
campana de flujo
laminar a que solidifique
Verter el agar Baird – Parker
ya completamente preparado
en cajas Petri
Está sólido
Fin
Tapar y almacenar para uso futuro
Si
Si
Si
No
No
RESULTADOS
MEDIO DE
CULTIVO
COMPOSICIÓN
MODO DE ACCIÓN DEL
INGREDIENTE
EMPLEO
MORFOLOGÍA
COLONIAL
Agar Baird–
Parker
10g Peptona de
caseína
5g Extracto de
carne
1g Extracto de
levadura
5g Cloruro de litio
17g Agar
12g Glicina
10g Piruvato de
sodio
pH final 6.8±0.2
Peptona de caseína: Se
recomienda para
enriquecer medios para el
cultivo de un gran número
de bacterias de difícil
crecimiento.
Peptona de gelatina: Bajo
contenido de cistina y
triptófano; ausencia de
carbohidratos; Promueve
una respuesta típica y
consistente de organismos
no exigentes en sus
requerimientos
nutricionales.
Peptona de carne: Usada
para cultivos de
organismos difíciles y
aerobios, así como en
formulaciones en la
diferenciación de
reacciones hemolíticas.
Peptona de soya: Alto
contenido de carbohidratos
y vitaminas; adecuada para
el cultivo de una gran
variedad de
microorganismos,
incluyendo hongos y
bacterias exigentes como
Clostridium y especies de
Neisseria.
Extracto de carne: se
obtiene a partir de carne
libre de grasa, predigerida
enzimáticamente. Libre de
carbohidratos
fermentables, lo que resulta
adecuado para la
preparación de medios de
cultivo destinados a la
realización de ensayos de
fermentación.
Extracto de levadura: Se
obtiene por extracción
acuosa de células de
levadura autolizadas;
presenta un alto contenido
de vitamina B, lo que
ofrece excelentes
condiciones de crecimiento
en medios de cultivo
diseñados para el
aislamiento de
Es selectivo para el
aislamiento y diferenciación
de Estafilococos a partir de
diversas muestras.
El medio base contiene
peptona, extracto de carne
y extracto de levadura, que
son la fuente de carbono,
azufre, nitrógeno, vitaminas
y minerales. El piruvato de
sodio y la glicina estimulan
selectivamente el
crecimiento de
Estafilococos. El cloruro de
litio y telurito actúan como
inhibidores de
microorgansimos
contaminantes.
Debido a la reducción
del telurito a teluro; el
Staphylococcus aureus
desarrolla colonias negras.
Las colonias de
Estafilococos
presentan dos
características:
Lipólisis y
proteolisis, por lo que
se observan halos
claros característicos
con un anillo opaco
dentro del mismo por
el contenido de yema
de huevo. La
reacción con la yema
de huevo y la
reducción del telurito
coinciden
prácticamente con la
prueba de la
coagulasa positiva.
Agar Eosina
y Azul de
Metileno
10g Peptona de
gelatina
5g Lactosa
5g Sacarosa
2g Fosfato
dipotásico
13.5g Agar
0.4g Eosina
0.065g Azul de
metileno
pH final 7.2±0.2
Es un medio
ligeramente selectivo y
diferencial para el
aislamiento de
microorganismos entéricos
a partir de diversas
muestras. Permite una
diferenciación muy clara
entre las colonias de
organismos fermentadores
de lactosa y aquellos que
no la fermentan; el
contenido de eosina y azul
de metileno inhiben en
cierto grado organismos
Gram positivos. La
presencia de sacarosa
permite para algunos
miembros del grupo
coliforme fermentarla con
más facilidad que la
lactosa.
Las colonias
lactosa positiva son
azules a moradas
con brillo metálico o
poseen centros
oscuros con
periferias
transparentes
incoloras y las que
son negativas en
lactosa o sacarosa,
se observan
incoloras o rosa
pálido transparentes
Agar Verde
Brillante
5g Peptona de
carne
3g Extracto de
levadura
5g Peptona de
caseína
5g Cloruro de
sodio
10g Lactosa
10g Sacarosa
0.08g Rojo fenol
Medio de cultivo
selectivo y diferencial para
el aislamiento de
Salmonella (excepto S.
typhi y Shigella) a partir de
diversas muestras.
