theoretical background and tutorial for oligonucleotides design

1. • La PCR es un método para amplificar un segmento
particular de ADN
• Amplificación= hacer múltiples copias de un
determinado segmento de ADN
• La PCR puede producir billones de copias de una
secuencia target de DNA en unas pocas horas
• La PCR fue inventado en 1984 como un método de
producir numerosas copias de fragmentos de ADN en el
laboratorio
• Sus aplicaciones son amplísimas y el PCR es ahora un
pilar fundamental de la Biología Molecular

2. Kary Mullis
inventa la
Reacción de la
Cadena de la
Polimerasa in
vitro

3. Replicación del ADN vs. PCR
• PCR es una “falsificación” en laboratorio
de la replicación celular del ADN
La versión de laboratorio versión es comúnmente
conocida como “in vitro” puesto que la reacción
ocurre en un tubo, mientras que “in vivo” significa
que ocurre en un entorno celular.

4. Replicación Celular del ADN
(in vivo)
• La replicación del ADN es la
duplicación semiconservativa
de la cadena de ADN
• Típicamente, el proceso
celular de replicación demora
sólo unas pocas horas.
• La replicación de ADN es
semiconservativa (una hebra
del ADN es usada como
molde para la síntesis de una
nueva hebra de ADN)
• Este proceso ocurre con una
tasa de error muy baja (en
promedio 1X 10 -9)
• Aproximadamente una docena
de enzimas participan en la
replicación del ADN

5. Enzimas clave en la Replicación del
ADN
• DNA Polimerasa
• DNA Ligasa
• Primasa
• Helicasa
• Topoisomerasa
• Proteína de unión a la hebra

6. Enzimas de Replicación del ADN:
ADN Polimerasa
• cataliza la elongación del ADN mediante la
adición de nucleótidos trifosfatos al extremo 3’
de la cadena en elongación.
• Un nucleotido trifosfato es 1 azúcar + 1 base + 3 fosfatos
• Cuando un nucleotido trifosfato se une a la hebra de ADN, dos
fósforos son liberados (pirofosfatos).
• La ADN polimerasa sólo puede agregar
nucleótidos al extremo 3’ de la cadena en
elongación

7. Complementariedad de bases del ADN
• El ADN es una doble hélice de polinucleotidos, con una
columna vertebral de pentosas fosfatadas al exterior de
la hélice.
• Las dos hebras de ADN se mantienen unidas por los enlaces de
puente hidrógeno existentes entre los pares de bases nitrogenadas.
• La base nitrogenada adenina sólo se aparea con timina.
• La base nitrogenada guanina sólo se aparea con citosina.
• Durante la replicación, una vez que las hebras de ADN se han
separado, la ADN polimerasa usa cada hebra como un molde para
sintetizar nuevas hebras de ADN con el preciso y complementario
orden de nucleótidos.

8. PCR: la versión in vitro de la Replicación del
ADN
Los siguientes componentes son obligatorios para
producir una PCR en el laboratorio:
1) ADN (muestra de ADN que contiene la secuencia de
interés que queremos copiar)
2) Una DNA polimerasa termoestable (la Taq Polimerasa)
3) Los 4 nucleótidos trifosfatados
4) Soluciones tampón
5) 2 segmentos cortos, de una sola hebra de ADN, que sirven
como cebadores
6) Tubos de pared delgada
7) Termociclador (una maquina que que puede generar
gradientes de temperatura drásticamente en periodos de
tiempo muy cortos)

9. PCR
La muestra de ADN, la
ADN polimerasa, el
tampón, los nucleótidos
trifosfatados y los
cebadores son vertidos en
tubos de paredes delgadas
y éstos son puestos en un
termociclador de PCR.
Termociclador de PCR

10. Los 3 pasos principales de la
PCR
• El fundamento de la PCR son los cambios de temperatura y el efecto que
estos gradientes producen en el ADN.
• En una reacción PCR, la siguiente serie de pasos es repetida en un rango
de 20-40 ciclos
(nota: 25 ciclos duran 2 horas en promedio y resultan en la amplificación
del fragmento de interés 100,000 veces)
Paso 1: Denaturación del ADN
A 95C, el ADN es desnaturalizado (las 2 hebras se separan)
Paso 2: Hibridización de los Cebadores o Primers
A 40C- 65C, los primers se hibridizan (o se unen) complementariamente
a las secuencias de ambas hebras del ADN
Paso 3: La ADN polimerasa EXTIENDE la cadena de ADN
A 72C, la ADN Polimerasa extiende la cadena de ADN adicionando
nucleótidos al extremo 3´de los primers.

