Chuyển hóa phụ phẩm công-nông nghiệp để thu nhận bioethanol

i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn
khoa học của TS. Đỗ Hữu Nghị và PGS.TS. Tăng Thị Chính. Các số liệu và kết quả được
nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào
khác.
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Tác giả
Vũ Đình Giáp

ii
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Hữu Nghị, Viện Hóa học các hợp
chất thiên nhiên và PGS.TS. Tăng Thị Chính, Viện Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, sửa
luận án và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành Bản luận án này.
Tôi xin cảm ơn Phòng Đào tạo Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Học viện
Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều
kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên
cứu.
Tôi xin cảm ơn tập thể Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất
thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình
cho tôi trong quá trình thực nghiệm cũng như chia sẻ những kinh nghiệm chuyên môn
quý báu.
Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ Đề tài Hợp tác song phương Việt Nam - Bỉ
(Mã số: FWO.104.2017.03) và Đề tài Nghị định thư Việt Nam - CHLB Đức (Mã số:
NĐT.45.GER/18) do TS. Đỗ Hữu Nghị làm chủ nhiệm.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã giúp đỡ,
tạo điều kiện và động viên tôi trong suốt thời gian học tập.
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Tác giả
Vũ Đình Giáp

iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN……………………………………………………………………...…I
LỜI CẢM ƠN……………………………………………………………………………II
MỤC LỤC.................................................................................................................... III
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................VII
DANH MỤC HÌNH…...………………………………………………………………………VIII
DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT………………………………………………..XI
MỞ ĐẦU........................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 5
1.1. Phụ phẩm công - nông nghiệp giàu lignocellulose.................................................... 5
1.1.1. Nguồn gốc và thành phần .................................................................................. 5
1.1.2. Nguồn nguyên liệu bã mía ............................................................................... 10
1.1.2.1. Nguồn gốc và hiện trạng sử dụng bã mía ở Việt Nam……………………...10
1.1.2.2. Các vấn đề môi trường từ bã mía ........................................................... 11
1.2. Chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose ................................................................. 12
1.2.1. Quá trình thủy phân vật liệu giàu lignocellulose .............................................. 12
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến xúc tác sinh học...................................................... 15
1.2.3. Đa dạng nấm Việt Nam cho chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose ............... 18
1.2.4. Ứng dụng của enzyme trong quá trình thủy phân lignocellulose ...................... 20
1.2.5. Vai trò carbohydrat esterase trong thủy phân lignocellulose............................. 23
1.2.5.1. Acetyl esterase từ nấm ........................................................................... 24
1.2.5.2. Feruloyl esterase từ nấm ........................................................................ 25
1.3.Tình hình sản xuất bioethanol ................................................................................. 28
1.3.1. Hiện trạng sản xuất và sử dụng bioethanol....................................................... 28
1.3.2. Nguồn sinh khối cho sản xuất bioethanol......................................................... 33
1.3.3. Lên men sản xuất bioethanol ........................................................................... 35
1.4. Tình hình nghiên cứu bioethanol trong và ngoài nước ............................................ 38
1.4.1. Tình hình nghiên cứu bioethanol ngoài nước................................................... 38

iv
1.4.2. Tình hình nghiên cứu bioethanol trong nước.................................................... 41
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............................. 44
2.1. Vật liệu................................................................................................................... 44
2.1.1. Vật liệu giàu lignocellulose ............................................................................. 44
2.1.2. Vi sinh vật…………………………………………. …………..……………...44
2.1.3. Thiết bị, hóa chất............................................................................................. 45
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 45
2.2.1. Phương pháp vi sinh vật .................................................................................. 45
2.2.1.1. Phân lập nấm......................................................................................... 45
2.2.1.2. Nuôi cấy và bảo quản nấm men.............................................................. 46
2.2.1.3. Lên men bioethanol................................................................................ 47
2.2.2. Định danh nấm ............................................................................................... 48
2.2.2.1. Định danh nấm bằng phương pháp hình thái giải phẫu.......................... 48
2.2.2.2. Định danh nấm bằng phương pháp sinh học phân tử ............................. 49
2.2.3. Sàng lọc hoạt tính esterase và lựa chọn chủng nấm......................................... 50
2.2.3.1. Sàng lọc trên đĩa thạch.......................................................................... 50
2.2.3.2. Sàng lọc trên môi trường lên men bề mặt và dịch thể ............................ 50
2.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt độ enzyme........................................................... 51
2.2.4.1. Hoạt độ acetyl esterase .......................................................................... 51
2.2.4.2. Hoạt độ feruloyl esterase ....................................................................... 52
2.2.5. Xác định điều kiện thích hợp sinh tổng hợp esterase....................................... 52
2.2.5.1. Xác định nguồn nitơ và cơ chất giàu lignocellulose................................ 52
2.2.5.2. Xác định nhiệt độ, pH thích hợp...............................................................52
2.2.6. Tinh sạch protein enzyme................................................................................ 53
2.2.6.1. Tách chiết, tinh sạch protein enzyme...................................................... 53
2.2.6.2. Xác định hàm lượng protein................................................................... 53
2.2.6.3. Điện di trên gel polyacrylamide có SDS.....................................................54
2.2.6.4. Điện di điểm đẳng điện...............................................................................54
2.2.6.5. Xác định nhiệt độ và pH tối ưu của enzyme tinh sạch................................54

v
2.2.6.6. Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của enzyme tinh sạch ..................... 55
2.2.7. Phương pháp hóa sinh..................................................................................... 55
2.2.7.1. Sắc ký bản mỏng .................................................................................... 55
2.2.7.2. Sắc kí lỏng hiệu năng cao....................................................................... 55
2.2.7.3. Xác định peptide bằng phổ khối sử dụng nguồn ion hóa mẫu ESI-MS…...56
2.2.7.4. Định lượng đường khử theo phương pháp axit dinitrosalicylic............... 57
2.2.7.5. Xử lý nguyên liệu……………..………………………………………………….58
2.2.7.6. Xác định hàm lượng bioethanol.............................................................. 59
2.2.8. Xúc tác chuyển hóa sinh học các vật liệu giàu lignocellulose........................... 60
2.2.9. Quy hoạch thực nghiệm................................................................................... 61
2.2.10. Xử lý số liệu.................................................................................................. 63
2.3. Xây dựng sơ đồ nghiên cứu ................................................................................... 63
2.3.1. Sơ đồ xác định các điều kiện thích hợp cho mô hình tối ưu thực nghiệm ........ 63
2.3.2. Sơ đồ xử lý bã mía bằng phương pháp hóa lý kết hợp “enzyme cocktail” ....... 66
2.3.3. Sơ đồ lên men bioethanol từ dịch đường chuyển hóa....................................... 68
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................... 70
3.1. Phân lập và sàng lọc nấm....................................................................................... 70
3.1.1. Ngành nấm đảm Basidiomycota ...................................................................... 70
3.1.2. Ngành nấm túi Ascomycota............................................................................. 70
3.2. Khả năng sinh tổng hợp esterase và lựa chọn chủng nấm........................................ 70
3.3. Định danh các chủng phân lập hoạt tính cao .......................................................... 75
3.3.1. Định danh chủng SP66 .................................................................................... 75
3.3.2. Định danh chủng A35...................................................................................... 78
3.4.Nghiên cứu sinh tổng hợp esterase .......................................................................... 81
3.4.1. Nghiên cứu sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35............... 81
3.4.2. Nghiên cứu sinh tổng hợp feruloyl esterase bởi nấm Alt. tenuissima SP66 ......... 86
3.5. Tinh sạch enzyme từ môi trường nuôi cấy nấm....................................................... 91
3.5.1. Tinh sạch và đặc tính acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35................... 91
3.5.2. Tinh sạch và đặc tính feruloyl esterase bởi nấm Alt. tenuissima SP66.............. 95

vi
3.5.3. Quy trình lên men, chiết tách và tinh sạch enzyme esterase từ nấm.................100
3.5.3.1. Acetyl esterase từ nấm X. polymorpha A35...........................................100
3.5.3.2. Feruloyl esterase từ nấm Alt. tenuissima SP66 …………………….…….103
3.6. Sàng lọc nguồn cơ chất giàu lignocellulose cho chuyển hóa bằng xúc tác sinh học105
3.6.1. Sàng lọc cơ chất..............................................................................................105
3.6.2. Hàm lượng đường khử sau chuyển hóa sinh học.............................................106
3.7.Tối ưu hóa “enzyme cocktail” bằng mô hình quy hoạch thực nghiệm ....................107
3.8.Kết hợp xử lý hóa học nâng cao hiệu quả chuyển hóa ............................................115
3.8.1. Kết hợp thủy phân bã mía bằng kiềm và “enzyme cocktail”............................115
3.8.2. Kết hợp thủy phân bã mía bằng axít và “enzyme cocktail”..............................117
3.8.3. Kết hợp thủy phân bã mía bằng thiết bị gia nhiệt và “enzyme cocktail” ..........119
3.8.4. Hàm lượng các đường đơn sau chuyển hóa.....................................................121
3.9.Nghiên cứu sản xuất bioethanol .............................................................................122
3.9.1. Ảnh hưởng thành phần môi trường.................................................................122
3.9.2. Ảnh hưởng thời gian lên men..........................................................................124
3.9.3. Ảnh hưởng pH................................................................................................127
3.9.4. Ảnh hưởng nhiệt độ ........................................................................................128
3.9.5. Ảnh hưởng tỷ lệ nấm men...............................................................................130
3.9.6. Đề xuất quy trình sản xuất bioethanol từ bã mía .............................................133
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................136
KẾT LUẬN.................................................................................................................136
KIẾN NGHỊ................................................................................................................137
DANH SÁCH CÔNG BỐ KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN..................138
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................139

vii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần một số nguồn sinh khối giàu lignocellulose ................................. 6
Bảng 1.2. Một số dự án sản xuất bioethanol nhiên liệu tại Việt Nam ............................. 32
Bảng 2.1. Thành phần môi trường lên men.…………......................................................48
Bảng 3. 1. Hoạt tính feruloyl esterase và acetyl esterase của các chủng nấm.................. 71
Bảng 3. 2. Tinh sạch enzyme hoạt tính acetyl esterase (XpoAE)................................... 93
Bảng 3. 3. Tinh sạch enzyme AltFAE từ dịch lên men nấm Alt. tenuissima SP66 .......... 96
Bảng 3. 4. Các đoạn peptide của enzyme AltFAE tinh sạch từ nấm Alt. tenuissima SP66
xác định bằng thủy phân với trypsin và LC-ESI-MS/MS............................................... 99
Bảng 3. 5. Hoạt tính đặc hiệu của “enzyme cocktail” trong chuyển hóa sinh học......... 100
Bảng 3. 6. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển hóa......................................... 108
Bảng 3. 7. Kế hoạch trực giao bậc hai Box – Wilson ................................................... 111
Bảng 3. 8. Kết quả thí nghiệm theo kế hoạch trực giao bậc hai Box – Wilson.............. 111
Bảng 3. 9. Ma trận kế hoạch và kết quả thực nghiệm................................................... 112
Bảng 3. 10. Các hệ số hồi quy và giá trị T ................................................................... 113
Bảng 3. 11. Kết quả thực nghiệm so sánh với kế hoạch trực giao Box – Wilson .......... 114
Bảng 3. 12. Tổng đường khử sau quá trình thủy phân bã mía bằng thiết bị gia nhiệt và
“enzyme cocktail” ....................................................................................................... 120
Bảng 3. 13. Hàm lượng một số các đường đơn trong dung dịch sau chuyển hóa......... 121
Bảng 3. 14. Hiệu suất quá trình lên men trên môi trường BM và BM+
........................ 123
Bảng 3. 15. Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất lên men .............................................. 124
Bảng 3. 16. Ảnh hưởng pH đến hiệu suất lên men ...................................................... 127
Bảng 3. 17. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất lên men .............................................. 128
Bảng 3. 18. Ảnh hưởng tỷ lệ nấm men đến hiệu suất lên men...................................... 130