La selectividad de este
medio se basa en la
concentración del verde
brillante, que inhibe
Las colonias
típicas de Salmonella
son translúcidas,
ligeramente rojas a
rosa con halo rojo
brillante.
Los organismos
fermentadores de
lactosa y/o sacarosa
que se desarrollan
0.0125g Verde
brillante
20g Agar
pH final 6.9±0.2
microorganismos exigentes
como Haemophilus y
Neisseria.
Cloruro de litio: inhibe el
crecimiento de bacilos
Gram negativos
fermentadores de lactosa,
mientras que otras
bacterias Gram positivas,
son inhibidas por el telurito
y la glicina
Cloruro de sodio:
mantiene el balance
osmótico
Lactosa: es el hidrato de
carbono fermentable
Sacarosa: Es un
carbohidrato purificado
elaborado especialmente
para su uso en medios de
cultivo bacteriológicos
como fuente de energía
para bacterias. La
capacidad de un
microorganismo de
fermentar la sacarosa es
una característica definitiva
para diferenciar géneros e
identificar especies.
Fosfato dipotasico: actúa
como regulador de pH del
medio de cultivo
Agar: Es un extracto seco,
procedente de algas
marinas que tienen la
propiedad de formar un gel.
Base para la preparación
de medios de cultivo.
Piruvato de sodio:
estimulantes del desarrollo
de estafilococos y ayudan a
la detección de estos
microorganismos presentes
en la muestra, aún en
pequeñas cantidades
Eosina, Azul de metileno,
Rojo fenol, Verde
brillante: Reactivos
químicos empleados como
inhibidores e indicadores
del pH
Infusión de Musculo
Cardiaco: Otorga al medio
un alto valor nutritivo
microorganismos Gram
positivos y parcialmente a
Gram negativos. La lactosa
y la sacarosa permiten
diferenciar la flora
acompañante que utiliza
estos carbohidratos, del
género Salmonella que no
los degrada.
en el medio se
diferencian
fácilmente por la
formación de
colonias amarillo
verdosas rodeadas
de una zona amarilla
verdosa intensa.
Agar Sangre
5g Extracto de
levadura
2g Infusión de
Músculo Cardiaco
(sólidos)
13g Peptona de
caseína
5g Cloruro de
sodio
15g Agar
pH final 7.3±0.2
Este medio de cultivo
adicionado de sangre de
carnero o conejo
desfibrinada estéril es
adecuado para el
aislamiento de bacterias a
partir de diversas muestras
y para investigar su
actividad hemolítica
La base de agar sangre
es un medio nutritivo en
donde la infusión de
músculo cardiaco y la
peptona, proporcionan las
fuentes de carbono,
nitrógeno, vitaminas y
factores de crecimiento.
En agar sangre,
nutritivo chocolate,
soya tripticasa, etc,
se ven colonias
pequeñas,
blanquecinas, de
forma circular,
bordes redondeados,
superficie lisa y
convexa. Algunas
cepas producen un
pigmento
carotenoide que les
da un color dorado
(S. aureus).
Agar de Soya
Tripticaseína
15g Peptona de
caseína
5g Peptona de
soya
5g Cloruro de
sodio
15g Agar
pH final 7.3±0.2
Se utiliza para cultivo
de microorganismos,
aislamiento y pruebas de
límite microbiano a partir de
diversas muestras. Útil
para conservación de
cepas microbianas. El
contenido de peptonas de
soya y caseína permiten el
desarrollo de una gran
variedad de
microorganismos tanto
aerobios como anaerobios.
