SlideShare una empresa de Scribd logo

Diseño primers

theoretical background and tutorial for oligonucleotides design

1 de 37
• La PCR es un método para amplificar un segmento
particular de ADN
• Amplificación= hacer múltiples copias de un
determinado segmento de ADN
• La PCR puede producir billones de copias de una
secuencia target de DNA en unas pocas horas
• La PCR fue inventado en 1984 como un método de
producir numerosas copias de fragmentos de ADN en el
laboratorio
• Sus aplicaciones son amplísimas y el PCR es ahora un
pilar fundamental de la Biología Molecular
Kary Mullis
inventa la
Reacción de la
Cadena de la
Polimerasa in
vitro
Replicación del ADN vs. PCR
• PCR es una “falsificación” en laboratorio
de la replicación celular del ADN
La versión de laboratorio versión es comúnmente
conocida como “in vitro” puesto que la reacción
ocurre en un tubo, mientras que “in vivo” significa
que ocurre en un entorno celular.
Replicación Celular del ADN
(in vivo)
• La replicación del ADN es la
duplicación semiconservativa
de la cadena de ADN
• Típicamente, el proceso
celular de replicación demora
sólo unas pocas horas.
• La replicación de ADN es
semiconservativa (una hebra
del ADN es usada como
molde para la síntesis de una
nueva hebra de ADN)
• Este proceso ocurre con una
tasa de error muy baja (en
promedio 1X 10 -9)
• Aproximadamente una docena
de enzimas participan en la
replicación del ADN
Enzimas clave en la Replicación del
ADN
• DNA Polimerasa
• DNA Ligasa
• Primasa
• Helicasa
• Topoisomerasa
• Proteína de unión a la hebra
Enzimas de Replicación del ADN:
ADN Polimerasa
• cataliza la elongación del ADN mediante la
adición de nucleótidos trifosfatos al extremo 3’
de la cadena en elongación.
• Un nucleotido trifosfato es 1 azúcar + 1 base + 3 fosfatos
• Cuando un nucleotido trifosfato se une a la hebra de ADN, dos
fósforos son liberados (pirofosfatos).
• La ADN polimerasa sólo puede agregar
nucleótidos al extremo 3’ de la cadena en
elongación

Recomendados

Más contenido relacionado

La actualidad más candente

Recuento manual de leucocitos en cámara
Recuento manual de leucocitos en cámaraRecuento manual de leucocitos en cámara
Recuento manual de leucocitos en cámaraManuel García Galvez
 
FUNDAMENTO Y PROCEDIMIENTO DE LAS PRUEBAS DE WESTERN BLOT
FUNDAMENTO Y PROCEDIMIENTO DE LAS PRUEBAS DE WESTERN BLOTFUNDAMENTO Y PROCEDIMIENTO DE LAS PRUEBAS DE WESTERN BLOT
FUNDAMENTO Y PROCEDIMIENTO DE LAS PRUEBAS DE WESTERN BLOTDavid Calixto Flores
 
Reacción en cadena de la polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasaReacción en cadena de la polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasaRoger Lopez
 
Agar manitol salado
Agar manitol saladoAgar manitol salado
Agar manitol saladoFR GB
 
Metodos de Identificacion y Conservacion de Larvas de Nematodos
Metodos de Identificacion y Conservacion de Larvas de NematodosMetodos de Identificacion y Conservacion de Larvas de Nematodos
Metodos de Identificacion y Conservacion de Larvas de Nematodosjohnnyalexanderaguilarmontalvan
 
2.5.morfologia colonial
2.5.morfologia colonial2.5.morfologia colonial
2.5.morfologia colonialArianita Ayón
 
Camara de recuento neubauer
Camara de recuento neubauerCamara de recuento neubauer
Camara de recuento neubauerElizabeth Diana
 
Radioinmunoensayo, ELISA y Western Blot
Radioinmunoensayo, ELISA y Western BlotRadioinmunoensayo, ELISA y Western Blot
Radioinmunoensayo, ELISA y Western BlotBryan Priego
 
Extraccion de adn arn y proteinas
Extraccion de adn arn y proteinasExtraccion de adn arn y proteinas
Extraccion de adn arn y proteinasJhojan Ruiz Andia
 
Reacción en cadena de la polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasaReacción en cadena de la polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasaMajo Nuñez
 
Laboratorio no. 4 recuento bacteriano
Laboratorio no. 4   recuento bacterianoLaboratorio no. 4   recuento bacteriano
Laboratorio no. 4 recuento bacterianonataliaizurieta
 
Metodos inmunologicos
Metodos inmunologicosMetodos inmunologicos
Metodos inmunologicosIPN
 
Reporte de práctica 3. Pruebas bioquímicas
Reporte de práctica 3. Pruebas bioquímicasReporte de práctica 3. Pruebas bioquímicas
Reporte de práctica 3. Pruebas bioquímicasAlan Hernandez
 

La actualidad más candente (20)

Recuento manual de leucocitos en cámara
Recuento manual de leucocitos en cámaraRecuento manual de leucocitos en cámara
Recuento manual de leucocitos en cámara
 