viii
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc của lignocellulose .............................................................................. 6
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của cellulose ........................................................................ 7
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của xylan............................................................................... 9
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của lignin.............................................................................. 9
Hình 1.5. Hiện trạng sản xuất mía đường các vùng của Việt Nam ................................. 11
Hình 1.6. Vai trò tiền xử lý trong chuyển đổi sinh khối thành nhiên liệu........................ 15
Hình 1.7. Cấu trúc các enzyme tham gia vào quá trình chuyển hóa lignocellulose ......... 19
Hình 1.8. Hệ cellulase tham gia thủy phân mạch cellulose............................................. 21
Hình 1.9. Cấu trúc xylan được tấn công bởi những enzyme thủy phân khác nhau............ 23
Hình 1.10. Liên kết dạng cầu nối của axit ferulic và dimer với arabinoxylan và lignin... 25
Hình 1.11. Nếp gấp đặc trưng α/β-hydrolase.................................................................. 27
Hình 1.12. Sản lượng nhiên liệu sinh học giai đoạn 2008 – 2022................................... 29
Hình 1.13. Sản lượng bioethanol tại một số quốc gia và khu vực trên thế giới ............... 30
Hình 1.14. Cấu trúc amylose ......................................................................................... 34
Hinh 2. 1. Đường chuẩn biểu thị liên hệ giữa mật độ quang và nồng độ ρ-Nitrophenol. 51
Hinh 2. 2 Hệ thống siêu lọc 10 kDa cut-off trên thiết bị amicon Ultra Centrifugal........ 53
Hinh 2. 3. Phương trình phản ứng giữa đường khử và axít dinitrosalicylic.................... 57
Hinh 2. 4. Đường chuẩn glucose biểu thị giữa mật độ quang và nồng độ glucose ......... 58
Hinh 2. 5. Sơ đồ xác định các điều kiện thích hợp cho mô hình tối ưu thực nghiệm....... 64
Hinh 2. 6. Sơ đồ xử lý bã mía theo phương pháp hóa lý kết hợp “enzyme cocktail” ...... 66
Hinh 2. 7. Sơ đồ lên men bioethanol từ dịch đường chuyển hóa.................................... 68
Hình 3. 1. Hoạt tính feruloyl esterase của chủng nấm phân lập Alt. tenuissima SP66..... 73
Hình 3. 2. Hình ảnh điện di ADN tổng số trên gel agarose 1% (A) và (B) Sản phẩm PCR
của hai chủng nấm (SP66 và A35)................................................................................. 75
Hình 3. 3. Mối quan hệ họ hàng của chủng SP66 với các loài/dưới loài trong cùng chi. 77
Hình 3. 4. Chủng Alt. tenuissima SP66 phát triển trên MT thạch và hình thái bào tử....78
Hình 3. 5. Mối quan hệ họ hàng của chủng nấm A35 với các loài/thứ trong cùng chi .... 80

ix
Hình 3. 6. Động học sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35 trên môi
trường rắn ……………………………………………………………………………......80
Hình 3. 7. Sự phát triển của nấm X. polymorpha A35 trên MT lỏng ở ngày thứ 10 ........ 82
Hình 3. 8. Động học sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35 trên các
môi trường có bổ sung cơ chất....................................................................................... 83
Hình 3. 9. Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau bởi nấm X. polymorpha A35.. 84
Hình 3. 10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X.
polymorpha A35 trên môi trường lỏng .......................................................................... 85
Hình 3. 11. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh tổng hợp acetyl esterase ............................. 86
Hình 3. 12. Động học sinh tổng hợp feruloyl esterase (A) và hoạt tính enzyme cao nhất
(B) trên các môi trường khác nhau................................................................................. 87
Hình 3. 13. Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau ……………………………89
Hình 3. 14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh tổng hợp feruloyl esterase .................. 90
Hình 3. 15. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh tổng hợp feruloyl esterase ......................... 91
Hình 3. 16. Tinh sạch enzyme XpoAE từ X. polymorpha A35 qua các bước sắc ký lỏng92
Hình 3. 17. Protein tinh sạch (1,3) biểu hiện hoạt tính acetyl esterase (XpoAE) trên gel
điện di SDS-PAGE (A) và IEF (B); (2,4) protein marker............................................... 93
Hình 3. 18. Ảnh hưởng của pH (A) và nhiệt độ (B) đến hoạt tính của XpoAE tinh sạch 94
Hình 3. 19. Độ bền của enzyme XpoAE tinh sạch bởi nấm X. polymorpha A35 (XpoAE)
ở các điều kiện nhiệt độ (A) và pH (B) khác nhau ......................................................... 95
Hình 3. 20. Tinh sạch enzyme AltFAE từ nấm Alt.tenuissima SP66 qua cột sắc ký trao đổi
anion Q Sepharose®
....................................................................................................... 96
Hình 3. 21. Protein tinh sạch (1) biểu hiện hoạt tính AltFAE trên gel điện di SDS-PAGE
(A); (2) protein marker .................................................................................................. 97
Hình 3. 22. Ảnh hưởng của nhiệt độ (A) và pH (B) đến hoạt tính enzyme AltFAE từ nấm
Alt. tenuissima SP66...................................................................................................... 97
Hình 3. 23. Độ bền nhiệt của enzyme AltFAE từ nấm Alt. tenuissima SP66 ở nhiệt độ
khác nhau (A) và giá trị pH (B) phụ thuộc vào thời gian................................................ 98

x
Hình 3. 24. Dữ liệu phổ ESI-MS/MS các đoạn peptide của enzyme AltFAE tinh sạch từ
nấm Alt. tenuissima SP66 .............................................................................................. 99
Hình 3. 25. Quy trình chiết tách và tinh sạch protein enzyme hoạt tính acetyl esterase từ
môi trường nuôi cấy nấm X. polymorpha A35 ............................................................. 102
Hình 3. 26. Quy trình chiết tách và tinh sạch enzyme hoạt tính feruloyl esterase từ môi
trường lên men nấm Alt. tenuissima SP66.................................................................... 104
Hình 3. 27. Vết chất đường đơn xuất hiện trên bản mỏng ............................................ 105
Hình 3. 28. Hàm lượng đường khử tạo thành sau quá trình thủy phân bã mía bằng các
đơn enzyme và “enzyme cocktail”............................................................................... 107
Hình 3. 29. Đường khử sinh ra sau quá trình xử lý bã mía bằng kiềm và “enzyme
cocktail” ...................................................................................................................... 116
Hình 3. 30. Đường khử sinh ra sau quá trình thủy phân bã mía bằng axít và “enzyme
cocktail” ...................................................................................................................... 118
Hình 3. 31. Ảnh hưởng thành phần môi trường đến hiệu suất lên men......................... 124
Hình 3. 32. Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất lên men............................................... 126
Hình 3. 33. Ảnh hưởng pH đến hiệu suất lên men........................................................ 128
Hình 3. 34. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất lên men................................................ 129
Hình 3. 35. Ảnh hưởng tỷ lệ giống nấm men đến hiệu suất lên men............................. 131
Hình 3. 36. Quy trình sản xuất bioethanol từ bã mía .................................................... 134

xi
DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt
BLAST Basic local alignment search tool Công cụ so sánh các chuỗi sinh học
bp Base pair Cặp bazơ nitơ
M Marker Thang chuẩn
CMC Carboxymethyl cellulose Carboxymethyl cellulose
DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic
kb Kilo base Kilo base
kDa Kilo Dalton Kilo Dalton
ĐC Đối chứng
OD Optical density Mật độ quang
PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi tổng hợp
SDS Sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis
Điện di trên gel
polyacrylamide có SDS
TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng
v/v Volume/volume Thể tích/thể tích
w/v Weight/volume Khối lượng/thể tích
DNS Acid dinitrosalicylic
HPLC High performance liquid
chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
CE Carbohydrate esterase
AE Enzyme acetyl esterase
FAE Enzyme Feruloy esterase
rpm Revolutions per minute Số vòng/phút
NLSH Nhiên liệu sinh học
gds Gram dry sustrate Gam cơ chất khô
IEF Isoelectric focusing Điểm đẳng điện
CT Công thức
KXĐ Không xác định

1
MỞ ĐẦU
Hiện nay, nhu cầu năng lượng luôn là vấn đề nan giải của bất kì quốc gia nào trên
thế giới. Trong số các nguồn năng lượng thay thế dầu mỏ đang sử dụng hiện nay (năng
lượng gió, mặt trời, hạt nhân,…), năng lượng sinh học đang là xu thế phát triển tất yếu,
nhất là ở các nước nông nghiệp và nhập khẩu nhiên liệu. Dựa vào nguyên liệu sản xuất,
người ta chia NLSH thành 4 thế hệ: Thế hệ I (từ tinh bột như ngô, sắn, mía đường), thế
hệ II (từ sinh khối thực vật như thân cây lúa, ngô, lúa mỳ, bã mía), thế hệ thứ III (từ các
loài vi tảo) và thế hệ IV - nhiên liệu tiên tiến (dựa trên các chuyển hóa sinh - hóa, nhiệt –
hóa). Chúng phân thành ba nhóm là dầu sinh học (biodiesel), khí sinh học (biogas) và
bioethanol (ethanol sinh học). Trong đó, bioethanol đang rất được quan tâm do từ ngày
01/01/2018 chính phủ ban hành quyết định sử dụng xăng sinh học E5 (5% bioethanol)
thay thế xăng RON 92 trên toàn quốc. Do vậy, nhu cầu sản xuất và tiêu thụ bioethanol
ngày càng tăng cao.
Việc sản xuất nhiên liệu sinh học nói chung và bioethanol theo thế hệ I từ nguồn
tinh bột (sắn, bắp) và đường (mía) rất phổ biến. Bên cạnh đó, bioethanol còn được sản
xuất từ lignocellulose theo thế hệ thứ II. Nguồn nguyên liệu này chủ yếu bao gồm: gỗ,
rơm lúa, bã mía, thân cây ngô…là các sinh khối có thành phần lignocellulose phổ biến
nhất trong số các phụ phẩm công-nông nghiệp. Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu này sử
dụng chưa hiệu quả mà chủ yếu theo phương pháp truyền thống như làm cơ chất nuôi
nấm, thức ăn gia súc, ủ làm phân bón, đốt... Do vậy, việc tận dụng nguồn cơ chất này để
sản xuất bioethanol là một giải pháp thích hợp, đặc biệt là với các quốc gia với nền nông
nghiệp như Việt Nam. Mặc dù nguồn nguyên liệu giàu lignocellulose rất phổ biến nhưng
những khó khăn để có thể tận dụng hiệu quả nguồn sinh khối này cho sản xuất các sản
phẩm có giá trị cao hơn chủ yếu do lignocellulose có cấu trúc phức tạp, khó chuyển hóa
sinh học. Việc sản xuất bioethanol từ nguồn sinh khối phụ phẩm công - nông nghiệp một
mặt tận dụng nguồn nguyên liệu rồi rào thay thế nguồn nguyên liệu truyền thống, mặt
khác tạo thành nguồn năng lượng sạch giúp giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường do đốt
hoặc xử lý theo phương pháp truyền thống gây ra, đồng thời không ảnh hưởng tới an ninh

