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MICROSCOPÍA Y TINCIÓN

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TEMA PARA LA MATERIA DE MICROBIOLOGÍA...t/t

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MICROSCOPÍA Y TINCIÓN

  1. 1. Estructura y función de los microorganismosObjetivos• Conocer -La relación entre la estructura y función de los microorganismos• Asimilar -La estructura de los procariotas los hace enormemente interesantes en microbiología aplicada• Capacidad – Manejar las técnicas más frecuentes en un laboratorio de Microbiología y aprenda a plantear experimentos sencillos y a interpretar y discutir científicamente los resultados 1 – Manejar, ajustar y mantener los microscopios –
  2. 2. Unidad 2. Estructura y función de los microorganismos Capítulo 2: El estudio de la estructura microbiana: Microscopía y preparación del especimen2
  3. 3. Fundamentos y tipos de microscopios ópticos Las lentes y el desvío de la luz • La luz es refractada (desviada) cuando pasa de un medio a otro • El índice de refracción – Es una medida del grado en el que una sustancia reduce la velocidad de la luz • La dirección y la magnitud de la desviación se determina por los índices de refracción de los dos medios que forman la interfase 3
  4. 4. Fundamentos y tipos de microscopios ópticosLentes• Una lente convexa enfocará los rayos luminosos en un punto concreto denominado punto focal (F)• La distancia entre el centro de la lente y el punto focal es la distancia focal (f)• Los aumentos que proporciona una lente están relacionados con la distancia focal – A menores distancias focales ⇒ más aumentos 4
  5. 5. Fundamentos y tipos de microscopios ópticos El microscopio óptico • Tipos – Microscopio de campo claro – Microscopio de campo oscuro – Microscopio de contraste de fase – Microscopio de fluorescencia • Son microscopios compuestos – La imagen se forma por la acción de ≥2 lentes 5
  6. 6. Fundamentos y tipos de microscopios ópticos El microscopio de campo claro• Produce una imagen oscura sobre un fondo luminoso• En general de 3 a 5 objetivos con lentes diferentes (si la imagen permanece enfocada a medida que se cambian los objetivos el microscopio se denomina parfocal)• Aumento total (producto del aumento de las lentes del ocular y el objetivo) 6
  7. 7. Fundamentos y tipos de microscopios ópticos• Resolución de distinguirmicroscopioestán Capacidad de una lente de separar o un entre objetos pequeños que (d) próximos• La longitud de onda de la luz empleada es un factor fundamental en la resolución (filtro azul en los microscopios del laboratorio) A menor longitud de onda ⇒ mayor resolución d= 0.5 λ/n sen θ n = índice de refracción Tabla 2.2 Propiedades de los objetivos de un microscopio óptico (n sen θ)•Distancia de trabajo •Aceite de inmersión — distancia entre la superficie frontal — aumenta el índice de refracción Nagua= 1.33 Naceite: 1.45 7 θ =Apertura angular
  8. 8. Fundamentos y tipos de microscopios ópticosMicroscopio de campo oscuro• Produce una imagen iluminada del objeto sobre un fondo oscuro• Se emplea para observar organismos vivos en Treponema preparaciones sin teñir Condensador Abbé = produce un cono hueco de luz Diafragma de campo oscuro 8
  9. 9. Fundamentos y tipos de microscopios ópticos Microscopio de contraste de fases• Aumenta el contraste entre las estructuras intracelulares que tienen ligeras diferencias en el índice de refracción• Excelente para observar células vivas sin teñir 9
  10. 10. Fundamentos y tipos de microscopios ópticosMicroscopia de contraste deinterferancia diferencial o técnicaNomarski• Similar a la de contraste de fases – Crea imágenes sobre la base de una detección de diferencias en el índice de refracción y el espesor de la muestra – Excelente para observar células vivas• Emplea luz polarizada – Esto mejora el contraste y da como resultado una imagen tridimensional 10
  11. 11. Brightfield microscopy image of cultured epithelial cells using a 20X objective Phase contrast image of cultured epithelial cells using a 20X objective. Differential Interference Contrast (DIC or Nomarski) image of cultured epithelial cells using a 20X objective. 11
  12. 12. Fundamentos y tipos de microscopios ópticos Microscopía de fluorescencia• Expone un especimen a luz ultravioleta, violeta o azul• En general, el especimen se tiñe con fluorocromos• Se observa, en un fondo oscuro, una imagen brillante del objeto como resultado de la fluorescencia emitida por la muestraProtozoo flageladoCrithidia luciliae teñido Live/Dead stainig: Mezcla decon anticuerpos Micrococcus luteus y Bacillus cereusfluorescentes (verdes vivas, rojas muertas) 12
  13. 13. Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica Preparación y tinción de la muestra • Aumenta la resolución • Acentúa las características morfológicas • Conserva la muestra 13