FUNDAMENTO Y PROCEDIMIENTO DE LAS PRUEBAS DE WESTERN BLOT
FUNDAMENTO Y PROCEDIMIENTO DE LAS PRUEBAS DE WESTERN BLOTFUNDAMENTO Y PROCEDIMIENTO DE LAS PRUEBAS DE WESTERN BLOT
FUNDAMENTO Y PROCEDIMIENTO DE LAS PRUEBAS DE WESTERN BLOT
 
Pruebas bioquímicas
Pruebas bioquímicasPruebas bioquímicas
Pruebas bioquímicas
 
Reacción en cadena de la polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasaReacción en cadena de la polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasa
 
Agar manitol salado
Agar manitol saladoAgar manitol salado
Agar manitol salado
 
Prueba mio
Prueba mioPrueba mio
Prueba mio
 
Metodos de Identificacion y Conservacion de Larvas de Nematodos
Metodos de Identificacion y Conservacion de Larvas de NematodosMetodos de Identificacion y Conservacion de Larvas de Nematodos
Metodos de Identificacion y Conservacion de Larvas de Nematodos
 
2.5.morfologia colonial
2.5.morfologia colonial2.5.morfologia colonial
2.5.morfologia colonial
 
Pruebas bioquímicas
Pruebas bioquímicasPruebas bioquímicas
Pruebas bioquímicas
 
Camara de recuento neubauer
Camara de recuento neubauerCamara de recuento neubauer
Camara de recuento neubauer
 
Radioinmunoensayo, ELISA y Western Blot
Radioinmunoensayo, ELISA y Western BlotRadioinmunoensayo, ELISA y Western Blot
Radioinmunoensayo, ELISA y Western Blot
 
Electroforesis
ElectroforesisElectroforesis
Electroforesis
 
Extraccion de adn arn y proteinas
Extraccion de adn arn y proteinasExtraccion de adn arn y proteinas
Extraccion de adn arn y proteinas
 
Clase 3
Clase 3Clase 3
Clase 3
 
Reacción en cadena de la polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasaReacción en cadena de la polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasa
 
BIOLOGIA DE PLASMIDOS
BIOLOGIA DE PLASMIDOSBIOLOGIA DE PLASMIDOS
BIOLOGIA DE PLASMIDOS
 
Laboratorio no. 4 recuento bacteriano
Laboratorio no. 4   recuento bacterianoLaboratorio no. 4   recuento bacteriano
Laboratorio no. 4 recuento bacteriano
 
Metodos inmunologicos
Metodos inmunologicosMetodos inmunologicos
Metodos inmunologicos
 
Reporte de práctica 3. Pruebas bioquímicas
Reporte de práctica 3. Pruebas bioquímicasReporte de práctica 3. Pruebas bioquímicas
Reporte de práctica 3. Pruebas bioquímicas
 
Medios Bioquímicos
Medios BioquímicosMedios Bioquímicos
Medios Bioquímicos
 

Destacado (20)

Del DNA a la ingeniería genética
Del DNA a la ingeniería genéticaDel DNA a la ingeniería genética
Del DNA a la ingeniería genética
 
Pcr
PcrPcr
Pcr
 
FUNDAMENTOS DE LA PCR
FUNDAMENTOS DE LA PCRFUNDAMENTOS DE LA PCR
FUNDAMENTOS DE LA PCR
 
Pasos para PCR
Pasos para PCRPasos para PCR
Pasos para PCR
 
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASAREACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
 
PCR Cuantitativa
PCR CuantitativaPCR Cuantitativa
PCR Cuantitativa
 
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASAREACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
 
pcr
pcrpcr
pcr
 
PCR
PCRPCR
PCR
 
Reacción en cadena de la polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasaReacción en cadena de la polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasa
 
Pcr 2.1
Pcr 2.1Pcr 2.1
Pcr 2.1
 
Revolución genética ii
Revolución genética iiRevolución genética ii
Revolución genética ii
 
Aplicaciones de la PCR
Aplicaciones de la PCRAplicaciones de la PCR
Aplicaciones de la PCR
 
Pcr(Polimerase Chain Reaction)
Pcr(Polimerase Chain Reaction)Pcr(Polimerase Chain Reaction)
Pcr(Polimerase Chain Reaction)
 
Reacción en cadena de la polimeras (pcr) (3)
Reacción en cadena de la polimeras (pcr) (3)Reacción en cadena de la polimeras (pcr) (3)
Reacción en cadena de la polimeras (pcr) (3)
 
Reacción en cadena de la polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasaReacción en cadena de la polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasa
 
Tipos de pcr
Tipos de pcrTipos de pcr
Tipos de pcr
 
Pcr
PcrPcr
Pcr
 
Reaccion en cadena de la polimerasa
Reaccion en cadena de la polimerasaReaccion en cadena de la polimerasa
Reaccion en cadena de la polimerasa
 