Carece de carbohidratos
haciéndolo muy útil para
estudiar reacciones de
hemólisis y también en la
preparación de Agar
Chocolate. El cloruro de
sodio mantiene el equilibrio
osmótico
En agar sangre,
nutritivo chocolate,
soya tripticasa, etc,
se ven colonias
pequeñas,
blanquecinas, de
forma circular,
bordes redondeados,
superficie lisa y
convexa. Algunas
cepas producen un
pigmento
carotenoide que les
da un color dorado
(S. aureus).
1. Durante la práctica primero
se pesó la cantidad de agar
deshidratado de acuerdo a
la cantidad de agua
destilada que íbamos a
poner, en este caso 500ml
por lo tanto utilizamos 30g
de agar Baird – Parker
2. Después se depositó en un
matraz Erlenmeyer con un
poco del agua destinada
para la mezcla, y se agitó
hasta disolver el polvo,
después se agregó toda el
agua.
3. Se procedió a checar el pH
de la mezcla; en nuestro
caso el pH estaba en el
rango por lo que no tuvimos
que agregar ácido
clorhídrico ni hidróxido de
sodio
4. Se introdujo un agitador
magnético al matraz
5. Se procedió a calentar en un
plato caliente hasta llevarlo a
ebullición durante un minuto,
teniendo precaución de
retirarlo del fuego cuando la
espuma subía
6. Una vez ya bien disuelto el
agar, se puso en un frasco
schott para su esterilización
7. Ya esterilizado todo el
material incluyendo el agar,
se procedió a llevar el
material necesario a la
campana de flujo laminar
8. Con cuidado, se
desinfectaron los huevos y
un cuchillo este último
también se flameo previo a
la apertura de huevo y
separación de la yema
9. Se agregó solución salina al
85% y se emulsionó
10.Una vez que la temperatura
del agar alcanzó los 45–
50°C se agregó le agrego el
telurito
11.Se mezcló bien y se
procedió a añadir la
emulsión de yema de huevo
12.Una vez ya preparado se
pasó a porcionar en las cajas
Petri y se almacenó para su
cultivación en un futuro
DISCUSION DE RESULTADOS
En general toda la práctica se llevó a cabo sin ningún inconveniente, tuvimos una ejecución
bastante buena tomando en cuenta que es la primera vez que realizamos una práctica de este tipo y
utilizamos equipo nuevo que nunca habíamos utilizado con anterioridad.
A nuestro punto de vista, el resultado fue satisfactorio ya que lo preparamos con un cuidado
minucioso y siguiendo todas las indicaciones que se nos dieron. Si acaso tuvimos una única
observación negativa es que una de nosotras cuando estaba vaciando el medio a las cajas Petri,
tomó el frasco demasiado arriba en el pivote de forma que tuvo cierto contacto con la parte externa
del pivote, sin embargo no creemos que haya impactado de forma negativa el resultado ya que esto
sucedió dentro del área de la campana de flujo laminar por lo que en teoría el ambiente estaba
estéril en ese momento. Una forma de comprobar si hubo contaminación es observando que las
cajas Petri no hayan desarrollado colonias de bacterias cuando aún no se ha realizado la siembra ya
que de ser así, nuestro pequeño error tuvo consecuencias y esas consecuencias son que dicha caja
de Petri nos sería inservible para cultivar el tipo de bacterias que deseábamos cultivar.
CONCLUSIÓN
Aprendimos a identificar y a preparar los medios de cultivo más utilizados, los métodos que
se utilizan para llevar a cabo dicha preparación, así como los tipos de microorganismos que crecen
en estos medios. La preparación de medios de cultivo no solo es muy delicada sino que también es
un proceso tardado; se deben de seguir una serie de pasos con exactitud, precisión y siempre
teniendo cuidado de utilizar correctamente el equipo de laboratorio.