11. ADN Polimerasa Termoestable
• Dado que la PCR implica la aplicación de
temperaturas muy altas, es imperativo que una
ADN polimerasa muy estable térmicamente sea
usada en la reacción.
• La mayoría de las ADN polimerasas se desnaturalizarían (y
por lo tanto no podrian funcionar apropiadamente) con las
altas temperaturas de los pasos de la PCR.
• La Taq DNA polymerasa fue purificada a partir
de la bacteria de aguas termalesThermus
aquaticus in 1976
• La Taq tiene su temperatura optima a 75 C -80
C, y reduce sustancialmente su actividad a
bajas temperaturas.

12. Hibridación de los Cebadores
5'
5'3'
3'
target DNA
Ciclos Subsecuentes de PCR
5'
5'3'
3' DNA de doble hebra
Desnaturalización
5'
5'3'
3'
Extension3'
5'
5'
5'
5'3'
3'
3'
3'
5'
5'
5'
5'3'
3'
3'
Extensión
PCR Ciclo 1
DNA polimerasa siempre agrega nucleotidos
al extremo 3’ del cebador

13. El Tamaño del Fragmento de ADN
Producido en la PCR Depende de los
Cebadores
• La reacción PCR amplificará la sección de ADN entre los dos
primers
• Si la secuencia de ADN es conocida, los primers pueden ser
desarrollados para amplificar cualquier pieza de ADN de un
organismo.
Forward primer
Reverse primer
Tamaño del fragmento amplificado

14. 72 0C – extensión de la ADN polimerasa
94 0C - desnaturalización
Temperature 0C
Control de Temperatura en un Termociclador
94 0C - desnaturalización
50 – 70 0C – hibridación de los primers

15. El fragmento de interés del ADN es
amplificado a la potencia 2 por
cada ciclo de PCR
por ejemplo, si sometemos la muestra de interés de ADN a 5
ciclos de PCR, obtendremos 25 (or 64) copias de ADN.
Similarmente, si sometemos la muestra de ADN a 40 ciclos
de PCR, obtendremos 240 copias de ADN
1,099,511,627,776

16. La PCR se ha convertido en una poderosa
herramienta de la biología molecular
• Con una sola célula espermática o de cabello se
puede amplificar suficiente ADN para realizar un
análisis y producir bandas diferenciadas en el
gel de agarosa.
• Se pueden amplificar fragmentos de interés en
el ADN de un organismo escogiendo los
cebadores apropiados.
• Se puede usar la selectividad de los cebadores
para identificar la probabilidad de que un
individuo sea portador de un particular alelo de
un gen.

17. Qué son los cebadores o primers
• Los primers de PCR son moléculas cortas de
una sola hebra de ADN (15-40 bp)
• Son manufacturados comercialmente y pueden
diseñarse para complementarse con cualquier
secuencia de ADN.
• Los primers son secuencias específicas, y se
ligarán a una secuencia deseada de ADN
• Mientras más largos sean los primers, mayor su
especificidad y selectividad (15 → 40 bp).
• La ADN polimerasa requiere primers para iniciar
la replicación.

18. Selectividad de los Primers
• Los primers se ligan a su secuencia
complementaria en el ADN target
– Un primer compuesto de sólo 3 letras, ACC, por
ejemplo, tiene una alta probabilidad de encontrar su
complemento en un genoma -más de una vez-
– A medida que el cebador crece en nucleótidos, la
probabilidad de que ,por ejemplo, una secuencia de
35 letras encuentre repetidamente una sección
complementaria en el ADN target -se vuelve más
remota.