2
lượng thực quốc gia. Đây cũng chính là một trong những khâu then chốt trong công nghệ
lên men sản xuất bioethanol thế hệ II. Theo phương thức truyền thống có thể sử dụng
phương pháp hóa học (axít/bazơ) hoặc hóa lý (nghiền/nổ hơi). Tuy nhiên, một trong
những hướng đi mới để giải quyết nhiệm vụ này là sử dụng xúc tác sinh học (enzyme từ
các loài nấm), chúng được biết là có hệ enzyme xúc tác hiệu quả giúp chúng phân hủy tốt
lignocellulose để giải phóng các đơn vị đường cần thiết cho quá trình lên men bioethanol.
Nhìn chung các enzyme thủy phân lignocellulose hoạt động yếu khi sử dụng trực tiếp
trên cơ chất thô và việc xúc tác chuyển hóa hiệu quả cơ chất cần kết hợp nhiều enzyme
có tác dụng hiệp đồng. Do vậy, mục đích của đề tài luận án “Nghiên cứu phối hợp
esterase và hệ enzyme thủy phân từ nấm trong chuyển hóa phụ phẩm công-nông
nghiệp để thu nhận bioethanol” nhằm sử dụng hỗn hợp các enzyme phù hợp (“enzyme
cocktail”) bao gồm hệ enzyme esterase (acetyl esterase và feruloyl esterase), enzyme
thủy phân và/hoặc oxy hóa từ nấm để phân hủy các cấu trúc polymer phức tạp để lên men
thu nhận bioethanol.
Mục tiêu nghiên cứu:
Hiên nay, khả năng chuyển hóa các vật liệu thô từ sinh khối giàu lignocellulose
bằng các phương pháp truyền thống còn nhiều mặt hạn chế. Do vậy, mục tiêu của đề tài
luận án nhằm khai thác nguồn đa dạng xúc tác sinh học (enzyme thủy phân) từ nấm để
chuyển hóa hiệu quả sinh khối giàu lignocellulose từ các phụ phẩm công-nông nghiệp
thành các đường (C5 và C6) có khả năng lên men cho sản xuất bioethanol. Đặc biệt, luận
án sử dụng “enzyme cocktail” xúc tác hiệp đồng để tăng khả năng chuyển hóa sinh học.
Trong đó, nghiên cứu sử dụng carbohydrate esterase [feruloyl esterase (FAE), acetyl
esterase (AE)] nhằm phối hợp với các enzyme tấn công mạch chính (cellulase/xylanase)
và mạch nhánh để thủy phân cấu trúc lignocellulose. Mục tiêu tiếp theo là đánh giá khả
năng lên men nguồn dịch đường sau thủy phân bằng “enzyme cocktail” thành bioethanol.
Nội dung nghiên cứu:
Để đạt được mục tiêu trên, các nội dung nghiên cứu chính đã thực hiện:
- Phân lập, sàng lọc và tuyển chọn các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp
enzyme carbohydrate esterase [feruloyl esterase (FAE), acetyl esterase (AE)];

3
- Sinh tổng hợp và tinh sạch protein enzyme hoạt tính FAE và AE từ môi trường
nuôi cấy nấm và xác định đặc tính của enzyme tinh sạch.
- Chuyển hóa vật liệu lignocellulose thành các đường đơn (hexose và pentose) có
khả năng lên men sử dụng đơn enzyme và “enzyme cocktail” hoạt tính
cellulase/xylanase và esterase xúc tác hiệp đồng.
- Tối ưu quy trình chuyển hóa và nghiên cứu sản xuất bioethanol từ dịch đường
chuyển hóa quy mô phòng thí nghiệm.
Những đóng góp mới của luận án:
- 44 chủng nấm thuộc 13 họ thuộc ngành nấm Túi (Ascomycota) và nấm Đảm
(Basidiomycota) được phân lập và sàng lọc khả năng sinh tổng hợp carbohydrate
esterase (feruloyl esterase và acetyl esterase).
- Lần đầu tiên, enzyme feruloyl esterase từ nấm Alternaria tenuissima và acetyl
esterase từ nấm Xylaria polymorpha được phân lập và tinh sạch từ môi trường nuôi
cấy giàu lignocellulose. Trong đó, feruloyl esterase từ Alt. tenuissima (AltFAE) có
trọng lượng phân tử Mw = 30,3 kDa với hoạt tính đặc hiệu 11,2 U/mg. Acetyl esterase
từ X. polymorpha (XpoAE) có trọng lượng phân tử Mw = 44 kDa với hoạt tính đặc
hiệu 13,1 U/mg. Hai enzyme này có độ bền cao trong khoảng nhiệt độ 40 đến 450
C
và pH 5,0.
- Enzyme carbohydrate esterases tinh sạch kết hợp với enzyme thương mại (hỗn hợp
“enzyme cocktail” hoạt tính cellulase/xylanse (cell/xyl)) được tối ưu thành phần và sử
dụng để chuyển hóa sinh khối thực vật thô (vd. mía bã mía, rơm rạ, bột gỗ, rong
túi…) thành các đường đơn có khả năng lên men bioethanol. Trong đó, bã mía được
chọn làm cơ chất phù hợp để sản xuất các đường C5/C6 (vd: glucose, xylose).
- Bằng quy hoạch thực nghiệm đã xác định điều kiện tối ưu cho chuyển hóa bã mía
bằng “enzyme cocktail” là ở 400
C, pH 5.0, trong 48 giờ và hoạt độ enzyme là
cell/xyl: 100 U/g, AltFAE: 7,56 U/g, XpoAE: 10,8 U/g sinh khối khô. Khi đó, tổng
các đường lên men là 251,86 mg/g. Kết hợp xử lý bã mía bằng “enzyme cocktail” và
axit H2SO4 loãng (0,1%) thì các đường lên men sinh ra là 319,5 mg/g, đạt hiệu suất
49,8%.

4
- Các đường đơn thu được bằng chuyển hóa enzyme đã được chứng minh có khả năng
lên men bioethanol (cồn sinh học) bởi chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae với
hàm bioethanol thu được 178ml/kg bã mía, đạt hiệu suất 79,8% so với lý thuyết.
Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án:
Bên cạnh sản xuất bioethanol từ nguồn tinh bột (sắn, bắp) và đường (mía),
bioethanol có thể được sản xuất từ lignocellulose. Lignocellulose là loại sinh khối
(biomass) phổ biến nhất trong sinh quyển. Sản xuất bioethanol từ nguồn sinh khối là một
giải pháp thích hợp, đặc biệt là với các quốc gia với nền nông nghiệp như Việt Nam.
Hàng năm sản xuất công-nông nghiệp trong nước sản sinh hàng trăm triệu tấn phụ phẩm
giàu lignocellulose là nguồn cung cấp nguyên liệu vô cùng dồi dào cho sản xuất năng
lượng sạch, mặt khác giải quyết vấn đề ô môi trường do không được xử lý hay loại bỏ
theo phương pháp truyền thống.
Theo các tài liệu công bố và kinh nghiệm nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, nhìn
chung các enzyme thủy phân lignocellulose hoạt động yếu khi sử dụng trực tiếp (không
qua tiền xử lý) trên cơ chất thô. Điều này có thể khắc phục bằng việc sử dụng hỗn hợp
các enzyme phù hợp (“enzyme cocktail”) bao gồm hệ enzyme thủy phân và/hoặc oxy hóa
để phân hủy các cấu trúc polymer phức tạp. Ngoài ra, sàng lọc enzyme bằng nuôi cấy vi
sinh vật có vai trò quan trọng trong việc tìm ra các enzyme mới với hoạt tính xúc tác thủy
phân cao và các đặc tính hữu ích.
Đề tài luận án không nhằm giải quyết được toàn bộ các bước từ chuyển hóa vật
liệu sinh khối thô thành bioethanol mà mục tiêu chính nhằm khai thác và sử dụng nguồn
xúc tác sinh học từ nấm và tối ưu hóa cho chuyển hóa sinh khối thành đường có khả năng
lên men. Đây cũng chính là một trong những khâu then chốt trong công nghệ lên men sản
xuất bioethanol thế hệ II.

5
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Phụ phẩm công - nông nghiệp giàu lignocellulose
1.1.1. Nguồn gốc và thành phần
Phụ phẩm công-nông nghiệp là một dạng sinh khối có thành phần lignocellulose
phổ biến nhất trong số các phụ phẩm công-nông nghiệp của Việt Nam. Hiện nay, mỗi
năm nguồn sinh khối này sản sinh ra hàng trăm triệu tấn từ quá trình sản xuất công-nông
nghiệp như: rơm rạ, bã cà phê, mùn gỗ, thân cây ngô, vỏ trấu và hàng chục triệu tấn bã
mía thường được sử dụng để đun nấu (lãng phí nhiệt trên 80%), cơ chất để trồng nấm,
thức ăn gia súc và phần lớn được đốt bỏ thu tro làm phân bón [1]. Việc đốt này gây ra
hiện tượng sương mù quang hóa rất độc hại là nguyên nhân gây nên một số bệnh về mắt,
phổi. Nguy hiểm hơn, chúng gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng ở vùng ven các thành
phố lớn và dọc các đường cao tốc làm giảm tầm nhìn dễ dẫn đến tai nạn giao thông. Đặc
biệt, gây lãng phí lượng lớn chất hữu cơ có giá trị, trong khi đó nếu khai thác sử dụng
hợp lý thì nguồn sinh khối này đem lại lợi ích vô cùng lớn [2,3].
Lignocellulose ngày càng có vai trò quan trọng về mặt kinh tế khi được sử dụng
như vật liệu thô cho các ứng dụng trong công nghệ sinh học và công nghiệp, hơn nữa
chúng chính là cơ sở để thúc đẩy việc nghiên cứu tận dụng sinh khối trong các mô hình
sản xuất tinh chế và chiến lược cho sự phát triển bền vững [4]. Các polymer sinh học này
có thể thấy ở tất cả các hệ sinh thái trên đất liền và đây là nguồn hợp chất hữu cơ tái tạo
lớn nhất trong sinh quyển. Xét về nguồn gốc, thành phần và mức độ polymer hóa, có thể
phân biệt các loại lignocellulose như: từ cây gỗ cứng, gỗ mềm cũng như từ cây trồng
hàng năm (đặc biệt là cây lúa, ngũ cốc, các loại cỏ, cây mía…) và thân cây thảo [5,6].
Lignocellulose là một phức hợp polyme thành tế bào ở thực vật, chiếm 60% tổng
sinh khối thực vật trên trái đất, bao gồm các thành phần chính là các polymer
carbohydrate (cellulose, hemicellulose) và một polymer thơm (lignin), trong đó cellulose
và hemicellulose chiếm tỉ lệ cao. Cellulose chiếm phần lớn, khoảng từ 40% - 50%, còn
hai hợp chất hemicellulose và lignin lần lượt chiếm khoảng 20 - 40% và 20 - 35% khối

6
lượng khô của cơ thể thực vật (Bảng 1.1) [1]. Ngoài các thành phần này, Lilholt còn cho
rằng pectin cũng là thành phần chính của lignocellulose thành tế bào, đặc biệt là ở các
cấu trúc sợi thực vật không phải thành phần gỗ [7].
Bảng 1.1. Thành phần một số nguồn sinh khối giàu lignocellulose [1]
Nguồn
lignocellulose
Cellulose
(%)
Hemicellulose
(%)
Lignin
(%)
Thành phần
khác (%)
Gỗ cứng 45-47 25-40 20-25 0,8
Gỗ mềm 40-45 25-29 30-36 0,5
Cỏ 25-40 35-50 - -
Bã mía 40 24 25 -
Lõi ngô 45 35 15
Rơm rạ 35 25 12
Bột giấy 50-70 12-20 6-10 -
Rơm lúa mì 30 50 20
Phế thải nông
nghiệp khác
37-50 35-50 5-15 12-16
Lignocellulose là một vật liệu khó thủy phân do chúng có các liên kết
polysaccharid (cellulose và hemicellulose), liên kết ester và ete (lignin) tạo nên cấu trúc
rất bền vững có độ cứng và độ bền cơ học cao (Hình 1.1). Xét về thành phần
lignocellulose bao gồm:
Hình 1.1. Cấu trúc của lignocellulose [8]

