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MEDICINA VETERINARIA UNIPAZ
MICROBIOLOGÍA GENERAL
Mic. Sandra Carolina Bermúdez
TECNICAS DE SIEMBRA
1. OBJETIVO
 Aplicar los fundamentos básicos correspondientes a las
técnicas de siembra usadas en el cultivo de
microorganismos.
2. MATERIALES Y EQUIPOS
 Cofia
 Tapabocas
 Guantes quirúrgicos
 Bata de laboratorio
 Asa de inoculación
 Medios de Cultivo
 Servilletas
 Pipeteador
 Tijeras
 Mechero de alcohol
 Alcohol Antiséptico
 Cabina de flujo laminar
 Incubadora
 Balanza
3. MARCO TEORICO
Uno de los elementos importantes para el estudio de
microorganismos, consiste en aislarlos y purificarlos a partir del
tejido o material en estudio. Para que se lleve a cabo este
proceso existen diferentes metodologías y la elección de
cualquiera de ellas dependerá del tipo de tejido, ya sea animal o
vegetal y del equipo que se dispone en el laboratorio.
3.1 TÉCNICAS DE RECUENTO BACTERIANO
Para el recuento de
microorganismos presentes en una
muestra de agua, suelo, aire,
alimento, cultivos, entre otros,
existen diferentes métodos o
técnicas: Algunas técnicas son
directas y permiten un recuento de
todas las células, tanto las vivas
como las muertas. Las medidas
directas incluyen los recuentos
directos al microscopio o recuento
electrónico, el recuento en placa, o
el cálculo del número más probable
(NMP).
Otras son medidas indirectas y miden una propiedad de la masa
de las células como son la turbidez, el peso seco, o una
actividad metabólica.
La técnica de siembra varia con el estado físico de la muestra es
importante considerar este aspecto en el momento de aplicar el
respectivo procedimiento:
a. Recuento de colonias o recuento estándar en placa. Se
basa en contar las colonias de microorganismos que se
desarrollan después de inocular en un medio de cultivo
adecuado e incubar a una temperatura y tiempo
determinados un volumen determinado de muestra. Se
utiliza para determinar el número de células aisladas o
microorganismos unicelulares viables como bacterias,
levaduras, también se utiliza para el conteo de esporas
fúngicas presentes en la muestra.
La muestra a inocular debe ser homogénea y no contener
conglomerados de células. Después de la incubación cada
microorganismo o célula viable formará una masa visible de
organismos, o sea una colonia. De esta manera el número
de colonias permitirá a su vez determinar el número de
organismos viables en la muestra sembrada. Se pueden
utilizar sistemas de siembra en superficie, o en profundidad.
Generalmente la muestra original se diluye para que el
número de colonias desarrolladas en la placa se encuentren
entre 30 y 300 colonias y así permitir un óptimo crecimiento
y facilitar la lectura. En primer lugar, la muestra se diluye
seriadamente, transfiriendo 1 ml de la muestra a 9 ml de
medio estéril y se mezclan adecuadamente. Este proceso
se repite hasta obtener una dilución apropiada en este
ejemplo, 1:100000 (10-5). Posteriormente se añade 0,1 ml a
una placa de agar nutritivo, bien extendiéndolo en la
superficie de la misma (método de extensión en placa) o
mezclándolo con el medio (método de vertido en placa). Las
placas se incuban y se recuentan las colonias que se
desarrollan. Debido a razones estadísticas, las placas
deben contener entre 30 y 300 colonias.
Cuando la muestra se diluye el cálculo del resultado se realiza
contando las colonias en aquellas placas que tengan entre 30 y
300, se promedia y se multiplica por el factor de dilución. Los
resultados se expresan en colonias por ml. Los resultados
también pueden expresarse en unidades formadoras de colonias
(UFC), el valor de UFC es un valor que expresa el número
relativo de microorganismos de un taxón determinado en un
volumen de un metro cúbico de muestra.