En éste laboratorio vamos a estar manejando bacterias por lo que debemos minimizar los
errores en la ejecución de la metodología para garantizar la inocuidad del material y de los reactivos
que estamos manipulando, ya que es muy fácil que nuestros medios de cultivo se infecten con
bacterias aerobias que no queremos aislar o estudiar. También aprendimos que las bacterias
necesitan un medio óptimo y que este a un pH adecuado por lo que no debemos dar por sentado
que el pH de nuestro medio de cultivo será el adecuado, sino que debemos verificarlo y en caso de
no ser así, hacer que este medio tenga el pH adecuado agregándole algún ácido o base según sea
el caso, también aprendimos a utilizar una olla de presión para la esterilización tanto del medio de
cultivo como del material. Hoy sabemos, gracias a esta práctica, que hay diferentes medios de
cultivo y que vamos a utilizarlos dependiendo del tipo de cultivo que se desee ya sea para cultivar
colonias de bacterias para un estudio general, o para aislar un tipo específico para un estudio más
particular, es esta selectividad la que lleva a nuestro equipo a tener cierto favoritismo por los medios
de cultivo enriquecidos, ya que nos agrada más la idea de investigar algo particular que algo
general.
BIBLIOGRAFÍA
Biología de los microorganismos – Michael T. Madigan, John Martinko, Jack Parker – Editorial
Pearson – Pag. 103 a la 110
Microbiología – K. Piatkin – Editorial Mir – Traducido por N. Arnaiz Planelles – Pag. 75 a la 91
Intro. a la Microbiología – Gerard J. Tortora – Editorial Medica Panamericana – Pag. 168 a la 182

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Preparación de Medios de Cultivo

  • 1. Universidad Autónóma de Queretaró Licenciatura en microbiología, Campus Aeropuerto Reporte de Practica #1: Preparación de Medios de Cultivo Laboratorio de Biodiversidad de los Microorganismos Profesora: Erika Beatriz Álvarez Hidalgo Equipo #9: Alma Marina Peralta Ruiz Rebeca Alejandra Oloarte Pulido Juana María López Martínez 4 de septiembre del 2013
  • 2. INTRODUCCIÓN Microorganismos de todo tipo abundan en la naturaleza, pero para efecto de este reporte solo vamos a referirnos a las bacterias las cuales se encuentran en todas partes e incluso algunas habitan en las superficies interior y exterior del cuerpo humano, éstos pueden ser microorganismos patógenos o bacterias que habitan en nosotros sin causar ninguna enfermedad, como parte de nuestra flora. Hasta 1882, los organismos microbianos se aislaron mediante la preparación de diluciones seriadas de las muestras en un medio líquido. En 1882, Walther Hesse y Angelina Fannie quienes trabajaban en el laboratorio del médico alemán Robert Koch desarrollaron agar para su uso como un agente solidificante en los medios de cultivo; así, los medios de cultivo que contienen agar proporcionan una superficie sólida para crecer y aislar una amplia variedad de microorganismos. Las bacterias crecen en prácticamente cualquier fuente de alimentación ecológica que proporcione carbono. En la naturaleza, las bacterias pueden descomponer sustancias sólidas e insolubles por la liberación de las enzimas en el sustrato en el que están creciendo. Así, estas sustancias se descomponen o se transforman en sustancias más simples en un proceso llamado digestión extracelular, ya que se lleva a cabo fuera de las células bacterianas. El agar es una cadena de polímero que comprende unidades de hidratos de carbono de la galactosa azúcar. El agar se disuelve en agua hirviendo y luego se deja enfriar para de esta forma ser gelificado a una temperatura de entre 34° C y 36° C, formando una masa gelatinosa que se mantiene firme incluso a temperaturas como los 65° C; Dicho agar también mantiene una resistencia considerable capaz de soportar las fuerzas de cizallamiento, por lo que los geles producidos conservan su firmeza en condiciones normales de laboratorio, alguien podría pensar que la gelatina tiene propiedades similares al agar en cuanto a gelificación se refiere, sin embargo la gelatina no es resistente al ataque de las enzimas bacterianas cuando por el contrario, el agar no se ve afectado por dichas enzimas y esto permite que se pueda preparar un medio de cultivo sin necesidad del uso de inhibidores de bacterias que en un momento dado podrían interferir con el crecimiento del organismo que queremos reproducir en el medio. Desde el desarrollo de la placa de agar en el laboratorio de Robert Koch, varios métodos se han utilizado para lograr una distribución uniforme del crecimiento bacteriano sobre o dentro del agar. OBJETIVO Aprender a elaborar medios de cultivo simples, enriquecidos y selectivos/diferenciales para el cultivo de microorganismos, destacando la importancia del calentamiento, pH, distribución, esterilización y almacenamiento adecuado y de esa manera, obtener las condiciones óptimas para el crecimiento microbiano en dicho medio de cultivo.