7
Cellulose:
Cellulose là một polymer mạch thẳng, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n. Các
đơn phân hoàn toàn cấu tạo từ đường D-glucose liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4-
glucoside với số lượng lên tới hơn 10.000 đơn vị. Cấu trúc liên kết thẳng cho phép hình
thành liên kết hydro trong và giữa phân tử tạo ra các vi sợi từ 36 chuỗi cellulose xếp song
song, hay cấu trúc tinh thể của cellulose. Mức độ trùng hợp của cellulose tự nhiên có thể
đạt 10.000-14.000 đơn vị glucose trên phân tử, khối lượng tương ứng là 1,5 triệu dalton
với chiều dài phân tử có thể lớn hơn hoặc bằng 5µm [9].
Giữa các chuỗi cellulose có rất nhiều gốc -OH tạo nên rất nhiều liên kết hydro
giúp ổn định sợi cellulose, làm cho sợi cellulose rất bền vững, khó thủy phân.
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của cellulose [10]
Sợi cellulose có thể kết hợp với nhau một cách chặt chẽ, có trật tự hình thành nên
vùng có cấu trúc tinh thể (Hình 1.2). Bên cạnh đó cũng có một số sợi cellulose kết hợp
một cách ngẫu nhiên hình thành nên vùng có cấu trúc vô định hình. Từ đó cho thấy các
dung môi và các chất hóa học rất khó xâm nhập vào vùng tinh thể, nhưng lại dễ dàng xâm
nhập vào vùng vô định hình [11].
Hemicellulose:
Hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng hợp khoảng
70 - 200 DP. Hemicellulose chứa cả đường 6 gồm D-glucose, D-mannose, D-galactose
và đường 5 gồm D-xylose và L-arabinose. Thành phần cơ bản của hemicellulose là β-D
xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β-(1,4). Cấu tạo của hemicellulose khá
phức tạp và đa dạng tùy vào nguyên liệu, tuy nhiên có một vài điểm chung bao gồm [12]:

8
Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β-(1,4), xylose là thành
phần quan trọng nhất và nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl-O- liên kết với vị trí 2
hoặc 3.
Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide hoặc
trisaccharide. Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và với lignin là
nhờ các mạch nhánh này. Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại ở dạng vô
định hình và vì thế dễ bị thủy phân. Tùy theo loại gỗ (gỗ cứng, gỗ mềm) mà chúng có đặc
điểm hemicellulose khác nhau:
Gỗ cứng chủ yếu có hai loại hemicellulose:
Acetyl-4-O-methyglucuronoxylan, là một loại polymer có mạch chính gồm β-D
xylopyranose liên kết với nhau bằng liên kết β-D(1,4). Trong đó 70% các nhóm -OH ở vị
trí C2 và C3 bị acetyl hóa, 10% các nhóm ở vị trí C2 liên kết với acid 4-O-methyl-D-
glucuronic. Gỗ cứng còn chứa glucomannan, polymer này chứa một tỉ lệ bằng nhau β-D-
glucopyranose và β-D-mannopyranose.
Loại thứ hai có mạch chính là β-D-galactopyranose, phân nhánh. Loại
hemicellulose này tạo liên kết -O tại nhóm OH ở vị trí C6 với α-L-arabinose, β-D-
galactose hoặc acid β-D-glucoronic [13].
Gỗ mềm cũng bao gồm hai loại hemicellulose chính:
Loại quan trọng nhất là galactoglucomannan, đây là polymer cấu thành từ các
phân tử D-mannopyranose liên kết với D-glucopyranose bằng liên kết β-(1,4) với tỉ lệ hai
monomer tương ứng là 3:1. Tuy nhiên, tỉ lệ này thay đổi tùy theo loại gỗ.
Arabino-4-O-methylglucuronoxylan, cấu tạo từ các D-xylopyranose, các monomer
này bị thế ở vị trí 2 bằng acid 4-O-methyl-glucuronic, ở vị trí 3 bằng α-L-
arabinofuranose.
Đối với cỏ, 20-40% hemicellulose là arabinoxylan. Polysaccharide này cấu tạo từ
các D-xylopyranose, OH ở C2 bị thế bởi acid 4-O-methylglucuronic. OH ở vị trí C3 sẽ tạo
mạch nhánh với α-L-arabinofuranose. Cấu tạo phức tạp của hemicellulose tạo nên nhiều
tính chất hóa sinh và lý sinh cho cây [13].

9
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của xylan [8]
Lignin:
Lignin là một polyphenol có cấu trúc mở. Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đóng vai
trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và
hemicellulose. Rất khó để có thể tách lignin ra hoàn toàn. Lignin là polymer, được cấu
thành từ các đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình được đề nghị là:
guaiacyl (G), chất gốc là rượu trans-coniferyl; syringly (S), chất gốc là rượu trans-
sinapyl; p-hydroxylphenyl (H), chất gốc là rượu trans-p courmary. Lignin là một hợp chất
cao phân tử có cấu trúc vô định hình khác với cellulose, lignin có chứa các nhóm
hydroxyl (-OH), nhóm methoxyl (-OCH3) và nhân benzen bao gồm các đơn vị cơ bản:
coniferyl alcohol, sinapyl alcohol và p-coumaryl alcohol, tỉ lệ ba loại rượu này trong các
loại thực vật khác nhau thì khác nhau (Hình 1.4). Lignin đặc biệt khó phân hủy do các
phân tử được nối với nhau bởi liên kết este và liên kết carbon, tạo thành một mạng lưới
liên kết ngang rộng rãi trong các tế bào [13].
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của lignin [13]

10
Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng, lignin hoàn toàn không đồng nhất trong
cấu trúc. Lignin dường như bao gồm vùng vô định hình và các vùng có cấu trúc hình
thuôn hoặc hình cầu. Lignin có liên kết hóa học với thành phần hemicellulose và ngay cả
với cellulose (không nhiều) độ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào bản
chất liên kết và cấu trúc hóa học của lignin và những đơn vị đường tham gia liên kết.
Carbon alpha (Cα) trong cấu trúc phenyl propane là nơi có khả năng tạo liên kết cao nhất
với khối hemicellulose. Ngược lại, các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose,
galactose, và acid 4-O-methylglucuronic là các nhóm thường liên kết với lignin. Các liên
kết có thể là ether, ester (liên kết với xylan qua axít 4-O-methyl-D-glucuronic) hay
glycoxit (phản ứng giữa nhóm khử của hemicellulose và nhóm OH phenolic của lignin).
Cấu trúc hóa học của lignin rất dễ bị thay đổi ở nhiệt độ cao và pH thấp, như quá trình
tiền xử lý bằng hơi nước hoặc trong môi trường axít/kiềm. Ở nhiệt độ phản ứng cao hơn
2000
C, lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách ra khỏi cellulose [15,16].
1.1.2. Nguồn nguyên liệu bã mía
1.1.2.1. Nguồn gốc và hiện trạng sử dụng bã mía ở Việt Nam
Về mặt tài nguyên tự nhiên như khí hậu, đất đai, Việt Nam được đánh giá là nước
có tiềm năng để phát triển cây mía. Việt Nam có đủ đất đồng bằng, lượng mưa nói chung
tốt (1400 mm đến 2000 mm/năm), nhiệt độ phù hợp, độ nắng thích hợp. Trên phạm vi cả
nước, các vùng tây nguyên và vùng Đông Nam Bộ, đặc biệt là vùng duyên hải Nam
Trung Bộ có khả năng rất tốt cho trồng mía đường.
Theo Hiệp hội Mía đường Việt Nam (VSSA), hiện nay mỗi năm các nhà máy
đường ép trên 15 triệu tấn mía, phát sinh ra 4,5 triệu tấn bã mía. Tại nhà máy đường
Bourbon (Tây Ninh) với công suất chế biến 8.000 tấn mía/ngày, thải ra khoảng 2.800 tấn
bã mía/ngày. Công ty đường Biên Hòa (Đồng Nai) có 3 nhà máy, trong đó 2 nhà máy sử
dụng mía làm nguyên liệu với tổng công suất 5.000 tấn mía/ngày. Mỗi năm, sản lượng
mía cây là 600.000 - 750.000 tấn, tương đương 174.000 - 217.500 tấn bã. Một phần bã
mía mang đốt tạo thành điện cho hoạt động của nhà máy, phần còn lại vẫn không sử dụng
hết, tồn dư rất lớn. Việc tận dụng toàn bộ lượng bã mía thải bỏ sẽ góp phần giảm bớt áp
lực cho các nguồn nguyên liệu sinh học khác như: cây bắp, khoai mì, gỗ...[17].

11
Hình 1.5. Hiện trạng sản xuất mía đường các vùng của Việt Nam [18]
Theo số liệu thống kê của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, niên vụ 2016 -
2017 diện tích mía cả nước chỉ đạt 268.300 ha, giảm 16.067 ha so với vụ trước. Trong đó,
diện tích ở vùng nguyên liệu tập trung của 25 tỉnh có nhà máy đường là 257.600 ha, giảm
15.205 ha. Đối với những diện tích có hợp đồng và tiêu thụ sản phẩm chỉ đạt 218.343 ha,
chiếm 80% tổng diện tích cả nước và giảm sâu so với kế hoạch đầu vụ.
Qua khảo sát đánh giá, Tây Nguyên là vùng có diện tích, năng suất ổn định nhất
(diện tích 56.700 ha, tăng 371ha; năng suất bình quân 62,6 tấn/ha). Trong khi đó, vùng
Duyên Hải Nam Trung bộ với điều kiện tự nhiên bất lợi, đất canh tác xấu, thường xuyên
đối mặt với hạn hán nên năng suất, chất lượng cho kết quả thấp nhất.
Theo số liệu tổng hợp của các nhà máy đường trên cả nước, vụ 2017 - 2018 tổng
diện tích đã được ký hợp đồng đầu tư và bao tiêu sản phẩm là 248.930 ha, tăng 30.587
ha. Sản lượng mía ép đạt 15,17 triệu tấn, sản lượng đường đạt 1,42 triệu tấn, trong đó
đường tinh luyện là 600.000 tấn [19].
1.1.2.2. Các vấn đề môi trường từ bã mía
Lượng sinh khối từ phụ phẩm công-nông nghiệp nói chung và bã mía nói riêng
phát sinh sau mỗi vụ thu hoạch là rất lớn, nếu không có biện pháp xử lý và quản lý hiệu
quả thì sẽ gây ô nhiễm môi trường, đồng thời lãng phí nguồn nguyên liệu phục vụ cho
sản xuất cũng như chăn nuôi [20].
Trong những năm gần đây, do không tận dụng hợp lý các nguồn phụ phẩm này
đúng cách, đồng thời áp dụng phương pháp xử lý tiêu cực đang gây vấn nạn to lớn tới

12
môi trường như việc chất đống để đốt hoặc ủ lưu trong thời gian dài. Sau mỗi vụ mùa, bã
mía thường được đốt ở khắp nơi, khói gây ô nhiễm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức
khỏe người dân và góp phần làm biến đổi khí hậu, phế phẩm ủ đống để lưu lâu ngày gây
hôi thối và ô nhiễm môi trường nước, không khí rất nghiêm trọng, đặc biệt là bã mía với
thành phần giàu đường Sucroza và mật rỉ đường. Bên cạnh đó, sự tiêu hủy và xử lý
không phù hợp nguồn sinh khối này gây lãng phí nguồn nguyên liệu tái sinh có thể sử
dụng lại phục vụ chính cho nông nghiệp [21].
Theo ước tính, nếu đốt 1 tấn bã mía khô thì sẽ thải ra 36,32 kg khí CO, 4,54 kg
hydrocarbon, 3,18 kg bụi tro và 56 kg CO2, các thành phần này góp phần gây hiệu ứng
nhà kính, gây ô nhiễm môi trường không khí. Từ những bất cập trên dẫn đến tình trạng ô
nhiễm môi trường do bã mía gây ra ở nước ta ngày càng diễn ra nghiêm trọng hơn [21,
22].
Bã mía là nguồn nguyên liệu phong phú cho việc sản xuất bioethanol nếu chúng ta
biết ứng dụng hợp lý tiến bộ khoa học công nghệ. Hiện nay có nhiều hướng tiếp cận,
trong đó có một giải pháp đầy tiềm năng là ứng dụng xúc tác sinh học sử dụng các
enzyme thủy phân từ vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn) để chuyển hóa chúng thành
những dạng năng lượng có ích với hiệu suất cao.
1.2. Chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose
1.2.1. Quá trình thủy phân vật liệu giàu lignocellulose
Quá trình thủy phân lignocellulose được thực hiện bởi axít, kiềm hoặc hỗn hợp
enzyme thủy phân. Vào cuối thế kỉ 19 và đầu thế kỉ 20, quá trình thủy phân được thực
hiện bởi phản ứng giữa cellulose với axít. Axít loãng được sử dụng dưới điều kiện nhiệt
độ và áp suất cao, còn axit đậm đặc được sử dụng ở nhiệt độ thấp và áp suất khí quyển.
Quá trình thủy phân bằng axít loãng xảy ra ở nhiệt độ và áp suất cao dẫn đến sự tạo thành
các chất độc hại có thể ảnh hưởng không tốt đến quá trình lên men như các axít hữu cơ có
trọng lượng phân tử thấp, dẫn xuất furan và các hợp chất vô cơ. Các mắt xích của
cellulose có thể bị phân cắt thành các phân tử đường glucose riêng lẻ bằng hệ cellulase.
Xét về bản chất quá trình thủy phân được thực hiện theo phương trình phản ứng:
(C6H10O5)n + nH2O nC6H12O6
.