PCR
PCRPCR
PCR
 

Similar a Diseño primers

Replicacion
ReplicacionReplicacion
Replicacionitzira
 
Espinosa laura. guia practica sobre la tecnica pcr. ok ok
Espinosa laura. guia practica sobre la tecnica pcr. ok okEspinosa laura. guia practica sobre la tecnica pcr. ok ok
Espinosa laura. guia practica sobre la tecnica pcr. ok okMorella Guillen Ferraro
 
bIOLOGIA MOLECULARReplicación_transcripción y traducción del ADN.pptx
bIOLOGIA MOLECULARReplicación_transcripción y traducción del ADN.pptxbIOLOGIA MOLECULARReplicación_transcripción y traducción del ADN.pptx
bIOLOGIA MOLECULARReplicación_transcripción y traducción del ADN.pptxMi pito en tu boca
 
PRESENTACIÓN PCR IRENE FERNANDEZ. biotecnología.ppsx
PRESENTACIÓN PCR IRENE FERNANDEZ. biotecnología.ppsxPRESENTACIÓN PCR IRENE FERNANDEZ. biotecnología.ppsx
PRESENTACIÓN PCR IRENE FERNANDEZ. biotecnología.ppsxssuser40d9a5
 
Curso gen..[1]
Curso gen..[1]Curso gen..[1]
Curso gen..[1]braguetin
 
8C153328-9163-4010-BD9F-F719C94C2555.pdf
8C153328-9163-4010-BD9F-F719C94C2555.pdf8C153328-9163-4010-BD9F-F719C94C2555.pdf
8C153328-9163-4010-BD9F-F719C94C2555.pdfMaraFernandaLinceCru
 
C1 Estructura molecular Dogma División Cariotipo.pptx
C1 Estructura molecular Dogma División Cariotipo.pptxC1 Estructura molecular Dogma División Cariotipo.pptx
C1 Estructura molecular Dogma División Cariotipo.pptxCarmen Alcaraz
 
4.9 Técnicas de Biología Molecular.pptx
4.9 Técnicas de Biología Molecular.pptx4.9 Técnicas de Biología Molecular.pptx
4.9 Técnicas de Biología Molecular.pptxjans velarde
 
Práctica 3 Reacción en cadena de la polimerasa
Práctica 3 Reacción en cadena de la polimerasaPráctica 3 Reacción en cadena de la polimerasa
Práctica 3 Reacción en cadena de la polimerasaAra LV
 
Transcripción y traducción.pptx
Transcripción y traducción.pptxTranscripción y traducción.pptx
Transcripción y traducción.pptxpvalenzuelajara
 

Similar a Diseño primers (20)

Trabajo sobre PCR
Trabajo sobre PCRTrabajo sobre PCR
Trabajo sobre PCR
 
5 biologia molecular
5 biologia molecular5 biologia molecular
5 biologia molecular
 
PCR
PCRPCR
PCR
 
PCR fundamento
PCR fundamentoPCR fundamento
PCR fundamento
 
Replicacion
ReplicacionReplicacion
Replicacion
 
Polymerase Chain Reaction
Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction
Polymerase Chain Reaction
 
Pcr
PcrPcr
Pcr
 
Espinosa laura. guia practica sobre la tecnica pcr. ok ok
Espinosa laura. guia practica sobre la tecnica pcr. ok okEspinosa laura. guia practica sobre la tecnica pcr. ok ok
Espinosa laura. guia practica sobre la tecnica pcr. ok ok
 
bIOLOGIA MOLECULARReplicación_transcripción y traducción del ADN.pptx
bIOLOGIA MOLECULARReplicación_transcripción y traducción del ADN.pptxbIOLOGIA MOLECULARReplicación_transcripción y traducción del ADN.pptx
bIOLOGIA MOLECULARReplicación_transcripción y traducción del ADN.pptx
 
FUNDAMENTOS DE LA PCR
FUNDAMENTOS DE LA PCRFUNDAMENTOS DE LA PCR
FUNDAMENTOS DE LA PCR
 
PRESENTACIÓN PCR IRENE FERNANDEZ. biotecnología.ppsx
PRESENTACIÓN PCR IRENE FERNANDEZ. biotecnología.ppsxPRESENTACIÓN PCR IRENE FERNANDEZ. biotecnología.ppsx
PRESENTACIÓN PCR IRENE FERNANDEZ. biotecnología.ppsx
 
Evolucion
EvolucionEvolucion
Evolucion
 
Curso gen..[1]
Curso gen..[1]Curso gen..[1]
Curso gen..[1]
 
8C153328-9163-4010-BD9F-F719C94C2555.pdf
8C153328-9163-4010-BD9F-F719C94C2555.pdf8C153328-9163-4010-BD9F-F719C94C2555.pdf
8C153328-9163-4010-BD9F-F719C94C2555.pdf
 
C1 Estructura molecular Dogma División Cariotipo.pptx
C1 Estructura molecular Dogma División Cariotipo.pptxC1 Estructura molecular Dogma División Cariotipo.pptx
C1 Estructura molecular Dogma División Cariotipo.pptx
 