  • 3. MATERIALES Caldo Soya Tripticaseína (CST): Activar cepas 2 Huevos 1 probeta de 500 ml. Agar Soya Tripticaseína (AST): Estriar, extender y VP Telurito de potasio al 1% 6 matraces de 1000 ml. Agar Eosina Azul de Metileno (EMB): Estriar 50 ml. de Sangre desfibrilada 2 vasos precipitado de 250 ml. Agar Baird Parker (ABP): Extender 250 Cajas Petri desechables 5 frascos schott de 500 ml. Agar Sangre (AS): estriar 100 Tubos de 13x100 mm 8 charolas p/pesar o papel aluminio Agar Pseudomonas: estriar 1 Micropipeta de 10 mL 8 Espátulas Medio SIM: picadura (movilidad) 1 Micropipeta de 1 mL 6 Agitadores magnéticos Solución salina al .85% 1 caja de puntas p/micropipeta de 10 y de 1 ml. 1 potenciómetro 4 platos calientes 6 L de agua destilada 100 ml. de agua de llave estéril Cloro METODOLOGÍA Pasos para preparar un medio de cultivo sólido Baird – Parker (ABP) 1. Suspender 60g. de polvo para preparar agar Baird – Parker en un litro de agua purificada. 2. Mezclar perfectamente, checar que el pH de la mezcla este en el rango permitido 3. Calentar con agitación frecuente 4. Hervir durante un minuto hasta disolución completa 5. Distribuir y esterilizar a 121° C durante 15 minutos. 6. Enfriar a 45° C – 50° C 7. Adicionar 10 ml. (por litro) De solución estéril al 1 % de Telurito 8. Agregar 50 ml. (por litro) De emulsión de yema de huevo estéril. 9. Mezclar bien 10.Vaciar en placas Petri.
  • 4. Diagrama de flujo para la elaboración de un medio de cultivo sólido de Agar Baird – Parker (ABP) Inicio Establecer proporción de Agar Baird – Parker y agua destilada a preparar Adicionar medio a un matraz Erlenmeyer Adicionar la cantidad proporcional de agua destilada y agitar hasta deshacer grumos Pesar agar en balanza analítica El pH está dentro del rango Adicionar ácido clorhídrico o hidróxido de sodio Introducir un agitador magnético al matraz Calentar tapado en plato caliente con agitación constante Llevar a ebullición por un total de un minuto La espuma del líquido sube Retirar del fuego hasta que baje la espuma Esterilizar con olla de presión o autoclave a 121° C Desinfectar el huevo y un cuchillo Pasar a un frasco schott, etiquetar, cerrar (sin que sea a presión), poner cinta testigo Encender la campana de flujo laminar Material estéril y/o desinfectado Si Si Si No No No
  • 5. Llevar el material a la campana de flujo laminar para preparar la emulsión de yema de huevo Con ayuda del cuchillo abrir el huevo y separar la yema, ponerla en una probeta previamente esterilizada Agregar solución salina al 85% Emulsionar Checar la temperatura del frasco schott con el agar Baird – Parker ya esterilizado Temperatura aproximada 45° – 50°C Esperar a que tenga una temperatura templada Agregar 10ml de solución estéril a 1% de Telurito y 50ml de emulsión de yema de huevo (por litro) al agar ya esterilizado Esperar dentro de la campana de flujo laminar a que solidifique Verter el agar Baird – Parker ya completamente preparado en cajas Petri Está sólido Fin Tapar y almacenar para uso futuro Si Si Si No No