13
Ngày nay, người ta quan tâm nhiều theo hướng nghiên cứu ứng dụng kết hợp xử lý
hóa học và xúc tác sinh học để thủy phân nguồn vật liệu giàu lignocellulose thay cho các
phương pháp hóa lý truyền thống. Sự kết hợp này giúp cho quá trình thủy phân đạt hiệu
quả cao hơn.
Khi có sự tham gia xúc tác sinh học của enzyme thì cơ chất sẽ được hoạt hóa
mạnh. Cơ chất tương tác với enzyme do sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron, sự
biến dạng các liên kết. Từ đó làm thay đổi động năng, thế năng dẫn tới cơ chất trở nên dễ
dàng tham gia vào các phản ứng hơn. Quá trình xúc tác của enzyme xảy ra qua ba giai
đoạn [23].
E +S ES E + P
Trong đó: E - enzyme; S - cơ chất; P - sản phẩm
Giai đoạn thứ nhất: Enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu, nhờ
đó sẽ tạo ra phức hợp ES, phức này không bền. Giai đoạn thường này xảy ra rất nhanh và
đòi hỏi một ít năng lượng.
Giai đoạn thứ hai: Cơ chất bị biến đổi, dẫn tới làm căng, phá vỡ các liên kết đồng
hóa trị.
Giai đoạn thứ ba: Sản phẩm được tạo thành, tách ra khỏi enzyme, enzyme được
giải phóng và trở lại trạng thái tự do.
Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là: tương
tác tĩnh điện, liên kết hydro, tương tác Van der Waals. Mỗi loại liên kết đòi hỏi những
điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước.
Cellulose và hemicellulose khó thủy phân hơn tinh bột do tinh bột chứa
amylopectin có cấu trúc phân nhánh nên dễ dàng tiếp xúc với enzyme. Trong khi
cellulose tinh thể tạo cấu trúc thẳng, khoảng cách giữa các phân tử thấp nên enzyme tiếp
xúc với các phân tử cellulose khó khăn hơn. Bên cạnh đó, việc thủy phân liên kết α - 1,4
– glycosidic trong tinh bột dễ dàng hơn liên kết β- 1,4- glycosidic trong cấu trúc của
cellulose [23].
Quá trình chuyển hóa bao gồm sự thủy phân các thành phần chính của
lignocellulose để tạo ra những loại đường (hexose – C6 và pentose – C5) có thể lên men

14
bioethanol. Giai đoạn tiền xử lý là cần thiết để nâng cao hiệu quả quá trình thủy phân
cellulose thành các đường đơn. Quá trình này thường được thực hiện bởi axít hoặc
enzyme cellulase và quá trình lên men được thực hiện bởi vi khuẩn hoặc nấm men [24].
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân cellulose bao gồm độ xốp của vật liệu,
kích thước vi sợi cellulose và sự có mặt của lignin, hemicellulose trong vật liệu [25]. Sự
hiện diện của lignin và hemicellulose làm cho hoạt động của cellulase trở nên khó khăn
hơn, do đó hiệu suất của quá trình thủy phân sẽ thấp. Quá trình tiền xử lý làm thay đổi
cấu trúc và kích thước của sinh khối, cũng như thành phần hóa học của nó, sao cho quá
trình thủy phân các hydrocarbon thành các loại đường đơn diễn ra nhanh chóng và đạt
hiệu quả cao. Quá trình thủy phân sẽ đạt hiệu quả cao bằng việc loại bỏ lignin, giảm kích
thước vi sợi cellulose, tăng cường độ xốp thông qua quá trình tiền xử lý [26]. Các loại
đường 6 carbon (hexoses) như D-glucose, D-galactose, và D-mannose dễ dàng lên men
thành bioethanol bởi hoạt động tự nhiên của nhiều sinh vật. Để chuyển hóa các
carbohydrate (cellulose và hemicellulose) trong lignocellulose thành bioethanol, các
polymer phải bị bẻ gãy thành những phân tử đường nhỏ hơn trước khi vi sinh vật có thể
hoàn tất quá trình chuyển hóa. Do vậy, bước tiền xử lý là bắt buộc để quá trình đường
hóa glucose có thể diễn ra hiệu quả [27]. Do vậy, mục đích quá trình tiền xử lý là:
- Phá vỡ cấu trúc tinh thể của cellulose vì trong tự nhiên hình thành cấu trúc tinh
thể chiếm khoảng 50-90%.
- Giảm sự bao bọc của lignin quanh cellulose do lignin cùng với hemicellulose tạo
thành cấu trúc mô vững chắc. Những mô được bền hóa với lignin trong đó lignin đóng
vai trò kết dính những sợi cellulose. Tuy nhiên việc loại bỏ lignin luôn kèm theo sự phân
hủy hemicellulose ngay cả trong phương pháp tiền xử lý nguyên liệu bằng kiềm và axít ở
nhiệt độ thấp [28], loại bỏ được 70% lignin thì cũng có 5% hemicellulose bị hòa tan .
- Tăng mức độ acetyl hóa của hemicellulose: Đây là yếu tố ít được quan tâm,
xylan – thành phần hemicellulose chính trong gỗ cứng và cây thân cỏ - bị acetyl hóa với
tỉ lệ rất cao. Tỉ lệ cellulose bị thủy phân tăng lên 2-3 lần [29, 30].

15
Hình 1.6. Vai trò tiền xử lý trong chuyển đổi sinh khối thành nhiên liệu [31]
Có nhiều phương pháp tiền xử lý vật liệu giàu lignocellulose khác nhau như: Vật
lý (xay, nghiền và nhiệt phân), hóa lý (nổ hơi nước, amoniac, CO2), hóa học (kiềm, axit,
ozon, H2O2, dung môi hữu cơ) và xúc tác sinh học. Mỗi phương pháp có ưu và nhược
điểm riêng do vậy, để lựa chọn phương pháp nào phù hợp phụ thuộc vào thành phần cấu
tạo của sinh khối lignocellulose và sản phẩm phụ sinh ra trong quá trình tiền xử lý [32].
Ngoài ra yếu tố chi phí cũng ảnh hưởng rất lớn đến việc lựa chọn phương pháp phù hợp.
Quá trình tiền xử lý giúp tách loại lignin, tăng khả năng xúc tác trên cấu trúc phân
tử cellulose. Bên cạnh đó, quá trình tiền xử lý còn thủy phân hemicellulose có trong
thành phần của sinh khối. Hemicellulose có cấu trúc phân nhánh với những chuỗi mạch
ngắn hơn so với cellulose [33]. Do đó, thủy phân hemicellulose dễ dàng hơn thủy phân
cellulose. Hemicellulose bị thủy phân tạo điều kiện thuận lợi cho các tác nhân tiếp xúc
thủy phân cellulose ở quá trình kế tiếp. Đây là bước vô cùng quan trọng để nâng cao hiệu
quả cho các giai đoạn tiếp theo trong quá trình chuyển hóa sinh khối lignocellulose.
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến xúc tác sinh học
Ảnh hưởng của cấu trúc nguyên liệu: Cấu trúc tự nhiên của lignocellulose tạo ra nhiều
cản trở đến quá trình tấn công của các tác nhân thủy phân. Ngay cả quá trình thủy phân
cellulose tinh khiết, tốc độ thủy phân cũng giảm theo thời gian vì một số lý do sau: sự ức
chế enzyme do sản phẩm, sự giảm của các phần cơ chất dễ thủy phân, enzyme bị bất hoạt
hoặc bị giữ lại trong các lỗ xốp của nguyên liệu.
Hiệu suất quá trình thủy phân bị ảnh hưởng mạnh bởi tính chất của nguồn nguyên

16
liệu. Thông thường, gỗ mềm thường khó thủy phân hơn gỗ cứng [34]. Cấu trúc của
nguyên liệu và cơ chế tác động của enzyme và cơ chất là hai yếu tố chính làm hạn chế
hiệu suất quá trình thủy phân. Khả năng tiếp cận vật liệu lignocellulosic của hệ cellulase
đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân. lignocellulose có bề mặt trong và
ngoài, bề mặt ngoài bao gồm bề mặt bao quanh các xơ sợi, bề mặt trong là bề mặt do các
mao quản bên trong xơ sợi tạo thành. Nếu lignocellulose không được tiền xử lý, hiệu quả
thủy phân thấp. Kích thước của các lỗ xốp lại liên quan đến độ trương nở của vật liệu.
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, khi làm khô vật liệu lignocellulose, các mao quản sẽ bị mất
đi, điều này làm giảm kích thước lỗ xốp vì vậy hiệu suất quá trình thủy phân giảm rõ rệt.
Hàm lượng và sự phân bố của lignin trong cấu trúc vật liệu có ảnh hưởng tới khả năng
thủy phân của vật liệu đó. Hiệu suất thủy phân thu được khá cao đối với các nguyên liệu
đã được loại bỏ gần hết lignin [35].
Ảnh hưởng của nhiệt độ: Giống như nhiều phản ứng enzyme khác, phản ứng thủy phân
lignocellulose bằng hệ cellulase chịu ảnh hưởng lớn của nhiệt độ. Tốc độ phản ứng thủy
phân tăng theo nhiệt độ, tuy nhiên đến một nhiệt độ nhất định, tốc độ phản ứng sẽ giảm
dần và đến mức triệt tiêu. Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được
gọi là nhiệt độ tối ưu. Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40 đến 500
C và
cellulase cũng thế. Những enzyme khác nhau đều có nhiệt độ tối ưu khác nhau. Nếu nhiệt
độ cao hơn nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm do enzyme bị biến tính. Ngược
lại khi ở nhiệt độ 00
C, enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên
từ từ, hoạt tính của enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu. Phản ứng bất hoạt của
enzyme dưới tác dụng của nhiệt thường biểu diễn là phản ứng bậc một [35].
Trong đó: K - hằng số vận tốc phản ứng
E – nồng độ enzyme hoạt động ở thời điểm t
Eo – nồng độ ban đầu của enzyme hoạt động
Ảnh hưởng của pH: pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất,
enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất

17
mạnh đến phản ứng của enzyme. Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính, tuy
nhiên cũng có nhiều enzyme hoạt động ở môi trường axít yếu. Một số enzyme khác lại
hoạt động mạnh ở pH kiềm và cả pH axít. Đối với cellulase, khoảng pH thích hợp là 4-
5.5, trong đó tốt nhất là 4.8 [34].
Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và cơ chất: Khi nồng độ enzyme tăng, tốc độ phản ứng
tăng theo đường thẳng. Tuy nhiên, khi nồng độ enzyme đạt đến một ngưỡng nào đó, nồng
độ cơ chất sẽ trở thành yếu tố hạn chế tốc độ phản ứng. Khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ
phản ứng enzyme tăng, sẽ có nhiều cơ chất va chạm với enzyme trong phản ứng chuyển
hóa. Khi nồng độ cơ chất đủ lớn, các enzyme bị bão hòa cơ chất. Vì vậy, tăng nồng độ cơ
chất thì tốc độ phản ứng sẽ không thay đổi đáng kể [34].
Ảnh hưởng của các chất kìm hãm: Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là
các chất có mặt trong các phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme nhưng lại không
bị enzyme làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng.
Các chất gây kìm hãm hoạt động của enzyme bao gồm các ion, các phần tử vô cơ, các
chất hữu cơ và cả protein. Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá
trình trao đổi ở tế bào sinh vật. Tùy thuộc vào bản chất phức, bản chất chất kìm hãm
người ta chia ra những chất kìm hãm:
• Chất kìm hãm cạnh tranh: là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của
cơ chất. Chúng thường là những chất kìm hãm thuận nghịch. Chúng có khả năng kết hợp
với trung tâm hoạt động của enzyme. Khi đó chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong
trung tâm hoạt động vì vậy cơ chất không còn cơ hội tiếp cận với trung tâm này. Cơ chế
loại trừ lẫn nhau của chất kìm hãm và trung tâm hoạt động làm giảm số lượng các
enzyme kết hợp với cơ chất. Kết quả là hoạt động của enzyme sẽ giảm.
• Chất kìm hãm không cạnh tranh: chất kìm hãm không chiếm trung tâm hoạt
động của enzyme mà là ở một vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzyme. Kết quả sự
kết hợp này, chất kìm hãm làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo
chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc tác. Vì thế các chất kìm hãm làm giảm hoạt động
của enzyme. Đối với cellulase, các sản phẩm của phản ứng thủy phân, gồm cellobiose và
glucose đều có tác động kìm hãm hoạt tính của cellulase, đặc biệt là cellobiose [34].