4.9 Técnicas de Biología Molecular.pptx
4.9 Técnicas de Biología Molecular.pptx4.9 Técnicas de Biología Molecular.pptx
4.9 Técnicas de Biología Molecular.pptx
 
Prueba de PCR
Prueba de PCRPrueba de PCR
Prueba de PCR
 
Práctica 3 Reacción en cadena de la polimerasa
Práctica 3 Reacción en cadena de la polimerasaPráctica 3 Reacción en cadena de la polimerasa
Práctica 3 Reacción en cadena de la polimerasa
 
Replicación del adn2
Replicación del adn2Replicación del adn2
Replicación del adn2
 
Transcripción y traducción.pptx
Transcripción y traducción.pptxTranscripción y traducción.pptx
Transcripción y traducción.pptx
 

Último

la zanahoria datos interesantes y mas :3
la zanahoria datos interesantes y mas :3la zanahoria datos interesantes y mas :3
la zanahoria datos interesantes y mas :3SandraCarro4
 
CÉLULA VEGETAL Y SUS PARTES Y FUNCIONES.pdf
CÉLULA VEGETAL Y SUS PARTES Y FUNCIONES.pdfCÉLULA VEGETAL Y SUS PARTES Y FUNCIONES.pdf
CÉLULA VEGETAL Y SUS PARTES Y FUNCIONES.pdfJherikmatteoChamorro
 
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_5_MILENA_MOYA.pptx
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_5_MILENA_MOYA.pptxMORFOFISIOLOGIA_HUMANA_5_MILENA_MOYA.pptx
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_5_MILENA_MOYA.pptxmilenamoyaniacato25
 
La manera en la que la Tabla periodica esta dividida
La manera en la que la Tabla periodica esta divididaLa manera en la que la Tabla periodica esta dividida
La manera en la que la Tabla periodica esta divididasoldadouc12
 
1886 -1887-El 12 de octubre de 1886 Alexandre Ciurcu recibió la patente franc...
1886 -1887-El 12 de octubre de 1886 Alexandre Ciurcu recibió la patente franc...1886 -1887-El 12 de octubre de 1886 Alexandre Ciurcu recibió la patente franc...
1886 -1887-El 12 de octubre de 1886 Alexandre Ciurcu recibió la patente franc...Champs Elysee Roldan
 
GEOLOGIA.Tema 10 Recursos minerales.pptx
GEOLOGIA.Tema 10 Recursos minerales.pptxGEOLOGIA.Tema 10 Recursos minerales.pptx
GEOLOGIA.Tema 10 Recursos minerales.pptxBertaAriasLpez1
 
Producción de la zanahoria y los sus beneficios
Producción de la zanahoria y los sus beneficiosProducción de la zanahoria y los sus beneficios
Producción de la zanahoria y los sus beneficiosocamposusan137
 
presentación electrónica de la producción de la zanahoria
presentación electrónica de la producción de la zanahoriapresentación electrónica de la producción de la zanahoria
presentación electrónica de la producción de la zanahoriang8096507
 
EL VERBO- semana 10 A,B,C,D 2024- UNT, BICENTENARIO
EL VERBO-  semana 10 A,B,C,D 2024- UNT, BICENTENARIOEL VERBO-  semana 10 A,B,C,D 2024- UNT, BICENTENARIO
EL VERBO- semana 10 A,B,C,D 2024- UNT, BICENTENARIODanielFrancoCastillo
 
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_3_MILENA_MOYA.pptx
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_3_MILENA_MOYA.pptxMORFOFISIOLOGIA_HUMANA_3_MILENA_MOYA.pptx
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_3_MILENA_MOYA.pptxmilenamoyaniacato25
 
Filosofia de la educacionn expo (1).pptx
Filosofia de la educacionn expo (1).pptxFilosofia de la educacionn expo (1).pptx
Filosofia de la educacionn expo (1).pptxNurydelRocioSnchezMn
 
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_2_MILENA_MOYA.pptx
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_2_MILENA_MOYA.pptxMORFOFISIOLOGIA_HUMANA_2_MILENA_MOYA.pptx
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_2_MILENA_MOYA.pptxmilenamoyaniacato25
 
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_1_MILENA_MOYA.pptx
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_1_MILENA_MOYA.pptxMORFOFISIOLOGIA_HUMANA_1_MILENA_MOYA.pptx
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_1_MILENA_MOYA.pptxmilenamoyaniacato25
 
Citación Asamblea Estatutaria - Invita Junta Directiva de SJG 2024
Citación Asamblea Estatutaria - Invita Junta Directiva de SJG 2024Citación Asamblea Estatutaria - Invita Junta Directiva de SJG 2024
Citación Asamblea Estatutaria - Invita Junta Directiva de SJG 2024SOCIEDAD JULIO GARAVITO
 