  14. 14. Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica Preparación (Fijación) • Proceso mediante el cual se procesan y fijan en su posición las estructuras internas y externas de la célua • Además se mata al microorganismo y se fija firmemente al porta objetos (microscope slide) – Fijación por calor • Preserva la morfología general pero no las estructuras internas – Fijación química • Protege la subestructura fina y la morfología de los microorganismos delicados de mayor tamaño Ej.: • aldehídicos (al formaldehído, el paraformaldehído, el glutaraldehído, la acroleína), • el ácido ósmico • el tetróxido de osmio • los compuestos mercúricos y crómicos, • los alcoholes, la acetona, el dietil- pirocarbonato. 14
  15. 15. Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica Colorantes y tinción simple • Colorantes (dyes) – Hacen más visibles las estructuras internas y externas aumentando el contraste con el fondo – Tienen dos características fundamentales • Grupos cromóforos – Grupos químicos con dobles enlaces conjugados – Dan al colorante su color • Afinidad por los componentes celulares – se unen mediante enlaces iónicos (los más comunes) , covalentes o hidrófobos 15
  16. 16. Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica Tipos de tinción • Tinción simple – Se emplea un solo colorante. Se dividen en dos clases generales – Colorantes básicos se emplean frecuentemente • Tienen cargas positivas • Ej.: Cristal violeta, fucsina básica, safranina, verde malaquita Safranina – Colorantes ácidos se emplean menos frecuentemente • Tienen cargas negativas • Ej.: Eosina, Fucsina ácida 16
  17. 17. Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica Tipos de tinción • Tinción diferencial – Se emplean dos o más colorantes – Divide a las bacterias en grupos diferentes según sus propiedades de tinción: • Ej.: Tinción de Gram • Ej.: Tinción ácido alcohol resistente • Tinción de Gram – Es la tinción diferencial más empleada – Divide a las bacterias en grupos diferentes según diferencias en la pared celular 17
  18. 18. Gram positivaPreparación y tinción de las muestras en microscopía óptica Gram negativa 18
  19. 19. Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica Tipos de tinción• Tinción Ácido-alcohol resistente (Acid-fast staining) – Se tiñen calentando una mezcla de fucsina básica y fenol (Método de Ziehl- Neelsen) – Tras la tinción no se decoloran fácilmente debido al elevado contenido en lípidos de las paredes de estas células • En particular ácidos micólicos (lípidos hidroxílicos de cadena ramificada) Mycobacterium leprae – Particularmente útil en la tinción Colorante de contraste: azul de metileno de miembros del género Mycobacterium Ej., Mycobacterium tuberculosis – causente de la tuberculosis Ej., Mycobacterium leprae – causante de la lepra 19
  20. 20. Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica Tinción de estructuras específicas• Tinción negativa – Se emplea frecuentemente para visualizar las capsulas difusas que rodean a algunas bacterias – Se mezclan las bacterias con tinta china o colorante de nigrosina y se extienden sobre un porta – Las capsulas se observan sin color sobre un fondo oscuro 20 Cryptococcus neoformans – tinción negativa con tinta china
  21. 21. Preparación y tinción de las muestras en microscopía ópticaTinción de estructuras específicas• Tinción de esporas (Método de Schaeffer-Fulton) – Técnica de doble tinción – Las esporas se tiñen primero calentando las bacterias con verde malaquita – Después de desteñir se contratiñe con safranina quedando las células vegetativas y las endosporas con colores diferentes – Son difíciles de teñir por eso se observan también en tinciones simples• Tinción de flagelos Bacillus cereus – Los flagelos deben ser recubiertos con suficiente colorante como para ser observados – Se aplica mordiente (como ácido tánico y alumbre de potasio) para aumentar el grosor de los flagelos y se tiñen con pararosanilina (Método de Leifson) o fucsina básica (Método de Gray) 21 Vibrio cholerae O1
  22. 22. Preparación y tinción de las muestras en microscopía ópticaTinción de estructuras específicasSistemas de marcaje inmunocitoquímico• Métodos directos – el primer anticuerpo o anticuerpo primario se encuentra unido a algún tipo de marcador fluorocromo (pierde fluorescencia con el tiempo) – Se pueden emplear varios anticuerpos diferentes Ej.: 3• Métodos indirectos – El anticuerpo primario aplicado sobre las células es reconocido por un segundo anticuerpo, secundario, unido a un marcador – El anticuerpo secundario se aplica a una concentración en exceso. – Es más sensibles que los directos pues al anticuerpo primario se pueden unir más de un anticuerpo secundario, incrementando la señal. – basta con disponer de unos pocos secundarios marcados para poder reconocer un gran número de anticuerpos primarios diferentes 22
  23. 23. Preparación y tinción de las muestras en microscopía ópticaTinción de estructuras específicas Sistemas de marcaje inmunocitoquímico• Métodos del anticuerpo no marcado o de puente – Un problema importante en el uso de anticuerpos (primarios o secundarios) marcados • las técnicas químicas de formación de enlace covalente entre el anticuerpo y el marcador pueden destruir parcialmente la reactividad del anticuerpo. – En el método de puente sencillos la primera capa está formada por el anticuerpo primario (por ej. obtenido en conejo). La segunda capa por un anti-anticuerpo, secundario (por ejemplo oveja anti conejo), la tercera por un anticuerpo anti-peroxidasa (por ejemplo conejo anti peroxidasa) producido en la misma especie que el primario y la cuarta por peroxidasa. 23