18
1.2.3. Đa dạng nấm Việt Nam cho chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose
Việt Nam là một trong những quốc gia có đa dạng sinh học cao trên thế giới với
khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao và 3.000 loài động vật có xương sống đã được miêu
tả, trong đó có nhiều loài đặc hữu. Cấu trúc địa độc đáo, khí hậu nhiệt đới và nhiều kiểu
sinh thái khác nhau đã góp phần tạo nên sự đa dạng của khu hệ nấm Việt Nam. Nếu ước
tính số loài nấm có thể có trên lãnh thổ Việt Nam gấp 6 lần số loài thực vật bậc cao thì số
loài nấm có thể lên tới 72.000 loài. Điều đó có nghĩa là hơn 90% số loài nấm có thể có
của Việt Nam còn chưa được định loài và nêu tên trong danh lục [36, 37]. Trong danh lục
thực vật Việt Nam phần nấm (2001), số lượng loài nấm chỉ có khoảng 2.250 loài, trong
đó các loài nấm Túi (Ascomycota) còn rất ít so với các loài nấm Đảm (Basidiomycota).
Trong khi đó, trên thế giới số lượng loài nấm Ascomycota ước tính chiếm 2/3 trong tổng
số các loài nấm đã được mô tả.
Sinh vật phân hủy lignocellulose đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì
vòng tuần hoàn carbon nhờ khả năng chuyển hóa hiệu quả các vật liệu thực vật bởi hệ
enzyme thủy phân. Trong số các sinh vật phân hủy lignocellulose, các loài nấm thuộc
nấm đảm Basidiomycota và nấm túi Ascomycota được biết là có hệ xúc tác sinh học hiệu
quả nhất và được chia thành 3 nhóm: nấm mục trắng, nấm mục nâu và nấm mục mềm.
Trong khi có nhiều nghiên cứu tập trung vào nhóm nấm mục trắng và mục nâu (chủ yếu
thuộc ngành Basidiomycota), có rất ít các nghiên cứu trên hệ enzyme chuyển hóa
lignocellulose bởi nhóm nấm mục mềm (phần lớn thuộc ngành Ascomycota). Các nấm
thuộc ngành nấm túi Ascomycota dường như thiếu các peroxidase chuyển hóa lignin
nhưng thay vào đó, chúng có các enzyme thủy phân và laccase cho phép chuyển hóa hiệu
quả lignocellulose [38].
Ngoài ra, sự quan trọng của enzyme này còn liên quan đến xúc tác giải phóng các
axít phenolic (axít ferulic, axít p-coumaric, axít cinnamic…) và các dimer của chúng từ
vật liệu lignocellulose [39]. Các axít phenolic từ phụ phẩm nông nghiệp được biết là các
chất chống oxi hóa mạnh, chống ung thư da, kháng virus [40]. Hiện nay, Việt Nam có rất
ít các công bố liên quan đến việc sử dụng carbohydrate esterase (feruloyl esterase, acetyl
esterase) từ nấm để thủy phân lignocellulose từ phụ phẩm công-nông nghiệp. Trên thế

19
giới, một số công bố về feruloyl esterase liên quan đến sự thủy phân lignocellulose đã
được tinh sạch và nghiên cứu đặc tính, chủ yếu là từ nguồn nấm và vi khuẩn (Clostridium
spp., Pseudomonas spp., Aspergillus spp, Paenibacillus terrae ME27-1 và Penicillium
spp) [41].
Gần đây, khi nghiên cứu chi Xylaria ở Vườn Quốc gia Cúc Phương của Việt Nam,
nhóm nghiên cứu thuộc trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã chỉ ra số loài mới ghi nhận
cho lãnh thổ Việt Nam là khá lớn (20 loài) và 17 loài có thể là mới cho khoa học [42].
Nhìn chung, nguồn tài nguyên nấm ứng dụng trong ngành hóa sinh và công nghệ sinh
học còn ít được khai thác sử dụng, do vậy, nước ta vẫn có tiềm năng lớn về các loài và
các chất xúc tác sinh học có hoạt tính hữu ích.
Hình 1.7. Cấu trúc các enzyme tham gia vào quá trình chuyển hóa lignocellulose [43]
Nghiên cứu ứng dụng enzyme như một nguồn xúc tác sinh học để thủy phân các
phụ phẩm công-nông nghiệp thành các đường đơn ngày càng được quan tâm. Giải pháp
này vừa không tiêu hao nguồn lương thực của con người vừa loại bỏ các phế phụ phẩm

20
nông nghiệp một cách thân thiện với môi trường mà có thể hy vọng sẽ sản xuất được
nhiên liệu sinh học với quy mô lớn, nhờ ưu điểm hiệu suất cao và giá thành giảm.
1.2.4. Ứng dụng của enzyme trong quá trình thủy phân lignocellulose
Các vi sinh vật có khả năng phân hủy lignocellulose là do chúng có thể tiết ra các
enzyme tạo thành một hệ enzyme gọi là hệ cellulase. Sự phân giải tiến hành trong điều
kiện môi trường kiềm, axít hoặc ở các nhiệt độ, pH khác nhau. Các cellulase xúc tác việc
phân giải cellulose thành cellobiose và glucose. Vi sinh vật dùng các sản phẩm thủy phân
này làm nguồn cacbon và nguồn năng lượng [44].
Các loài nấm sợi được biết là có hệ enzyme xúc tác hiệu quả đồng thời chúng tiết
vào môi trường lượng enzyme ngoại bào nhiều hơn vi khuẩn giúp chúng phân hủy tốt
lignocellulose [36]. Nấm bao gồm hai hệ enzyme ngoại bào, hệ enzyme thủy phân có vai
trò trong phân hủy polysaccharide và hệ enzyme oxy hóa phân giải lignin ngoại bào để
phân hủy lignin và xúc tác phản ứng mở vòng phenyl [45]. Các enzyme phân giải thành
tế bào nhận được nhiều sự quan tâm bởi chúng có thể giải phóng các đơn vị đường cần
thiết cho các quá trình lên men và sản xuất bioethanol từ các vật liệu thô giàu
lignocellulose. Đặc biệt, enzyme từ nấm lớn có khả năng thủy phân hiệu quả vật liệu
cellulose. Tuy nhiên, cấu trúc phức tạp của lignocellulose trong thành tế bào của chúng
làm hạn chế hoạt động của nhiều loại enzyme cần thiết cho sự tấn công mạch chính và
các mạch nhánh của polymer. Ngoài hệ enzme ngoại bào cellulase, quá trình thủy phân
lignocellulose còn cần các enzyme thủy phân khác bao gồm esterase (feruloyl esterase,
acetyl esterase hay acetyl xylan esterase), chúng hoạt động phối hợp với các enzyme tấn
công mạch chính (cellulase/xylanase) và mạch nhánh của cấu trúc polymer này [46,47].
Sự phân giải cellulose tự nhiên là một quá trình phức tạp đòi hỏi sự tham gia phối
hợp của nhiều enzyme khác nhau. Các enzyme này xúc tác quá trình thủy phân cắt ngắn
mạch cellulose. Nhiều tác giả cho rằng hệ cellulase gồm các enzyme chính sau đây [23,
48]:
Endo-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4), còn gọi là cellulase này tác động thuỷ phân lên
các liên kết phía trong mạch cellulose một cách tuỳ tiện làm trương phồng cellulose, dẫn
đến làm giảm nhanh chiều dài mạch và tăng chậm các nhóm khử. Enzyme này hoạt động

21
mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose, enzyme
này sẽ tấn công ngẫu nhiên vào các cơ chất 1,4-β-glucan cả tan và không tan.
Exo-1,4 - glucanase (EC 3.2.1.91), còn gọi là cellobiohydrolase. Enzyme này giải
phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose. Enzyme này tác động yếu
lên vùng vô định hình ở phía bên trong của mạch, nhưng tác động mạnh lên mạch bên
ngoài của cellulose kết tinh hoặc cellulose đã bị phân giải một phần. Hai enzyme exo và
endo - glucanase có tác dụng hiệp đồng cho hiệu quả rõ rệt.
β - 1,6 - glucosidase (EC 3.2.1.21), còn gọi là cellobiase. Enzyme này thuỷ phân
cellobiose và các cellodextrin hoà tan, chúng có hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của
mạch cellulose tăng lên. Tùy theo vị trí mà β - glucosidase được coi là nội bào, ngoại
bào hoặc liên kết với thành tế bào. Chức năng của β - glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự
tích luỹ các chất cảm ứng của cellulase. Người ta cho rằng tính đa hình của cellulase là
nhằm phù hợp với cấu trúc phức tạp của mạch phân tử cellulose, gồm nhiều vùng có hoạt
tính thủy phân khác nhau. Tuỳ thuộc vào các chủng vi sinh vật cũng như các điều kiện
môi trường nuôi cấy, tỷ lệ các thành phần trong hệ enzyme, hoạt lực phân giải cellulose
của các hệ cellulase là khác nhau, nhưng để phân giải hoàn toàn cellulose, cần có sự tác
dụng hiệp đồng của cả ba enzyme trong hệ cellulose [49].
Từ các nghiên cứu về ba enzyme trong hệ cellulase nhiều tác giả đều đưa ra kết
luận chung là các loại cellulase có tác dụng hiệp đồng sẽ thay phiên nhau thủy phân
cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là đường glucose [35].
Hình 1.8. Hệ cellulase tham gia thủy phân mạch cellulose [35]

22
Hemicellulose với thành phần chính là xylan chiếm khoảng 30% thành tế bào thực
vật sống lâu năm. Tùy theo loại gỗ mà thành phần xylan thay đổi từ 15-30% đối với gỗ
cứng và 7-10% đối với gỗ mềm. Để chuyển hóa chúng thì sự có mặt của hệ xylanase là rất
cần thiết. Xylanase thủy phân liên kết β-1,4 giữa các phân tử xylan với nhau, giải phóng
các phân tử ngắn xylooligomer gồm có endo-xylanase và exo-xylanase. Trong khi
endoxylanase phân cắt liên kết β-1,4-xyloside trong mạch xylan thì exo-xylanase thủy
phân liên kết β-1,4-xyloside ở các đầu tự do. Sản phẩm của các enzyme này là xylobiose
sẽ được tiếp tục thủy phân thành đường đơn xylose bằng enzyme β-xylosidase.
Các nhóm bên có mặt trong xylan được giải phóng bởi exo--mannosidase (EC
3.2.1.25), α-L arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55), α-D-glucuronidase (EC 3.2.1.1),
galactosidase (EC 3.2.1.139) và acetyl (xylan) esterase [50,51]. Enzyme α-
arabinofuranosidase thủy phân nhóm cuối cùng không khử α-L-arabinofuranosyl của
arabinan, arabinoxylan và arabinogalactan. Enzyme α-D-glucuronidase thủy phân liên kết
α-1,2-glycosidic giữa xylose và D-glucuronic axit hoặc liên kết ete với 4-O-methyl. Sự
thủy phân liên kết α-1,2 bền vững đóng vai trò quan trọng trong thủy phân xylan (Hình
1.9).
Ngoài ra, để thủy phân hiệu quả hemicellulose cần sự có mặt của endo-β-1,4-
mannanase (EC 3.2.1.78 ) và hệ enzyme thủy phân carbohydrate esterase (CE) với chức
năng khác nhau. Trong đó, endo-β-1,4-mannanase thủy phân liên kết 1,4-β-
manopyranozit trong mạch chính của mannan và heteropolysaccharide có chứa đường
mannanose. Sự thủy phân mannan từ polysaccharide bằng β-mannanase tạo ra các mano-
oligosaccharide và một chuỗi các oligosaccharide chứa D-manose, D-glucose và D-
galactose. β- mannanase phân cắt liên kết β-1,4-mannosit trong mạch mannan. Do vậy,
nó xúc tác thủy phân mannan, glucomannan, galactomannan và galatoglucomannan tạo
thành mannobiose, mannotriose và hỗn hợp các oligosaccarit khác. Cùng với đó, các
nhóm bên cũng sẽ bị phân cắt bởi một số hemicellulase khác như: α-L-
arabinofuranosidase, α-L-arabinanase, α-Dglucuronidase, xyloglucan hydrolase và
pectinase [52].