DIVISION_CELULAR_REPRODUCCIÓN_5_MILENA_MOYA.pptx
DIVISION_CELULAR_REPRODUCCIÓN_5_MILENA_MOYA.pptxDIVISION_CELULAR_REPRODUCCIÓN_5_MILENA_MOYA.pptx
DIVISION_CELULAR_REPRODUCCIÓN_5_MILENA_MOYA.pptxmilenamoyaniacato25
 

Último (16)

la zanahoria datos interesantes y mas :3
la zanahoria datos interesantes y mas :3la zanahoria datos interesantes y mas :3
la zanahoria datos interesantes y mas :3
 
CÉLULA VEGETAL Y SUS PARTES Y FUNCIONES.pdf
CÉLULA VEGETAL Y SUS PARTES Y FUNCIONES.pdfCÉLULA VEGETAL Y SUS PARTES Y FUNCIONES.pdf
CÉLULA VEGETAL Y SUS PARTES Y FUNCIONES.pdf
 
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_5_MILENA_MOYA.pptx
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_5_MILENA_MOYA.pptxMORFOFISIOLOGIA_HUMANA_5_MILENA_MOYA.pptx
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_5_MILENA_MOYA.pptx
 
La manera en la que la Tabla periodica esta dividida
La manera en la que la Tabla periodica esta divididaLa manera en la que la Tabla periodica esta dividida
La manera en la que la Tabla periodica esta dividida
 
1886 -1887-El 12 de octubre de 1886 Alexandre Ciurcu recibió la patente franc...
1886 -1887-El 12 de octubre de 1886 Alexandre Ciurcu recibió la patente franc...1886 -1887-El 12 de octubre de 1886 Alexandre Ciurcu recibió la patente franc...
1886 -1887-El 12 de octubre de 1886 Alexandre Ciurcu recibió la patente franc...
 
GEOLOGIA.Tema 10 Recursos minerales.pptx
GEOLOGIA.Tema 10 Recursos minerales.pptxGEOLOGIA.Tema 10 Recursos minerales.pptx
GEOLOGIA.Tema 10 Recursos minerales.pptx
 
Producción de la zanahoria y los sus beneficios
Producción de la zanahoria y los sus beneficiosProducción de la zanahoria y los sus beneficios
Producción de la zanahoria y los sus beneficios
 
presentación electrónica de la producción de la zanahoria
presentación electrónica de la producción de la zanahoriapresentación electrónica de la producción de la zanahoria
presentación electrónica de la producción de la zanahoria
 
EL VERBO- semana 10 A,B,C,D 2024- UNT, BICENTENARIO
EL VERBO-  semana 10 A,B,C,D 2024- UNT, BICENTENARIOEL VERBO-  semana 10 A,B,C,D 2024- UNT, BICENTENARIO
EL VERBO- semana 10 A,B,C,D 2024- UNT, BICENTENARIO
 
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_3_MILENA_MOYA.pptx
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_3_MILENA_MOYA.pptxMORFOFISIOLOGIA_HUMANA_3_MILENA_MOYA.pptx
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_3_MILENA_MOYA.pptx
 
Filosofia de la educacionn expo (1).pptx
Filosofia de la educacionn expo (1).pptxFilosofia de la educacionn expo (1).pptx
Filosofia de la educacionn expo (1).pptx
 
Proceso de la FOTOSÍNTESIS (PASO A PASO)
Proceso de la FOTOSÍNTESIS (PASO A PASO)Proceso de la FOTOSÍNTESIS (PASO A PASO)
Proceso de la FOTOSÍNTESIS (PASO A PASO)
 
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_2_MILENA_MOYA.pptx
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_2_MILENA_MOYA.pptxMORFOFISIOLOGIA_HUMANA_2_MILENA_MOYA.pptx
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_2_MILENA_MOYA.pptx
 
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_1_MILENA_MOYA.pptx
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_1_MILENA_MOYA.pptxMORFOFISIOLOGIA_HUMANA_1_MILENA_MOYA.pptx
MORFOFISIOLOGIA_HUMANA_1_MILENA_MOYA.pptx
 
Citación Asamblea Estatutaria - Invita Junta Directiva de SJG 2024
Citación Asamblea Estatutaria - Invita Junta Directiva de SJG 2024Citación Asamblea Estatutaria - Invita Junta Directiva de SJG 2024
Citación Asamblea Estatutaria - Invita Junta Directiva de SJG 2024
 
DIVISION_CELULAR_REPRODUCCIÓN_5_MILENA_MOYA.pptx
DIVISION_CELULAR_REPRODUCCIÓN_5_MILENA_MOYA.pptxDIVISION_CELULAR_REPRODUCCIÓN_5_MILENA_MOYA.pptx
DIVISION_CELULAR_REPRODUCCIÓN_5_MILENA_MOYA.pptx
 