  • 6. RESULTADOS MEDIO DE CULTIVO COMPOSICIÓN MODO DE ACCIÓN DEL INGREDIENTE EMPLEO MORFOLOGÍA COLONIAL Agar Baird– Parker 10g Peptona de caseína 5g Extracto de carne 1g Extracto de levadura 5g Cloruro de litio 17g Agar 12g Glicina 10g Piruvato de sodio pH final 6.8±0.2 Peptona de caseína: Se recomienda para enriquecer medios para el cultivo de un gran número de bacterias de difícil crecimiento. Peptona de gelatina: Bajo contenido de cistina y triptófano; ausencia de carbohidratos; Promueve una respuesta típica y consistente de organismos no exigentes en sus requerimientos nutricionales. Peptona de carne: Usada para cultivos de organismos difíciles y aerobios, así como en formulaciones en la diferenciación de reacciones hemolíticas. Peptona de soya: Alto contenido de carbohidratos y vitaminas; adecuada para el cultivo de una gran variedad de microorganismos, incluyendo hongos y bacterias exigentes como Clostridium y especies de Neisseria. Extracto de carne: se obtiene a partir de carne libre de grasa, predigerida enzimáticamente. Libre de carbohidratos fermentables, lo que resulta adecuado para la preparación de medios de cultivo destinados a la realización de ensayos de fermentación. Extracto de levadura: Se obtiene por extracción acuosa de células de levadura autolizadas; presenta un alto contenido de vitamina B, lo que ofrece excelentes condiciones de crecimiento en medios de cultivo diseñados para el aislamiento de Es selectivo para el aislamiento y diferenciación de Estafilococos a partir de diversas muestras. El medio base contiene peptona, extracto de carne y extracto de levadura, que son la fuente de carbono, azufre, nitrógeno, vitaminas y minerales. El piruvato de sodio y la glicina estimulan selectivamente el crecimiento de Estafilococos. El cloruro de litio y telurito actúan como inhibidores de microorgansimos contaminantes. Debido a la reducción del telurito a teluro; el Staphylococcus aureus desarrolla colonias negras. Las colonias de Estafilococos presentan dos características: Lipólisis y proteolisis, por lo que se observan halos claros característicos con un anillo opaco dentro del mismo por el contenido de yema de huevo. La reacción con la yema de huevo y la reducción del telurito coinciden prácticamente con la prueba de la coagulasa positiva. Agar Eosina y Azul de Metileno 10g Peptona de gelatina 5g Lactosa 5g Sacarosa 2g Fosfato dipotásico 13.5g Agar 0.4g Eosina 0.065g Azul de metileno pH final 7.2±0.2 Es un medio ligeramente selectivo y diferencial para el aislamiento de microorganismos entéricos a partir de diversas muestras. Permite una diferenciación muy clara entre las colonias de organismos fermentadores de lactosa y aquellos que no la fermentan; el contenido de eosina y azul de metileno inhiben en cierto grado organismos Gram positivos. La presencia de sacarosa permite para algunos miembros del grupo coliforme fermentarla con más facilidad que la lactosa. Las colonias lactosa positiva son azules a moradas con brillo metálico o poseen centros oscuros con periferias transparentes incoloras y las que son negativas en lactosa o sacarosa, se observan incoloras o rosa pálido transparentes Agar Verde Brillante 5g Peptona de carne 3g Extracto de levadura 5g Peptona de caseína 5g Cloruro de sodio 10g Lactosa 10g Sacarosa 0.08g Rojo fenol Medio de cultivo selectivo y diferencial para el aislamiento de Salmonella (excepto S. typhi y Shigella) a partir de diversas muestras. La selectividad de este medio se basa en la concentración del verde brillante, que inhibe Las colonias típicas de Salmonella son translúcidas, ligeramente rojas a rosa con halo rojo brillante. Los organismos fermentadores de lactosa y/o sacarosa que se desarrollan