  24. 24. Fundamentos y tipos de microscopios electrónicos Microscopio electrónico• Se emplean haces de electrones para producir un imagen• La longitud de onda de los haces de electrones es mucho menor que la de la luz, dando lugar a un gran aumento de la 0,2 µm resolución 24
  25. 25. Fundamentos y tipos de microscopios electrónicosMicroscopio electrónico detransmisión• Los electrones se dispersan cuando atraviesan una sección fina de la muestra• Los electrones transmitidos (aquellos que no se dispersan) se emplean para producir una imagen• Las regiones más densas de la muestra dispersan más electrones y aparecen más oscuras 25
  26. 26. Fundamentos y tipos de microscopios electrónicos Microscopio electrónico de barrido a partir• Crea la imagen de los electrones reflejados en la superficie de la muestra• Produce imágenes en 3D de las características superficiales de la muestra 26
  27. 27. Preparación y tinción de las muestras en microscopía electrónicaPreparación de la muestra• Los procedimientos son similares a los empleados en microscopía óptica• Para la microscopía electrónica de transmisión las muestras deben ser cortadas muy finas (de 1-2 µm a 60 nm) con un ultramicrotomo• También pueden fracturarse en frio (criofractura) con una cuchilla quedando expuesta la membrana interna 27
  28. 28. Preparación y tinción de las muestras en microscopía electrónicaPreparación de la muestra• La muestra se fija químicamente (Ej.: Glutaraldehido) y se tiñe con materiales electrodensos (Uranilo, platino y plomo)• También puede emplearse inmunodetección si se marcan los anticuerpos con oro coloidal (esferas de 2-3 nm adsorbidas a los anticuerpos) 28
  29. 29. Preparación y tinción de las muestras en microscopía electrónica 0,5 µm 0,5 µmOchoa de Alda et al. 2004 Immunolocalization of NblA, a protein involved in phycobilisome turnover, 29during heterocyst differentiation in cyanobacteria.
  30. 30. Preparación y tinción de las muestras en microscopía electrónica Otros métodos de preparación• Sombreado – Recubrimiento de la muestra con una capa fina de un metal pesado – La muestra se recubre desde un lado de forma que unas áreas se cubren más que otras – La zona cubierta, más electrodensa se ve clara y la zona menos cubierta más oscura 30
  31. 31. Nuevas técnicas de microscopía Nuevas técnicas de microscoíaMicroscopía confocal de barrido por láser (MCBL)• Se emplean haces de luz láser para iluminar la muestra• Un ordenador recoge y agrupa las imágenes de cada punto para generar una imagen tridimensional• Permite controlar la profundidad del campo que se observa eliminando o reduciendo la información fuera del plano• Permite recolectar secciones ópticas seriadas de especímenes gruesos 31
  32. 32. Nuevas técnicas de microscopíaMicroscopía confocal de barridopor láser (MCBL) Cultured epithelial cells triple stained for the nucleus (blue), microtubules (green), and actin (red). Images were acquired with a 20X objective (left) and a 100X objective (right). 32
  33. 33. Nuevas técnicas de microscopíaMicroscopía con sonda de Barrido – Tiene una enorme resolución – Permite observar incluso átomos• Microscopio de efecto tunel (Scanning tunneling microscope, STM) – Permite ver átomos (sustancias conductoras) en la superficie de un sólido Los electrones que rodean los átomos de l – Un punta muy fina (terminada en un solo superficie se proyectan desde el borde de l átomo) se aproxima a la muestra superficie a una corta distancia – Una corriente constante (tunneling current) se aplica entre la sonda y la muestra – Para mantener la corriente constante a medida que se desplaza la sonda, ésta debe moverse alejándose y acercándose a la muestra – Las variaciones de corriente son detectados y empleadas para crear una imagen 33
  34. 34. Nuevas técnicas de microscopíaMicroscopía con sonda de Barrido• Microscopio de fuerza atómica (Atomic force microscope, AFM) – Similar a la microscopia de efecto túnel pero para materiales no conductores ya que no aplica un voltaje – Un punta muy fina se mueve sobre la superficie de la muestra a una distancia constante – A medida que la sonda se mueve a lo largo de la superficie de la muestra los electrones de la sonda de metal son repelidos por las nubes electrónicas de los átomos de la misma. La altura de la sonda se ajusta de modo automático para mantener constante la fuerza recibida. – Los movimientos ascendentes y descendentes de la sonda son detectados y empleados para crear una imagen – Se emplea para muestras poco conductoras 34
  35. 35. Nuevas técnicas de microscopíaMicroscopía con sonda de Barrido 2 nm Imagen AFM del virus del mosaico de nabo amarillo en el que se observa la estrutura Características de la cápsula superficiales de una espora de Bacillus atrophaeus (a) Espora Imagen STM del ADN hidratada (b), Detalle de ésta mostrando estructuras de cilindros ordenados que se pliegan tras hidratarse (c). Imagenes AFM a–e) Imagenes AFM de la compactación progresiva del ADN de levadura por el efecto de 35 la proteína AbF2.

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