Diseño primers

  • 1. • La PCR es un método para amplificar un segmento particular de ADN • Amplificación= hacer múltiples copias de un determinado segmento de ADN • La PCR puede producir billones de copias de una secuencia target de DNA en unas pocas horas • La PCR fue inventado en 1984 como un método de producir numerosas copias de fragmentos de ADN en el laboratorio • Sus aplicaciones son amplísimas y el PCR es ahora un pilar fundamental de la Biología Molecular
  • 2. Kary Mullis inventa la Reacción de la Cadena de la Polimerasa in vitro
  • 3. Replicación del ADN vs. PCR • PCR es una “falsificación” en laboratorio de la replicación celular del ADN La versión de laboratorio versión es comúnmente conocida como “in vitro” puesto que la reacción ocurre en un tubo, mientras que “in vivo” significa que ocurre en un entorno celular.
  • 4. Replicación Celular del ADN (in vivo) • La replicación del ADN es la duplicación semiconservativa de la cadena de ADN • Típicamente, el proceso celular de replicación demora sólo unas pocas horas. • La replicación de ADN es semiconservativa (una hebra del ADN es usada como molde para la síntesis de una nueva hebra de ADN) • Este proceso ocurre con una tasa de error muy baja (en promedio 1X 10 -9) • Aproximadamente una docena de enzimas participan en la replicación del ADN
  • 5. Enzimas clave en la Replicación del ADN • DNA Polimerasa • DNA Ligasa • Primasa • Helicasa • Topoisomerasa • Proteína de unión a la hebra
  • 6. Enzimas de Replicación del ADN: ADN Polimerasa • cataliza la elongación del ADN mediante la adición de nucleótidos trifosfatos al extremo 3’ de la cadena en elongación. • Un nucleotido trifosfato es 1 azúcar + 1 base + 3 fosfatos • Cuando un nucleotido trifosfato se une a la hebra de ADN, dos fósforos son liberados (pirofosfatos). • La ADN polimerasa sólo puede agregar nucleótidos al extremo 3’ de la cadena en elongación
  • 7. Complementariedad de bases del ADN • El ADN es una doble hélice de polinucleotidos, con una columna vertebral de pentosas fosfatadas al exterior de la hélice. • Las dos hebras de ADN se mantienen unidas por los enlaces de puente hidrógeno existentes entre los pares de bases nitrogenadas. • La base nitrogenada adenina sólo se aparea con timina. • La base nitrogenada guanina sólo se aparea con citosina. • Durante la replicación, una vez que las hebras de ADN se han separado, la ADN polimerasa usa cada hebra como un molde para sintetizar nuevas hebras de ADN con el preciso y complementario orden de nucleótidos.
  • 8. PCR: la versión in vitro de la Replicación del ADN Los siguientes componentes son obligatorios para producir una PCR en el laboratorio: 1) ADN (muestra de ADN que contiene la secuencia de interés que queremos copiar) 2) Una DNA polimerasa termoestable (la Taq Polimerasa) 3) Los 4 nucleótidos trifosfatados 4) Soluciones tampón 5) 2 segmentos cortos, de una sola hebra de ADN, que sirven como cebadores 6) Tubos de pared delgada 7) Termociclador (una maquina que que puede generar gradientes de temperatura drásticamente en periodos de tiempo muy cortos)
  • 9. PCR La muestra de ADN, la ADN polimerasa, el tampón, los nucleótidos trifosfatados y los cebadores son vertidos en tubos de paredes delgadas y éstos son puestos en un termociclador de PCR. Termociclador de PCR
  • 10. Los 3 pasos principales de la PCR • El fundamento de la PCR son los cambios de temperatura y el efecto que estos gradientes producen en el ADN. • En una reacción PCR, la siguiente serie de pasos es repetida en un rango de 20-40 ciclos (nota: 25 ciclos duran 2 horas en promedio y resultan en la amplificación del fragmento de interés 100,000 veces) Paso 1: Denaturación del ADN A 95C, el ADN es desnaturalizado (las 2 hebras se separan) Paso 2: Hibridización de los Cebadores o Primers A 40C- 65C, los primers se hibridizan (o se unen) complementariamente a las secuencias de ambas hebras del ADN Paso 3: La ADN polimerasa EXTIENDE la cadena de ADN A 72C, la ADN Polimerasa extiende la cadena de ADN adicionando nucleótidos al extremo 3´de los primers.
  • 11. ADN Polimerasa Termoestable • Dado que la PCR implica la aplicación de temperaturas muy altas, es imperativo que una ADN polimerasa muy estable térmicamente sea usada en la reacción. • La mayoría de las ADN polimerasas se desnaturalizarían (y por lo tanto no podrian funcionar apropiadamente) con las altas temperaturas de los pasos de la PCR. • La Taq DNA polymerasa fue purificada a partir de la bacteria de aguas termalesThermus aquaticus in 1976 • La Taq tiene su temperatura optima a 75 C -80 C, y reduce sustancialmente su actividad a bajas temperaturas.