  • 7. 0.0125g Verde brillante 20g Agar pH final 6.9±0.2 microorganismos exigentes como Haemophilus y Neisseria. Cloruro de litio: inhibe el crecimiento de bacilos Gram negativos fermentadores de lactosa, mientras que otras bacterias Gram positivas, son inhibidas por el telurito y la glicina Cloruro de sodio: mantiene el balance osmótico Lactosa: es el hidrato de carbono fermentable Sacarosa: Es un carbohidrato purificado elaborado especialmente para su uso en medios de cultivo bacteriológicos como fuente de energía para bacterias. La capacidad de un microorganismo de fermentar la sacarosa es una característica definitiva para diferenciar géneros e identificar especies. Fosfato dipotasico: actúa como regulador de pH del medio de cultivo Agar: Es un extracto seco, procedente de algas marinas que tienen la propiedad de formar un gel. Base para la preparación de medios de cultivo. Piruvato de sodio: estimulantes del desarrollo de estafilococos y ayudan a la detección de estos microorganismos presentes en la muestra, aún en pequeñas cantidades Eosina, Azul de metileno, Rojo fenol, Verde brillante: Reactivos químicos empleados como inhibidores e indicadores del pH Infusión de Musculo Cardiaco: Otorga al medio un alto valor nutritivo microorganismos Gram positivos y parcialmente a Gram negativos. La lactosa y la sacarosa permiten diferenciar la flora acompañante que utiliza estos carbohidratos, del género Salmonella que no los degrada. en el medio se diferencian fácilmente por la formación de colonias amarillo verdosas rodeadas de una zona amarilla verdosa intensa. Agar Sangre 5g Extracto de levadura 2g Infusión de Músculo Cardiaco (sólidos) 13g Peptona de caseína 5g Cloruro de sodio 15g Agar pH final 7.3±0.2 Este medio de cultivo adicionado de sangre de carnero o conejo desfibrinada estéril es adecuado para el aislamiento de bacterias a partir de diversas muestras y para investigar su actividad hemolítica La base de agar sangre es un medio nutritivo en donde la infusión de músculo cardiaco y la peptona, proporcionan las fuentes de carbono, nitrógeno, vitaminas y factores de crecimiento. En agar sangre, nutritivo chocolate, soya tripticasa, etc, se ven colonias pequeñas, blanquecinas, de forma circular, bordes redondeados, superficie lisa y convexa. Algunas cepas producen un pigmento carotenoide que les da un color dorado (S. aureus). Agar de Soya Tripticaseína 15g Peptona de caseína 5g Peptona de soya 5g Cloruro de sodio 15g Agar pH final 7.3±0.2 Se utiliza para cultivo de microorganismos, aislamiento y pruebas de límite microbiano a partir de diversas muestras. Útil para conservación de cepas microbianas. El contenido de peptonas de soya y caseína permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos tanto aerobios como anaerobios. Carece de carbohidratos haciéndolo muy útil para estudiar reacciones de hemólisis y también en la preparación de Agar Chocolate. El cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico En agar sangre, nutritivo chocolate, soya tripticasa, etc, se ven colonias pequeñas, blanquecinas, de forma circular, bordes redondeados, superficie lisa y convexa. Algunas cepas producen un pigmento carotenoide que les da un color dorado (S. aureus).