En el caso de alimentos el resultado se considera como un
indicador de las características higiénicas generales del alimento
Contador de Colonias
Para el recuento de colonias se emplean equipos que consiste
en una pantalla iluminada la cual posee una gran lente de
aumento; pueden ser: contadores de colonias en los cuales la
caja de Petri se ajusta en una plataforma y se ilumina por debajo
y al mismo tiempo la lente aumenta 1.5 veces el tamaño del
objeto. También existe un contador electrónico de colonias en el
cual la caja de Petri se ubica en una platina iluminada, luego se
presiona la varilla de cuenta y el número exacto de colonias se
proyecta instantáneamente en una pantalla digital.
Conteo celular directo
Recuento celular microscópico directo: Se basa en colocar un
volumen determinado de células sin fijar y realizar el conteo
utilizando microscopía de fase. Para ello se utiliza la cámara de
recuento de Petroff-Hauser o de Neubauer consistente en un
portaobjetos con una excavación de 0.02 mm de profundidad en
un área de 1 milímetro cuadrado, con una rejilla dividida en 25
cuadrados grandes los cuales a su vez se subdividen en 16
cuadrados de 4X4 o sea que la muestra se distribuye en 400
celdillas.
La muestra, se coloca en la excavación del portaobjeto y se
cubre con el cubreobjetos se deja reposar sobre la platina del
microscopio durante unos minutos, y se procede a contar el
número de células en varias celdillas (generalmente en 16,
equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el número
n de células observadas en esas 16 celdillas. El recuento celular
se calcula así: n x 25 x 50 x 1000 = concentración de células/ml.
Es un método muy rápido y sencillo pero no permite distinguir
células vivas inmóviles de células muertas. Se utiliza en
suspensiones concentradas
Recuento de células bacterianas utilizando sistemas
electrónicos del tipo Coulter Counter. El método consiste en
colocar en una cámara del contador un volumen determinado
del cultivo (suspensión bacteriana) luego se hace pasar a través
un tubo capilar entre dos polos de una corriente eléctrica a otra
cámara. El poro un pequeño orificio de unos 15 µm de diámetro
forma parte de un circuito eléctrico, de manera que cada vez
que pasa una célula a través del mismo, la conductividad del
circuito disminuye y la presencia de la célula es detectada
electrónicamente en el contador.
Turbidez
Se basa en la medida de la turbidez de los medios de cultivo en
los que crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es
proporcional a la masa de las células en suspensión y su
medida nos permite estimarla. Para ello se utiliza un
espectrofotómetro que mide la cantidad de luz que transmite una
solución o un cultivo líquido de células microbianas. A mayor
masa de células en un cultivo, mayor será su turbidez, y menor
la cantidad de luz que se transmitirá de manera que la lectura en
el espectrofotómetro será mayor. Se utiliza en cultivos densos.
Permite medir el crecimiento de poblaciones. Para medir la
masa o el número de células con un espectrofotómetro, se debe
preparar una curva patrón, o gráfica en la que se relacionan las
medidas del espectrofotómetro con la masa celular o el número
de células en un cultivo de un determinado y se expresa en
unidades de absorbancia.
4. METODOLOGÍA
1. DILUCIONES SERIADAS
 Pese 10 gr de la muestra que va analizar y deposítela en el
erlenmeyer con 90 ml de agua peptona. Homogenice.
 Tome 1 ml de la suspensión suministrada
Realice las diluciones: 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000 con
solución salina estéril o agua peptona estéril.
Del tubo uno sacar 1 ml y adicionarlo al tubo 2, agitar.
 Del tubo dos sacar 1 ml y adicionarlo al tubo 3, agitar.
 De cada dilución tome 0.1 ml y agréguelos a la caja de petri
 Realizando un movimiento circular, homogenice en sentido
de las agujas de reloj para dispersar todo el contenido
agregado.
 Incube por 24 - 48 horas a 37 +/- 2°C
 Observe la morfología de las colonias a nivel microscópico y
descríbalas según: Tamaño, color y forma.
2. SIEMBRA EN PLACA
a. Siembra en Superficie o Siembra en placa con asa
Digralsky: Esta técnica suele utilizarse para el recuento de
viables.
 Adicione al medio sólido un inóculo de 0.1 ml, con la
pipeta graduada estéril.