  • 12. Hibridación de los Cebadores 5' 5'3' 3' target DNA Ciclos Subsecuentes de PCR 5' 5'3' 3' DNA de doble hebra Desnaturalización 5' 5'3' 3' Extension3' 5' 5' 5' 5'3' 3' 3' 3' 5' 5' 5' 5'3' 3' 3' Extensión PCR Ciclo 1 DNA polimerasa siempre agrega nucleotidos al extremo 3’ del cebador
  • 13. El Tamaño del Fragmento de ADN Producido en la PCR Depende de los Cebadores • La reacción PCR amplificará la sección de ADN entre los dos primers • Si la secuencia de ADN es conocida, los primers pueden ser desarrollados para amplificar cualquier pieza de ADN de un organismo. Forward primer Reverse primer Tamaño del fragmento amplificado
  • 14. 72 0C – extensión de la ADN polimerasa 94 0C - desnaturalización Temperature 0C Control de Temperatura en un Termociclador 94 0C - desnaturalización 50 – 70 0C – hibridación de los primers
  • 15. El fragmento de interés del ADN es amplificado a la potencia 2 por cada ciclo de PCR por ejemplo, si sometemos la muestra de interés de ADN a 5 ciclos de PCR, obtendremos 25 (or 64) copias de ADN. Similarmente, si sometemos la muestra de ADN a 40 ciclos de PCR, obtendremos 240 copias de ADN 1,099,511,627,776
  • 16. La PCR se ha convertido en una poderosa herramienta de la biología molecular • Con una sola célula espermática o de cabello se puede amplificar suficiente ADN para realizar un análisis y producir bandas diferenciadas en el gel de agarosa. • Se pueden amplificar fragmentos de interés en el ADN de un organismo escogiendo los cebadores apropiados. • Se puede usar la selectividad de los cebadores para identificar la probabilidad de que un individuo sea portador de un particular alelo de un gen.
  • 17. Qué son los cebadores o primers • Los primers de PCR son moléculas cortas de una sola hebra de ADN (15-40 bp) • Son manufacturados comercialmente y pueden diseñarse para complementarse con cualquier secuencia de ADN. • Los primers son secuencias específicas, y se ligarán a una secuencia deseada de ADN • Mientras más largos sean los primers, mayor su especificidad y selectividad (15 → 40 bp). • La ADN polimerasa requiere primers para iniciar la replicación.
  • 18. Selectividad de los Primers • Los primers se ligan a su secuencia complementaria en el ADN target – Un primer compuesto de sólo 3 letras, ACC, por ejemplo, tiene una alta probabilidad de encontrar su complemento en un genoma -más de una vez- – A medida que el cebador crece en nucleótidos, la probabilidad de que ,por ejemplo, una secuencia de 35 letras encuentre repetidamente una sección complementaria en el ADN target -se vuelve más remota.
  • 19. Probabilidad de Complementariedad en Primers Arrojando la Moneda La probabilidad de a cara (H) o a cruz (T) es siempre 0.5 para cada vez que arrojamos la moneda. Cuál es la probabilidad de obtener esta combinación de cruces en una serie? Evento Probabilidad T 0.5 = 0.5 T,T 0.5 x 0.5 = 0.25 T,T,T 0.5 x0.5 x 0.5 = 0.125 T,T,T,T,T (0.5)5 = 0.03125 T,T,T,T,T,T,T,T,T,T,T (0.5)11 = 0.0004883 T,T,T,T,T,T,T,T,T,T,T,T,T,T,T,T (0.5)16 =0.00001526 De tal manera se vuelve cada vez menos probable obtener 16 cruces en una serie(1 posibilidad in 65536 veces). De la misma manera,a medida que el primer incrementa en tamaño las probabilidades de una complementariedad extra aparte de la buscada es altamente improbable.
  • 20. Probabilidad en Genética • Hay 4 bases en la molécula de ADN: A,C,G,T • La probabilidad de encontrar cualquiera de estas bases en el codigo es 0.25 (1/4) • Ahora calculemos la probabilidad de encontrar una determinada secuencia de bases Evento Probabilidad A 0.25 = 0.25 A,T 0.25 x 0.25 = 0.0625 A,T,A 0.25 x0.25 x 0.25 = 0.015625 A,T,A,G,G (0.25)5 = 0.0009765 A,T,A,G,G,T,T,T,A,A,C (0.25)11 = 0.000002384 A,T,A,G,G,T,T,T,A,A,C,C,T,G,G,T (0.25)16 =0.0000000002384 De tal manera, se vuelve cada vez menos probable que una secuencia de 16 bases (1 probabilidad en 4300 millones) encuentra más de una zona complementaria.De la misma manera, a medida que el primer incrementa su tamaño, la probabilidad de que se ligue a una zona diferente de la esperada es altamente improbable
  • 21. • Una temperatura de fusión (Tm) en el rango de 52 ºC a 65 ºC • Que no tiendan a formar dímeros • Que no formen horquillas(>3 bp) • Que no se liguen a sitios secundarios. • Baja afinidad específica en el extremo 3' ( un bajo contenido de GC content para evitar exceso de afinidad no complementaria)
  • 22. Sólo puede haber UNA zona complementaria en el DNA donde el primer se ligue, lo cual significa que la secuencia del oligonucleótido debe ser irrepetible Tampoco debe haber sitios de hibridación en fuentes posibles de contaminación, tales como: humano, rata, ratón, etc. Primer candidate 1 5’-TGCTAAGTTG-3’ Primer candidate 2 5’-CAGTCAACTGCTAC-3’ TGCTAAGTTG CAGTCAACTGCTAC 5’...TCAACTTAGCATGATCGGGTA...GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA...3 ’ No específico! Específico TGCTAGTTG A