19. Probabilidad de Complementariedad
en Primers
Arrojando la Moneda
La probabilidad de a cara (H) o a cruz (T) es siempre 0.5 para cada
vez que arrojamos la moneda. Cuál es la probabilidad de obtener esta
combinación de cruces en una serie?
Evento Probabilidad
T 0.5 = 0.5
T,T 0.5 x 0.5 = 0.25
T,T,T 0.5 x0.5 x 0.5 = 0.125
T,T,T,T,T (0.5)5 = 0.03125
T,T,T,T,T,T,T,T,T,T,T (0.5)11 = 0.0004883
T,T,T,T,T,T,T,T,T,T,T,T,T,T,T,T (0.5)16 =0.00001526
De tal manera se vuelve cada vez menos probable obtener 16 cruces en una
serie(1 posibilidad in 65536 veces). De la misma manera,a medida que el
primer incrementa en tamaño las probabilidades de una complementariedad
extra aparte de la buscada es altamente improbable.

20. Probabilidad en Genética
• Hay 4 bases en la molécula de ADN: A,C,G,T
• La probabilidad de encontrar cualquiera de estas bases en el codigo es 0.25
(1/4)
• Ahora calculemos la probabilidad de encontrar una determinada secuencia de
bases
Evento Probabilidad
A 0.25 = 0.25
A,T 0.25 x 0.25 = 0.0625
A,T,A 0.25 x0.25 x 0.25 = 0.015625
A,T,A,G,G (0.25)5 = 0.0009765
A,T,A,G,G,T,T,T,A,A,C (0.25)11 = 0.000002384
A,T,A,G,G,T,T,T,A,A,C,C,T,G,G,T (0.25)16 =0.0000000002384
De tal manera, se vuelve cada vez menos probable que una secuencia de 16
bases (1 probabilidad en 4300 millones) encuentra más de una zona
complementaria.De la misma manera, a medida que el primer incrementa su
tamaño, la probabilidad de que se ligue a una zona diferente de la esperada
es altamente improbable

21. • Una temperatura de fusión (Tm) en el
rango de 52 ºC a 65 ºC
• Que no tiendan a formar dímeros
• Que no formen horquillas(>3 bp)
• Que no se liguen a sitios secundarios.
• Baja afinidad específica en el extremo 3' (
un bajo contenido de GC content para
evitar exceso de afinidad no
complementaria)

22. Sólo puede haber UNA zona complementaria en el DNA donde el
primer se ligue, lo cual significa que la secuencia del
oligonucleótido debe ser irrepetible
Tampoco debe haber sitios de hibridación en fuentes posibles de
contaminación, tales como: humano, rata, ratón, etc.
Primer candidate 1 5’-TGCTAAGTTG-3’
Primer candidate 2 5’-CAGTCAACTGCTAC-3’
TGCTAAGTTG CAGTCAACTGCTAC
5’...TCAACTTAGCATGATCGGGTA...GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA...3
’
No específico!
Específico
TGCTAGTTG
A

23. La longitud del oligonucleótido influencia en su especificidad y temperatura
de hibridación . En resumen: mientras más largo sea el primer, mayor será
su especificidad pero tambien será mayor su temperatura de hibridación.,
El primer tendrá como mínimo 15 bases para asegurar su especificidad.
Normalmente los primers están en el rango de 17-28 bases de longitud.