 Homogenice seguidamente con el asa Digralsky.
b. Siembra en profundidad o por vertido en placa:
c. Siembra por agotamiento en estría:
Se toma con el asa de siembra previamente flameada una
cantidad adecuada de la muestra problema depositando el
inóculo en uno de los extremos superiores de la placa, a partir
de ahí se realizarán movimientos en zig-zag desde un extremo
de la placa al otro, ojo! no tomar en ningún momento un nuevo
inóculo y no levantar el asa hasta acabar de sembrar toda la
placa.
d. Siembra por agotamiento:
Tome de la muestra problema con el asa de siembra
previamente flameada el inóculo, deposítelo en el extremo
superior de la placa, extendiéndose de un extremo al otro sólo
de la parte superior.
Gire ligeramente la placa y se vuelve a repetir el mismo
procedimiento hasta el otro extremo de la placa arrastrando la
muestra como en el caso anterior siguiendo la misma dirección
hasta repetir la operación unas 4 o 5 veces que son las que
tiene cavidad la placa, haciendo que el último tramo se efectuará
hacia el interior de la placa. El resultado será que las colonias
estarán cada vez mas separadas como consecuencia de que
cada vez se va arrastrando y separando mas la muestra. Es
importante que para separar estas colonias se realice un
flameado en cada estría.
e. Técnica de los cuatro cuadrantes
Con un rotulador en la base de la placa, dibuje dos líneas
perpendiculares que se
crucen en el centro de la
placa de tal forma que se
divida en cuatro
cuadrantes iguales.
Tome con el asa de
siembra una cantidad de
inóculo y se adiciona en
el extremo superior de uno de ellos extendiéndose por todo ese
cuadrante en forma de zig-zag. La diferencia con la técnica de
agotamiento es que aquí no hay que flamear el asa a la hora de
pasar por cada cuadrante. Seguir un orden de tal forma que se
irá arrastrando el microorganismo problema, observando en el
último las colonias más separadas.
3. SIEMBRA EN TUBOS
a. Siembra en tubo por estrías
Tome con el asa de siembra una cantidad de muestra, se añade
al tubo desde el fondo en zig-zag hasta completar toda su
superficie. Se utiliza para conservar muestras durante largos
periodos.
b. Siembra por punción
Tome con asa de hilo de siembra, e introduzca el asa en el
medio de cultivo que hay en el tubo hasta el fondo y en posición
central. Esta técnica se utiliza para medios de cultivo
semisólidos.
Siembra por punción y estría: Consiste en dos tipos de
siembras en una sola. Primero se realiza la siembra por
picadura y luego la siembra por estría.

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Tecnicas de siembra

  • 1. MEDICINA VETERINARIA UNIPAZ MICROBIOLOGÍA GENERAL Mic. Sandra Carolina Bermúdez TECNICAS DE SIEMBRA 1. OBJETIVO  Aplicar los fundamentos básicos correspondientes a las técnicas de siembra usadas en el cultivo de microorganismos. 2. MATERIALES Y EQUIPOS  Cofia  Tapabocas  Guantes quirúrgicos  Bata de laboratorio  Asa de inoculación  Medios de Cultivo  Servilletas  Pipeteador  Tijeras  Mechero de alcohol  Alcohol Antiséptico  Cabina de flujo laminar  Incubadora  Balanza 3. MARCO TEORICO Uno de los elementos importantes para el estudio de microorganismos, consiste en aislarlos y purificarlos a partir del tejido o material en estudio. Para que se lleve a cabo este proceso existen diferentes metodologías y la elección de cualquiera de ellas dependerá del tipo de tejido, ya sea animal o vegetal y del equipo que se dispone en el laboratorio. 3.1 TÉCNICAS DE RECUENTO BACTERIANO Para el recuento de microorganismos presentes en una muestra de agua, suelo, aire, alimento, cultivos, entre otros, existen diferentes métodos o técnicas: Algunas técnicas son directas y permiten un recuento de todas las células, tanto las vivas como las muertas. Las medidas directas incluyen los recuentos directos al microscopio o recuento electrónico, el recuento en placa, o el cálculo del número más probable (NMP). Otras son medidas indirectas y miden una propiedad de la masa de las células como son la turbidez, el peso seco, o una actividad metabólica. La técnica de siembra varia con el estado físico de la muestra es importante considerar este aspecto en el momento de aplicar el respectivo procedimiento: a. Recuento de colonias o recuento estándar en placa. Se basa en contar las colonias de microorganismos que se desarrollan después de inocular en un medio de cultivo adecuado e incubar a una temperatura y tiempo determinados un volumen determinado de muestra. Se utiliza para determinar el número de células aisladas o microorganismos unicelulares viables como bacterias, levaduras, también se utiliza para el conteo de esporas fúngicas presentes en la muestra. La muestra a inocular debe ser homogénea y no contener conglomerados de células. Después de la incubación cada microorganismo o célula viable formará una masa visible de organismos, o sea una colonia. De esta manera el número de colonias permitirá a su vez determinar el número de organismos viables en la muestra sembrada. Se pueden utilizar sistemas de siembra en superficie, o en profundidad. Generalmente la muestra original se diluye para que el número de colonias desarrolladas en la placa se encuentren entre 30 y 300 colonias y así permitir un óptimo crecimiento y facilitar la lectura. En primer lugar, la muestra se diluye seriadamente, transfiriendo 1 ml de la muestra a 9 ml de medio estéril y se mezclan adecuadamente. Este proceso