  • 8. 1. Durante la práctica primero se pesó la cantidad de agar deshidratado de acuerdo a la cantidad de agua destilada que íbamos a poner, en este caso 500ml por lo tanto utilizamos 30g de agar Baird – Parker 2. Después se depositó en un matraz Erlenmeyer con un poco del agua destinada para la mezcla, y se agitó hasta disolver el polvo, después se agregó toda el agua. 3. Se procedió a checar el pH de la mezcla; en nuestro caso el pH estaba en el rango por lo que no tuvimos que agregar ácido clorhídrico ni hidróxido de sodio 4. Se introdujo un agitador magnético al matraz 5. Se procedió a calentar en un plato caliente hasta llevarlo a ebullición durante un minuto, teniendo precaución de retirarlo del fuego cuando la espuma subía 6. Una vez ya bien disuelto el agar, se puso en un frasco schott para su esterilización
  • 9. 7. Ya esterilizado todo el material incluyendo el agar, se procedió a llevar el material necesario a la campana de flujo laminar 8. Con cuidado, se desinfectaron los huevos y un cuchillo este último también se flameo previo a la apertura de huevo y separación de la yema 9. Se agregó solución salina al 85% y se emulsionó 10.Una vez que la temperatura del agar alcanzó los 45– 50°C se agregó le agrego el telurito 11.Se mezcló bien y se procedió a añadir la emulsión de yema de huevo 12.Una vez ya preparado se pasó a porcionar en las cajas Petri y se almacenó para su cultivación en un futuro
  • 10. DISCUSION DE RESULTADOS En general toda la práctica se llevó a cabo sin ningún inconveniente, tuvimos una ejecución bastante buena tomando en cuenta que es la primera vez que realizamos una práctica de este tipo y utilizamos equipo nuevo que nunca habíamos utilizado con anterioridad. A nuestro punto de vista, el resultado fue satisfactorio ya que lo preparamos con un cuidado minucioso y siguiendo todas las indicaciones que se nos dieron. Si acaso tuvimos una única observación negativa es que una de nosotras cuando estaba vaciando el medio a las cajas Petri, tomó el frasco demasiado arriba en el pivote de forma que tuvo cierto contacto con la parte externa del pivote, sin embargo no creemos que haya impactado de forma negativa el resultado ya que esto sucedió dentro del área de la campana de flujo laminar por lo que en teoría el ambiente estaba estéril en ese momento. Una forma de comprobar si hubo contaminación es observando que las cajas Petri no hayan desarrollado colonias de bacterias cuando aún no se ha realizado la siembra ya que de ser así, nuestro pequeño error tuvo consecuencias y esas consecuencias son que dicha caja de Petri nos sería inservible para cultivar el tipo de bacterias que deseábamos cultivar. CONCLUSIÓN Aprendimos a identificar y a preparar los medios de cultivo más utilizados, los métodos que se utilizan para llevar a cabo dicha preparación, así como los tipos de microorganismos que crecen en estos medios. La preparación de medios de cultivo no solo es muy delicada sino que también es un proceso tardado; se deben de seguir una serie de pasos con exactitud, precisión y siempre teniendo cuidado de utilizar correctamente el equipo de laboratorio. En éste laboratorio vamos a estar manejando bacterias por lo que debemos minimizar los errores en la ejecución de la metodología para garantizar la inocuidad del material y de los reactivos que estamos manipulando, ya que es muy fácil que nuestros medios de cultivo se infecten con bacterias aerobias que no queremos aislar o estudiar. También aprendimos que las bacterias necesitan un medio óptimo y que este a un pH adecuado por lo que no debemos dar por sentado que el pH de nuestro medio de cultivo será el adecuado, sino que debemos verificarlo y en caso de no ser así, hacer que este medio tenga el pH adecuado agregándole algún ácido o base según sea el caso, también aprendimos a utilizar una olla de presión para la esterilización tanto del medio de cultivo como del material. Hoy sabemos, gracias a esta práctica, que hay diferentes medios de cultivo y que vamos a utilizarlos dependiendo del tipo de cultivo que se desee ya sea para cultivar colonias de bacterias para un estudio general, o para aislar un tipo específico para un estudio más particular, es esta selectividad la que lleva a nuestro equipo a tener cierto favoritismo por los medios de cultivo enriquecidos, ya que nos agrada más la idea de investigar algo particular que algo general. BIBLIOGRAFÍA Biología de los microorganismos – Michael T. Madigan, John Martinko, Jack Parker – Editorial Pearson – Pag. 103 a la 110 Microbiología – K. Piatkin – Editorial Mir – Traducido por N. Arnaiz Planelles – Pag. 75 a la 91 Intro. a la Microbiología – Gerard J. Tortora – Editorial Medica Panamericana – Pag. 168 a la 182