23
Hình 1.9. Cấu trúc xylan được tấn công bởi những enzyme thủy phân khác nhau [53]
Tới nay, nhiều nghiên cứu đã được công bố về một số chủng vi sinh vật như nấm
sợi, nấm mục và một số loại vi khuẩn có khả năng sản xuất các enzyme phân giải lignin.
Trong đó, để phân giải lignin hiệu quả nhất đến nay được xác định thuộc họ nấm mục
trắng [52]. Taniguchi và cộng sự đã đánh giá hiệu quả tiền xử lý của rơm lúa bằng bốn
loại nấm mục trắng [54] (Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor,
Ceriporiopsis subvermispora và Pleurotus ostreatus) dựa trên những thay đổi về số
lượng và thành phần cấu trúc rơm rạ sau xử lý cũng như tính nhạy cảm với enzyme thủy
phân. Kết quả là P. ostreatus có khả năng thủy phân chọn lọc lignin và làm tăng hiệu quả
của cellulase và hemicellulase. Một số vi khuẩn cũng có thể được sử dụng cho tiền xử lý
nguyên liệu lignocellulose. Nhóm nghiên cứu của Kurakake đã cho thấy khả năng thu hồi
đường từ giấy văn phòng lên tới 94% khi tiền xử lý sinh học giấy văn phòng với hai
chủng vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis và Bacillus circulans ở điều kiện tối ưu [55].
1.2.5. Vai trò carbohydrat esterase trong thủy phân lignocellulose
Một mắt xích quan trọng thủy phân cấu trúc lignocelluloses là hệ carbohydrate
esterase (CE), đại diện cho một nhóm lớn các hydrolase xúc tác đặc biệt cho sự phân tách
hoặc hình thành các ester no và ester thơm. Trong đó, hai enzyme acetyl esterase (EC
3.1.1.6) và feruloyl esterase (EC 3.1.1.73) hoạt động trên các chuỗi nhánh của cấu trúc
polysaccharide thành tế bào để phân cắt liên kết cầu nối giữa các chuỗi xylan và giữa

24
xylan với lignin để tách riêng phần lignin ra khỏi cấu trúc lignocelluloses. Chúng đóng
một vai trò quan trọng ở giai đoạn đầu quá trình thủy phân lignocelluloses [39].
1.2.5.1. Acetyl esterase từ nấm
Quá trình chuyển hóa lignocellulose cần hỗn hợp các enzyme thủy phân bao gồm
các cellulase, xylanase, carbohydrate esterase… có thể hoạt động phối hợp với nhau để
tấn công cấu trúc polymer [22]. Một trong số các carbohydrate esterase tham gia vào
chuyển hóa lignocellulose là acetyl esterase.
Acetyl esterase là enzyme thủy phân xúc tác cho phản ứng giải phóng nhóm acetyl
từ các Polysaccharide acetyl hóa như pectin hay xylan của lignocellulose [56]. Acetyl
esterase cùng với hệ enzyme thủy phân cellulose và xylan đóng vai trò quan trọng trong
khả năng chuyển hóa các vật liệu thành tế bào thực vật, có thể loại bỏ các nhóm acetyl
ester từ vị trí C-2, C-3 của d-xylopyranosyl trong chuỗi xylan. Cùng với enzyme
cellulase, acetyl esterase là enzyme quan trọng tác động đến khả năng chuyển hóa các
dưỡng chất cần thiết của thành tế bào thực vật bằng cách thủy phân liên kết ester giữa
acetyl và xylose trong xylan. Quá trình deacetyl này làm các đơn vị xylopyranosyl của
mạch chính xylan dễ bị phân hủy hơn bởi endo-β-1,4-xylanases (EC 3.2.1.8). Các nhóm
acetyl nhánh có thể làm ảnh hưởng cách tiếp cận của các enzym phân cắt mạch chính bởi
trở ngại về không gian và sự bài tiết của enzyme, vì vậy hoạt động của endoxylanase sẽ
phân cắt các nhóm acetyl nhánh này, giúp enzyme phân cắt mạch chính được dễ dàng
hơn. Enzym này sẽ loại bỏ các nhóm O-acetyl ở các vị trí 2/3 trên β-D xylopyranosyl của
acetyl xylan.
Acetyl esterase có thể được tách chiết từ vi sinh vật như Bacillus subtilis, chủng vi
khuẩn ưa nhiệt Strain JW/SL-YS485. Acetyl esterase từ các vi khuẩn hoạt động ở các
điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau. Với chủng Bacillus pumilis, enzyme có trọng lượng
phân tử là 40 kDa, nhiệt độ tối ưu để enzyme hoạt động là 45ºC cùng với pH tối ưu là
6,0; còn với chủng B. subtilis enzyme trọng lượng phân tử là 31 kDa và hoạt động tối ưu
ở 500
C với pH 6,5. Hoạt động của enzyme có thể được thúc đẩy bởi các ion Zn2+
, Ni2+
,
Fe2+
và bị ức chế bởi các ion Cu2+
, Fe3+
, Mn2+
, Mg2+
, Ca2+
và Co2+
. Bên cạnh nguồn
enzyme từ vi sinh vật thì acetyl esterase cũng được tìm thấy từ một số nấm Ascomycota

25
đã được miêu tả, bao gồm Aspergillus awamori [57], Aspergillus niger [58], Fusarium
oxysporum [59]. Enzyme từ nấm Aspergillus awamori có trọng lượng phân tử là 31 kDa
và nhiệt độ tối ưu để enzyme hoạt động ở nhiệt độ 400
C với pH 7,0.
1.2.5.2. Feruloyl esterase từ nấm
Feruloyl esteraza (EC 3.1.1.73) xúc tác thủy phân liên kết ester giữa xylan và
lignin qua phân tử đường arabinose và axit ferulic. Chúng là một loại enzyme từ vi sinh
vật có khả năng tác dụng lên thành tế bào thực vật, phá vỡ cấu trúc thành tế bào, tạo điều
kiện cho các enzyme khác tấn công, chuyển hóa các thành phần khác có trong tế bào thực
vật. Enzyme này thủy phân chủ yếu các liên kết este giữa polysaccarid thành tế bào và
axit hydroxycinnamic của lignin và giải phóng các axit ferulic và các dime của chúng từ
vật liệu lignocellulose [60].
Hình 1.10. Liên kết dạng cầu nối của axit ferulic và dimer với arabinoxylan và lignin
(A): O-5-feruloyl lignin, (B) & (C): nhóm dimer O-5-diferuloyl dimer,
(D): nhóm O-3-acetyl [61]
Hầu hết các feruloyl esterase là enzyme ngoại bào phân cắt liên kết ester trong
xylan và các oligosaccarid dẫn xuất từ xylan tạo thành các axit ferulic.
Các feruloyl esterase được phân loại thành bốn nhóm (A-D) dựa trên xác định trình
tự chuỗi protein và sự tương đồng về hoạt tính xúc tác thủy phân các methyl ester của các
axit hydroxycinnamic và dimer của chúng (methyl ferulate, methyl sinapate và methyl
caffeate) [62].

26
Loại B: Bao gồm MpCA, methyl caffeate (MCA), nhưng không bao gồm methyl
sinapate (MSA). Các enzyme này không giải phóng axit và cho thấy trình tự diferulic
tương đồng với nhóm cacboxylic esterase 1 - acetyl esterase xylan. Penicillium
funiculosum FAE-B và Neurospora crassa FAE-I cũng thuộc nhóm này.
Loại C và D: FAE hoạt động xúc tác cả bốn axit hydroxycinnamic metyl este.
Enzyme loại C không giải phóng axit diferulic, trong khi đó các enzyme loại D có khả
năng thủy phân các dimers. Loại D bao gồm Esta Piromyces và esterase D Celluvibrio
japonicus. Loại C gồm A. niger FAE-B và T. stipitatus FAE-C.
Trình tự chuỗi của feruloyl esterase loại A từ A. niger, A. tubingensis, và A.
awamori đã được công bố (theo dữ liệu Swiss-Prot lần lượt là O42807, O42815, và
Q9P979). Các enzyme feruloyl esterase từ A. niger là protein có tính axit, với pI = 3.3,
khối lượng phân tử tính toán là 28 kDa tính theo thành phần chuỗi axit amin) hoặc 36
kDa khi điện di SDS-PAGE, điều này cho thấy enzyme được glycosyl hóa. Enzyme từ A.
awamori gồm 281 amino acid, tương tự trình tự 96% với A. niger [63]. Enzyme này là
một glycoprotein có khối lượng phân tử 35 kDa và pI = 3.8. Các trình tự amino acid của
các enzyme FAE loại B có thể được tìm thấy ở N. crassa (Q9HGR3) và P. funiculosum
(Q9HE18). Các protein FAE-B từ N. crassa gồm 292 amino acid, trong đó có một trình
tự signal peptide gồm 18 amino acid. Trên gel SDS-PAGE cho kết quả khối lượng phân
tử ước tính cao hơn 6 kDa so với con số đã được tính toán là 29.29 kDa cho các protein
deglycosit. N-glycosyl hóa đã được xác định có khối chính là 3504 kDa. Các FAE-B từ
P.funiculosum gồm 353 axit amin, trong đó có một trình tự signal peptide có 18 gốc axit
amin. Các enzyme có cấu trúc mô-đun, bao gồm một miền N-terminal xúc tác và một
miền C-terminal liên kết carbohydrate [64]. Những enzyme loại B này có khoảng 60%
tương tự với các enzyme acetyl xylan esteraza từ A. ficuum, A. awamori, A. oryzae, và P.
purpurogenum.
Enzyme có hoạt tính feruloyl esterase gần đây nhận được nhiều sự quan tâm bởi
vai trò của chúng trong nhiều ngành công nghiệp như hóa chất, giấy và bột giấy, dệt và
nguyên liệu sinh học. Ngoài ra, enzyme này cũng có vai trò trong việc thu nhận các hợp
chất thơm hydroxycinnamic từ phụ phẩm nông nghiệp [65].