  • 2. se repite hasta obtener una dilución apropiada en este ejemplo, 1:100000 (10-5). Posteriormente se añade 0,1 ml a una placa de agar nutritivo, bien extendiéndolo en la superficie de la misma (método de extensión en placa) o mezclándolo con el medio (método de vertido en placa). Las placas se incuban y se recuentan las colonias que se desarrollan. Debido a razones estadísticas, las placas deben contener entre 30 y 300 colonias. Cuando la muestra se diluye el cálculo del resultado se realiza contando las colonias en aquellas placas que tengan entre 30 y 300, se promedia y se multiplica por el factor de dilución. Los resultados se expresan en colonias por ml. Los resultados también pueden expresarse en unidades formadoras de colonias (UFC), el valor de UFC es un valor que expresa el número relativo de microorganismos de un taxón determinado en un volumen de un metro cúbico de muestra. En el caso de alimentos el resultado se considera como un indicador de las características higiénicas generales del alimento Contador de Colonias Para el recuento de colonias se emplean equipos que consiste en una pantalla iluminada la cual posee una gran lente de aumento; pueden ser: contadores de colonias en los cuales la caja de Petri se ajusta en una plataforma y se ilumina por debajo y al mismo tiempo la lente aumenta 1.5 veces el tamaño del objeto. También existe un contador electrónico de colonias en el cual la caja de Petri se ubica en una platina iluminada, luego se presiona la varilla de cuenta y el número exacto de colonias se proyecta instantáneamente en una pantalla digital. Conteo celular directo Recuento celular microscópico directo: Se basa en colocar un volumen determinado de células sin fijar y realizar el conteo utilizando microscopía de fase. Para ello se utiliza la cámara de recuento de Petroff-Hauser o de Neubauer consistente en un portaobjetos con una excavación de 0.02 mm de profundidad en un área de 1 milímetro cuadrado, con una rejilla dividida en 25 cuadrados grandes los cuales a su vez se subdividen en 16 cuadrados de 4X4 o sea que la muestra se distribuye en 400 celdillas. La muestra, se coloca en la excavación del portaobjeto y se cubre con el cubreobjetos se deja reposar sobre la platina del microscopio durante unos minutos, y se procede a contar el número de células en varias celdillas (generalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el número n de células observadas en esas 16 celdillas. El recuento celular se calcula así: n x 25 x 50 x 1000 = concentración de células/ml. Es un método muy rápido y sencillo pero no permite distinguir células vivas inmóviles de células muertas. Se utiliza en suspensiones concentradas Recuento de células bacterianas utilizando sistemas electrónicos del tipo Coulter Counter. El método consiste en colocar en una cámara del contador un volumen determinado del cultivo (suspensión bacteriana) luego se hace pasar a través un tubo capilar entre dos polos de una corriente eléctrica a otra cámara. El poro un pequeño orificio de unos 15 µm de diámetro forma parte de un circuito eléctrico, de manera que cada vez que pasa una célula a través del mismo, la conductividad del circuito disminuye y la presencia de la célula es detectada electrónicamente en el contador. Turbidez Se basa en la medida de la turbidez de los medios de cultivo en los que crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es proporcional a la masa de las células en suspensión y su medida nos permite estimarla. Para ello se utiliza un espectrofotómetro que mide la cantidad de luz que transmite una solución o un cultivo líquido de células microbianas. A mayor masa de células en un cultivo, mayor será su turbidez, y menor la cantidad de luz que se transmitirá de manera que la lectura en el espectrofotómetro será mayor. Se utiliza en cultivos densos. Permite medir el crecimiento de poblaciones. Para medir la masa o el número de células con un espectrofotómetro, se debe preparar una curva patrón, o gráfica en la que se relacionan las medidas del espectrofotómetro con la masa celular o el número de células en un cultivo de un determinado y se expresa en unidades de absorbancia. 4. METODOLOGÍA 1. DILUCIONES SERIADAS  Pese 10 gr de la muestra que va analizar y deposítela en el erlenmeyer con 90 ml de agua peptona. Homogenice.  Tome 1 ml de la suspensión suministrada Realice las diluciones: 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000 con solución salina estéril o agua peptona estéril.