  • 23. La longitud del oligonucleótido influencia en su especificidad y temperatura de hibridación . En resumen: mientras más largo sea el primer, mayor será su especificidad pero tambien será mayor su temperatura de hibridación., El primer tendrá como mínimo 15 bases para asegurar su especificidad. Normalmente los primers están en el rango de 17-28 bases de longitud.
  • 24. La composición de bases afecta la especificidad de la hibridación asi como su temperatura. • Composición aleatoria de bases es lo mejor. Evitar primers con secuencias de conformacion GCGCGC o ATATAA • Un contenido de (G+C) en el rango de 50-60% nos proporcionará una buena temperatura de hibridación. melting/annealing temperature for ordinary PCR reactions, and will give appropriate hybridization stability. However, melting/annealing temperature and hybridization stability are affected by other factors, which we’ll discuss later. Therefore, (G+C) content is allowed to change. Secuencia DNA 5’...TCAACTTAGCATGATCGGGCA...AAGATGCACGGGCCTGTACACAA...3’ TGCCCGATCATGCT
  • 25. La temperatura de fusión, Tm – es la temperatura a la cual la mitad de las hebras de DNA están denaturalizadas y la otra mitad formando duplexes.. La Tm es característica de la composición de DNA ; Un alto contenido de G+C contenido de DNA posee una Tm debido a que poseen tripes puentes de Hidrógeno. Cálculo Tm= (wA+xT) * 2 + (yG+zC) * 4
  • 26. La temperatura de hibridación se calcula usando la temperatura de fusión de los oligonucleótidos. En promedio es:
  • 27. Si los primers son complementarios entre si, y se hibridan entre ellos en lugar de hibridarze con el DNA muestra, la eficiencia de la PCR se verá afectada drásticamente. Sin embargo, estas potenciales estructuras secundarias no se presentan debido a que la temperatura de hibridación no les permite formarse. Por ejemplo, los dimeros y horquillas se forman a 30 C pero en la PCR cycle, la temperatura más baja es de 60 C.
  • 28. Los primers trabajan en parejas – forward primer y reverse primer-. Puesto que son usados en la reacción de PCR , debemos asegurarnos de que las condiciones de temperatura de la PCR trabajen para AMBOS. Un tema muy importante es su temperatura de hibridación. Que debe ser mutuamente compatible. La máxima diferencia permisible en la temperatura de dos primers es de 3 C. Mientras menor sea su diferencia en Tanneal, mejor para nosotros.
  • 29. En resumen: ¿cuándo un oligonucleótido es un buen cebador? 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’
  • 30. 1. Especificidad: asegurar que la secuencia complementaria sea única; 2. Longitud: 17-28 bases.Este rango esta sujeto a variación; 3. Composición de bases: el contenido promedio (G+C) en el rango 50-60%; evitar regiones ricas en secuencias (A+T) y (G+C) ; 4. Optimizar el emparejamiento de bases: es importante que la estabilidad del extremo 5’ sea alta y la del 3’ sea baja para evitar “falsa” hibridación. 5. La Tm en el rango de 55-70 C; 6. LosTm de los primers no deben diferenciarse más de 2 – 3 C entre sí. 7. Minimizar la posibilidad de formación de estructuras secundarias: horquillas y dímeros deben evitarse.
  • 31. Diseño de primers usando plataformas Algunas plataformas disponibles: - Oligo: Life Science Software, standalone application - GCG: Accelrys, ICBR mantiene el servidor. - Primer3: MIT, standalone / web application http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi - BioTools: BioTools, Inc. ICBR distribuye la licencia.. - Otros: GeneFisher, Primer!, Web Primer, NBI oligo program, etc. Para calcular temperatura de fusión: http://www.promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm
  • 32. Ejercicio Diseñar primers para la secuencia “NM_203378” en NCBI GenBank, para que la secuencia de mioglobina humana sea amplificada usando PCR . Entre 156..620
  • 36. • Múltiples pares de oligonucleótidos se agregan al Master Mix. • Asi se amplifican multiples sitios- en una sola reacción PCR. • Se usa para identificación genómica. • Retos: – Los Tm deben ser muy cercanos. – Evitar los dímeros potenciales.
  • 37. Primers tambien pueden diseñarse para amplificar productos múltiples. Se les llama “primers universales”. Se usan para amplificar genes, design primers to amplify genes del Virus del Papilloma Humano. Estrategia: 1. Alinear grupos de secuencias que queremos amplificar. 2. Identificar las zonas conservativas en los extremos 5’ y 3’ . 3. Diseñar “forward primer”en la región 5’. 4. Diseñar “reverse primer” en la región 3 5. Asegurar la especificdad en todas las secuencias. 6. Hacer un BLAST de los primers en potenciales contaminantes.