27
Hình 1.11. Nếp gấp đặc trưng α/β-hydrolase [65]
Cơ chế xúc tác thủy phân ester bởi esterases được biết đến gồm hai bước chính:
Bước đầu tiên là acetyl hóa - nguyên tử oxy của nhóm hydroxyl ở vùng hoạt động của
serine gắn vào nhóm carbon của liên kết ester, hiệu suất tứ diện trung gian ổn định bởi
xúc tác của His và Asp. Vòng His-imidazol trở thành proton và mang điện tích dương và
các điện tích dương này được ổn định bằng dư lượng axit amin mang điện tích âm. Các
trung gian tứ diện được ổn định bởi hai liên kết hydro được hình thành với các liên kết
amide của phần còn lại thuộc các lỗ oxyanion. Sau đó, các một nửa gốc alcol được giải
phóng và phức hệ acetyl-enzyme được hình thành. Tại bước deacyl hóa, nhóm hydroxyl
của một phân tử nước tấn công carbon của phức hệ acetyl-enzyme và tứ diện trung gian
thứ hai được hình thành. Cuối cùng, các thành phần acetyl được giải phóng và các
enzyme hoạt động được tái sinh. Các vi sinh vật được biết đến với khả năng sinh ra
feruloyl esterase đã được đề cập bao gồm: Clostridium sp., Pseudomonas sp., Aspergiluss
sp., Fusarium sp...[39].
Esterase phân bố rộng rãi ở động vật, thực vật và vi sinh vật. Nhờ đặc tính hữu ích
như tương đối ổn định trong dung môi hữu cơ, cơ chất đặc rộng, không có yêu cầu nhiều
đối với cofactors và các vùng phân cắt, esterase có vai trò quan trọng và ứng dụng rộng
rãi trong công nghệ sinh học và cả trong công nghiệp. Các enzyme CE liên quan đến
chuyển hóa xylan là công cụ quan trọng trong nghiên cứu cơ chế và cấu trúc thành tế bào
thực vật [65]. Các liên kết giữa lignin và polymer cacbohydrate tự nhiên trong cấu trúc
phức hợp thành tế bào vẫn đang được xác định và cần những nghiên cứu sâu hơn. Các

28
xylan acetyl-hóa là những dạng polymer khó chuyển hóa trong dạ dày và kìm hãm hoạt
động của các cellulose và hemicellulose tùy thuộc vào mức độ acetyl hóa. Khi sử dụng
phối hợp xúc tác của xylan và các enzyme thủy phân xylan khác trong sản xuất bột giấy
và tẩy trắng giấy, các esterase (feruloyl esterase, acetyl esterase) phá vỡ 1 phần cấu trúc
và loại bỏ một phần thành tế bào thực vật [66]. Do đó, phức hợp lignin - cacbohydrate có
thể trở nên dễ dàng bị tấn công bởi hoạt độ xúc tác của enzyme và sự hòa tan sản phẩm
chuyển hóa tốt hơn. Việc tăng hiệu quả chiết xuất lignin dẫn đến giảm được sử dụng
chlorin ở các bước tẩy trắng tiếp theo và tăng độ trắng sáng của bột giấy và giấy [67].
Chính vì vậy, nó là mắt xích quan trọng trong việc phân tách lignin ra khỏi
lignocelluloses.
1.3. Tình hình sản xuất bioethanol
1.3.1. Hiện trạng sản xuất và sử dụng bioethanol
Nhu cầu năng lượng luôn là vấn đề nan giải của bất kì quốc gia nào trên thế giới.
Trong số các nguồn năng lượng thay thế dầu mỏ đang sử dụng hiện nay (năng lượng gió,
mặt trời, hạt nhân,…), năng lượng sinh học đang là xu thế phát triển tất yếu, nhất là ở các
nước nông nghiệp và nhập khẩu nhiên liệu. Hiện nay, các dạng năng lượng sinh học đang
được quan tâm gồm ba nhóm là dầu sinh học (biodiesel), khí sinh học (biogas) và
bioethanol (ethanol sinh học) [68].
Bioethanol được sản xuất bằng quá trình thủy phân và lên men các phế thải nông
nghiệp chứa lignocellulose như rơm rạ, thân ngô, bã mía hoặc các cây năng lượng khác.
Sản phẩm cuối cùng cũng giống như bioethanol thông thường, dùng để pha trộn với
xăng. Năm 2014, Nhà máy sản xuất bioethanol từ sinh khối chứa cellulose lớn nhất mang
tên Liberty được đưa vào hoạt động tại Emmetsburg, bang Iowa do Liên doanh Poet-
DSM (giữa Poet LLC là doanh nghiệp sản xuất bioethanol lớn nhất Mỹ với một doanh
nghiệp sản xuất enzyme của Hà Lan) đầu tư [69]. Mỗi năm nhà máy này chế biến 285
nghìn tấn phế thải cây ngô (thân, lá, vỏ) để sản xuất ra khoảng 25 triệu gallons bioethanol
(tương đương gần 95 triệu lít). Bioethanol từ cellulose của Poet-DSM có các tính chất
giống bioethanol từ ngô, nhưng vì được tạo ra từ phế thải còn trên mặt đất sau khi thu

29
hoạch ngô nên hàng năm chu trình sản xuất này làm giảm được khoảng 210.000 tấn
carbon dioxide phát thải [70].
Hình 1.12. Sản lượng nhiên liệu sinh học giai đoạn 2008 – 2022 [71]
Theo Bộ Năng lượng Mỹ [72], trước năm 2009 nhiên liệu sinh học chỉ có “dạng
truyền thống” (được hiểu là bioethanol và biodiesel chủ yếu được sản xuất từ các nguồn
lương thực - thực phẩm), sau đó, các dạng nhiên liệu sinh học tiên tiến bắt đầu xuất hiện,
từ năm 2015 sản lượng nhiên liệu sinh học truyền thống hàng năm gần như không tăng.
Hình 1.13 cho thấy từ năm 2015 trở đi, quy mô sản xuất nhiên liệu sinh học truyền thống
(bioethanol và biodiesel được sản xuất từ dầu thực vật và mỡ động vật) gần như không
tăng và sản lượng hàng năm chỉ duy trì ở mức khoảng 60 triệu tấn.
Ngành công nghiệp ethanol Hoa Kỳ là một cường quốc toàn cầu, dẫn đầu thế giới
về cung và cầu. Với sản lượng 16,1 tỷ gallon trong năm 2018, Hoa Kỳ đã sản xuất gấp
đôi sản lượng được tạo ra bởi Brazil. Trong khi đó xuất khẩu tăng 20% cao kỷ lục với
hơn 1,6 tỷ gallon. Brazil và Canada vẫn là khách hàng nhập khẩu hàng của Hoa Kỳ trong
nhiều năm liền, chiếm một nửa tổng xuất khẩu ethanol của Quốc gia này.
Tại Brazil, nước sản xuất bioethanol hàng đầu thế giới đã thành công trong việc
sản xuất bioethanol theo quy mô công nghiệp từ những năm 1970 khi nước này phụ
thuộc nặng nề vào dầu nhập khẩu. Lệnh cấm vận dầu mỏ của Trung Đông đã bắt buộc
Brazil phải tìm kiếm những những nguồn nhiên liệu vững bền hơn cho nhu cầu năng

30
lượng của đất nước [71]. Tuy rằng, có những vấn đề nảy sinh nhưng chương trình này
của Brazil được xem như một mô hình thành công trong việc phát triển bền vững [73].
Ngày nay, toàn bộ xe hơi ở Brazil sử dụng xăng có pha ít nhất 25% bioethanol và 60% số
xe có khả năng “linh động về nhiên liệu” (có thể sử dụng 100% bioethanol làm nhiên
liệu), mỗi năm tiết kiệm được trên 2 tỷ USD do không phải nhập dầu mỏ. Hiện tại, ở
nước này có 3 triệu ôtô sử dụng hoàn toàn bioethanol và trên 17 triệu ôtô sử dụng E25.
Brazil sản xuất bioethanol hầu như chỉ từ cây mía, loại nhiên liệu này có thể được tinh
lọc thêm để pha vào xăng, hoặc dùng làm nhiên liệu tinh [74].
(Đơn vị: tỷ gallons)
Hình 1.13. Sản lượng bioethanol tại một số quốc gia và khu vực trên thế giới [75]
Liên minh Châu Âu (EU) cũng đã tiến đến việc khuyến khích năng lượng tái sinh
cho tương lai với những đạo luật về điều khoản sử dụng phương tiện giao thông tối thiểu
cho các nước thành viên. Năm 2005, 721 nghìn tấn bioethanol được sản xuất nhằm phục
vụ nhu cầu nhiên liệu vận chuyển ở Châu Âu, tăng khoảng 50% so với năm 2004. EU
đang khuyến khích việc sử dụng bioethanol và hướng tới mục tiêu nhiên liệu này chiếm
5.75% trong tổng lượng xăng dầu bán ra vào năm 2010 [76].
Tại Brazin năm 2017, Theo Tập đoàn Unica, các cơ sở sản xuất mía đường tại
vùng trung phía nam, đây là khu vực sản xuất mía đường lớn nhất thế giới, đã tăng 56%
sản lượng mía dùng cho sản xuất ethanol từ đầu tháng mười, so với con số 53% kể từ
cuối tháng chín và 50% của cùng kỳ năm trước. Brazil là nước đứng đầu thế giới về xuất
khẩu ethanol từ mía.Trong nửa đầu tháng mười, sản lượng đường của Brazil đạt 1,97

31
triệu tấn, thấp hơn 12,2% so với cùng kỳ năm trước, trong khi đó, sản lượng ethanol tăng
11,6%, đạt 1,570 tỷ lít.
Ở Ấn Độ, một chương trình bioethanol đã kêu gọi người dân sử dụng xăng E5 trên
cả nước, tiến tới việc sử dụng xăng E10 và E20.
Mỹ cũng đang đầu tư nhiều cho việc tăng sản lượng bioethanol, hiện chiếm 5%
khối lượng nhiên liệu bán ra ở Mỹ. Đồng thời, Mỹ hiện là quốc gia sản xuất bioethanol
lớn nhất thế giới (năm 2006 đạt gần 19 tỷ lít, trong đó 15 tỷ lít dùng làm nhiên liệu -
chiếm khoảng 3% thị trường xăng). Năm 2012 cung cấp trên 28 tỷ lít bioethanol và
biodiesel, chiếm 3.5% lượng xăng dầu sử dụng. Năm 2016 Mỹ đã sản xuất trên 15 tỷ
gallon và đến năm 2018 xuất khẩu trên 1,6 tỷ gallon [74].
Theo giáo sư trường đại học Georgia, Joy Peterson, đồng thời là Trưởng khoa
Năng lượng sinh học cho biết: “Sản xuất bioethanol từ nguồn năng lượng sinh học tái
sinh từ sinh khối thực vật là vô cùng cần thiết và hữu ích vì chúng rất dồi dào và sẵn có”.
Công trình nghiên cứu trên đã được Quỹ Nghiên cứu khoa học của Trường Đại học
Georgia cấp bằng sáng chế [77].
Tại Trung Quốc, đầu năm 2003, xăng E10 đã chính thức được sử dụng ở 5 thành
phố lớn và đã được mở rộng thêm tại 9 tỉnh đông dân cư khác. Bioethanol nhiêu liệu sẽ
tăng trên 2 tỷ lít năm 2010, khoảng 10 tỷ lít vào năm 2020 (năm 2005 là 1.2 tỷ lít) [74].
Ở Đông Nam Á, Thái Lan đã ban hành luật cho việc sử dụng xăng pha 10%
bioethanol bắt đầu từ 2007.
Tại Việt Nam, ngày 20/11/2007 Thủ tướng Chính phủ đã ban hành Quyết định số
177/2007/QĐ-TT về việc phê duyệt đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015,
tầm nhìn đến năm 2025 nhằm mục tiêu: “Phát triển nhiên liệu sinh học, một dạng năng
lượng mới tái tạo được để thay thế một phần nhiên liệu hóa thạch truyền thống, góp phần
đảm bảo an ninh lương thực và bảo vệ môi trường”. Trong 2-3 năm gần đây, việc sản
xuất bioethanol làm nhiên liệu đã được quan tâm với nhiều góc độ khác nhau về nghiên
cứu cũng như sản xuất [78,79].

Chuyển hóa phụ phẩm công-nông nghiệp để thu nhận bioethanol

Chuyển hóa phụ phẩm công-nông nghiệp để thu nhận bioethanol

Recomendados

Recomendados

Más contenido relacionado

La actualidad más candente

La actualidad más candente (20)

Similar a Chuyển hóa phụ phẩm công-nông nghiệp để thu nhận bioethanol

Similar a Chuyển hóa phụ phẩm công-nông nghiệp để thu nhận bioethanol (20)

Más de Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620

Más de Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620 (20)

Último

Último (17)

Chuyển hóa phụ phẩm công-nông nghiệp để thu nhận bioethanol