  • 3. Del tubo uno sacar 1 ml y adicionarlo al tubo 2, agitar.  Del tubo dos sacar 1 ml y adicionarlo al tubo 3, agitar.  De cada dilución tome 0.1 ml y agréguelos a la caja de petri  Realizando un movimiento circular, homogenice en sentido de las agujas de reloj para dispersar todo el contenido agregado.  Incube por 24 - 48 horas a 37 +/- 2°C  Observe la morfología de las colonias a nivel microscópico y descríbalas según: Tamaño, color y forma. 2. SIEMBRA EN PLACA a. Siembra en Superficie o Siembra en placa con asa Digralsky: Esta técnica suele utilizarse para el recuento de viables.  Adicione al medio sólido un inóculo de 0.1 ml, con la pipeta graduada estéril.  Homogenice seguidamente con el asa Digralsky. b. Siembra en profundidad o por vertido en placa: c. Siembra por agotamiento en estría: Se toma con el asa de siembra previamente flameada una cantidad adecuada de la muestra problema depositando el inóculo en uno de los extremos superiores de la placa, a partir de ahí se realizarán movimientos en zig-zag desde un extremo de la placa al otro, ojo! no tomar en ningún momento un nuevo inóculo y no levantar el asa hasta acabar de sembrar toda la placa. d. Siembra por agotamiento: Tome de la muestra problema con el asa de siembra previamente flameada el inóculo, deposítelo en el extremo superior de la placa, extendiéndose de un extremo al otro sólo de la parte superior. Gire ligeramente la placa y se vuelve a repetir el mismo procedimiento hasta el otro extremo de la placa arrastrando la muestra como en el caso anterior siguiendo la misma dirección hasta repetir la operación unas 4 o 5 veces que son las que tiene cavidad la placa, haciendo que el último tramo se efectuará hacia el interior de la placa. El resultado será que las colonias estarán cada vez mas separadas como consecuencia de que cada vez se va arrastrando y separando mas la muestra. Es importante que para separar estas colonias se realice un flameado en cada estría. e. Técnica de los cuatro cuadrantes Con un rotulador en la base de la placa, dibuje dos líneas perpendiculares que se crucen en el centro de la placa de tal forma que se divida en cuatro cuadrantes iguales. Tome con el asa de siembra una cantidad de inóculo y se adiciona en
  • 4. el extremo superior de uno de ellos extendiéndose por todo ese cuadrante en forma de zig-zag. La diferencia con la técnica de agotamiento es que aquí no hay que flamear el asa a la hora de pasar por cada cuadrante. Seguir un orden de tal forma que se irá arrastrando el microorganismo problema, observando en el último las colonias más separadas. 3. SIEMBRA EN TUBOS a. Siembra en tubo por estrías Tome con el asa de siembra una cantidad de muestra, se añade al tubo desde el fondo en zig-zag hasta completar toda su superficie. Se utiliza para conservar muestras durante largos periodos. b. Siembra por punción Tome con asa de hilo de siembra, e introduzca el asa en el medio de cultivo que hay en el tubo hasta el fondo y en posición central. Esta técnica se utiliza para medios de cultivo semisólidos. Siembra por punción y estría: Consiste en dos tipos de siembras en una sola. Primero se realiza la siembra por picadura y luego la siembra por estría.