24. La composición de bases afecta la especificidad de la hibridación asi
como su temperatura.
• Composición aleatoria de bases es lo mejor. Evitar primers con
secuencias de conformacion GCGCGC o ATATAA
• Un contenido de (G+C) en el rango de 50-60% nos proporcionará
una buena temperatura de hibridación. melting/annealing
temperature for ordinary PCR reactions, and will give appropriate
hybridization stability. However, melting/annealing temperature and
hybridization stability are affected by other factors, which we’ll
discuss later. Therefore, (G+C) content is allowed to change.
Secuencia DNA
5’...TCAACTTAGCATGATCGGGCA...AAGATGCACGGGCCTGTACACAA...3’
TGCCCGATCATGCT

25. La temperatura de fusión, Tm – es la temperatura
a la cual la mitad de las hebras de DNA están
denaturalizadas y la otra mitad formando duplexes..
La Tm es característica de la composición de DNA ;
Un alto contenido de G+C contenido de DNA posee
una Tm debido a que poseen tripes puentes de
Hidrógeno.
Cálculo
Tm= (wA+xT) * 2 + (yG+zC) * 4

26. La temperatura de hibridación se calcula usando la temperatura
de fusión de los oligonucleótidos. En promedio es:

27. Si los primers son complementarios entre si, y se hibridan entre
ellos en lugar de hibridarze con el DNA muestra, la eficiencia de la
PCR se verá afectada drásticamente.
Sin embargo, estas potenciales estructuras secundarias no se
presentan debido a que la temperatura de hibridación no les permite
formarse. Por ejemplo, los dimeros y horquillas se forman a 30 C
pero en la PCR cycle, la temperatura más baja es de 60 C.

28. Los primers trabajan en parejas – forward primer y reverse primer-.
Puesto que son usados en la reacción de PCR , debemos asegurarnos
de que las condiciones de temperatura de la PCR trabajen para AMBOS.
Un tema muy importante es su temperatura de hibridación. Que debe ser
mutuamente compatible. La máxima diferencia permisible en la
temperatura de dos primers es de 3 C. Mientras menor sea su diferencia
en Tanneal, mejor para nosotros.

29. En resumen: ¿cuándo un
oligonucleótido es un buen cebador?
5’ 3’
5’
5’
5’
3’
3’
3’

30. 1. Especificidad: asegurar que la secuencia complementaria sea
única;
2. Longitud: 17-28 bases.Este rango esta sujeto a variación;
3. Composición de bases: el contenido promedio (G+C) en el
rango 50-60%; evitar regiones ricas en secuencias (A+T) y
(G+C) ;
4. Optimizar el emparejamiento de bases: es importante que la
estabilidad del extremo 5’ sea alta y la del 3’ sea baja para
evitar “falsa” hibridación.
5. La Tm en el rango de 55-70 C;
6. LosTm de los primers no deben diferenciarse más de 2 – 3 C
entre sí.
7. Minimizar la posibilidad de formación de estructuras
secundarias: horquillas y dímeros deben evitarse.

31. Diseño de primers usando
plataformas
Algunas plataformas disponibles:
- Oligo: Life Science Software, standalone application
- GCG: Accelrys, ICBR mantiene el servidor.
- Primer3: MIT, standalone / web application
http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi
- BioTools: BioTools, Inc. ICBR distribuye la licencia..
- Otros: GeneFisher, Primer!, Web Primer, NBI oligo program, etc.
Para calcular temperatura de fusión:
http://www.promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm

32. Ejercicio
Diseñar primers para la secuencia “NM_203378” en NCBI
GenBank, para que la secuencia de mioglobina humana sea
amplificada usando PCR .
Entre 156..620

33. Primer3
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

34. Primer3

35. Primer3

36. • Múltiples pares de oligonucleótidos se
agregan al Master Mix.
• Asi se amplifican multiples sitios- en una
sola reacción PCR.
• Se usa para identificación genómica.
• Retos:
– Los Tm deben ser muy cercanos.
– Evitar los dímeros potenciales.

37. Primers tambien pueden diseñarse para amplificar productos
múltiples. Se les llama “primers universales”. Se usan para
amplificar genes, design primers to amplify genes del Virus del
Papilloma Humano.
Estrategia:
1. Alinear grupos de secuencias que queremos amplificar.
2. Identificar las zonas conservativas en los extremos 5’ y 3’ .
3. Diseñar “forward primer”en la región 5’.
4. Diseñar “reverse primer” en la región 3
5. Asegurar la especificdad en todas las secuencias.
6. Hacer un BLAST de los primers en potenciales contaminantes.