Determinación de la curva de crecimiento de levadura

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE LEVADURA
Sacharomyces cerevisae, APLICANDO EL MODELO DE GOMPERTZ

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA DE LOS PRODUCTOS
AGROINDUSTRIALES

 PROFESOR: ING. SÁNCHEZ GONZALES, JESÚS ALEXANDER
 CICLO: IX
 HORARIO: JUEVES 11-1PM

TRUJILLO-2012

Determinación de la curva de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae, aplicando el
modelo de Gompertz UNT

INTEGRANTES

ALFARO LAYZA MASSIEL
AROCA CASTILLO RONALD
BANCES NÚÑEZ PEDRO
CALDAS REYES PATRICIA
CERQUÍN RODRÍGUEZ DIEGO
COLLANTES ARANA LUIS
ESQUIVEL PEREA VIRGINIA
ESPINOZA ROMERO DIEGO
GORDILLO SILVA CARLOS
GUERRERO MEDINA NEIVER
GUTIERREZ MARIN VIVIANA
IZÁZIGA LUNA NARDY
JARA PONTE ANÍVAL
LEÓN PICÓN BRUCE
LÁZARO HARO DANNY
LUCAS FLORES YOVEN
MARTÍNEZ SALDAÑA YURICO
MÉNDEZ SOSA JIMMY
MORALES NARVÁEZ CARLOS
RODRÍGUEZ ANTICONA ROBERTO
RODRÍGUEZ LEÓN ANDRÉ
SANTILLÁN HONORIO HILBAR
VARGAS RAFAEL ANGIE


DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE LEVADURA
Sacharomyces cerevisae, APLICANDO EL MODELO DE GOMPERTZ

I. INTRODUCCIÓN:

La microbiología predictiva de alimentos (MPA) es un área multidisciplinaria
emergente de la microbiología de alimentos, que surge como alternativa a la
necesidad de acortar tiempos de respuestas, reducir costos económicos,
reemplazar metodologías dispendiosas y disminuir la laboriosidad en los análisis de
la microbiología clásica de alimentos. Es un área multidisciplinaria ya que abarca
distintas disciplinas como la microbiología, matemática, estadística, informática,
bioquímica, etc., con el fin de desarrollar y aplicar modelos de simulación que
permitan predecir las respuestas de los microorganismos ante diversos factores
medioambientales.

La microbiología predictiva se basa en la siguiente premisa: “las respuestas de los
microorganismos ante los cambios en los factores ambientales pueden ser
reproducidas de forma controlada en el laboratorio”, de esta forma, a través de
diversos modelos es posibles posible predecir cuál será el comportamiento de estos
microorganismos cuando cambian las condiciones ambientales que les rodea.

Los modelos matemáticos considerados en el ámbito de la microbiología predictiva
se pueden clasificar según distintos criterios, usos y finalidades. Existen modelos
probabilísticos (que permiten estimar los límites de crecimiento/no crecimiento o
producción/no producción de toxina), modelos cinéticos de crecimiento, de
supervivencia o de inactivación (para determinar el número de microorganismos en
función del tiempo). Tras ajustar la curva de crecimiento microbiana mediante
funciones matemáticas (modelos primarios) y estudiar sus parámetros según
cambios en las condiciones ambientales (modelos secundarios), es posible
modelizar el comportamiento microbiano en función de la temperatura, el pH, la
actividad del agua y otros factores, independientemente del alimento y a partir de
estos datos predecir lo que sucederá durante el almacenamiento, procesado, etc.


II. OBJETIVOS

 Preparar medios de cultivo y manejar adecuadamente la autoclave.
 Confeccionar la gráfica de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae
mediante el modelo de “GOMPERTZ.”
 Se conoció el modelo de Gompertz para el cálculo de la curva de crecimiento
de las levaduras.
 Identificar cada una de sus fases.
 Calcular el Tiempo de Generación por el método gráfico.

III. MARCO TEÓRICO

A) FORMULACIÓN DE MEDIOS DE FERMENTACIÓN

La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una
etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Donde los
componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza
química que desempeñan un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con
los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y además
suministrar energía para la síntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular.

No obstante que los microorganismos varían considerablemente respecto de los
nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distinción de las siguientes
categorías de componentes:

a) Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que están
representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg.

b) Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn, Mo,
Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o
microgramos por litro.

c) Factores de crecimiento, que están constituídos generalmente por componentes
orgánicos suministrados en baja concentración y que no son sintetizados ni
metabolizados por las células, sino incorporados a estructuras celulares y de función


metabólica específica, como vitaminas, algunos aminoácidos, ácidos grasos no
saturados, etc.

Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza química de los
componentes, en:

 Medios sintéticos o medios químicamente definidos.
 Medios complejos, en cuya composición intervienen sustancias de origen
animal o vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maíz,
harina de soja, etc. que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas,
pero que son químicamente indefinidas y de composición variable

B) CRECIMIENTO CELULAR

Es importante conocer la cinética de crecimiento de los cultivos microbianos porque
es necesario poder predecir cómo va a evolucionar un cultivo, cómo va a ir
consumiéndose el substrato y cómo se va a ir acumulando el producto de una
fermentación. Sin conocer estos factores es muy imprudente iniciar el cultivo en un
fermentador de 10.000 litros, por ejemplo, con el coste que ello supone, puesto que
no podemos predecir qué va a pasar, cuándo va a completarse el crecimiento, cómo
se va a acumular el producto, etc.

Las células aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo apropiado
van utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficiencia y rapidez
que pueden, sintetizando sus propios componentes celulares y dividiéndose en
cuanto han podido duplicar su masa y su material genético. El tiempo que tarda una
célula en hacer. Cada vez que transcurre un tiempo de generación, el número de
células se duplica, siguiendo, por tanto, un incremento exponencial.

Si llamamos N0 al número de células inicial, y g al número de generaciones
transcurridas, el número de células final (N) será:

Llamando T al tiempo de generación y t al tiempo de cultivo transcurrido, la ecuación
anterior puede transformarse en la siguiente:

⁄


Las ecuaciones exponenciales son muy difíciles de manejar gráficamente, por ello
es mejor transformarlas en algo más simple, como puede ser una recta.

Para transformar las ecuaciones anteriores en una recta, tomamos logaritmos en los
dos términos y resulta:

Esto es: el logaritmo del número de células crece linealmente con el tiempo a razón
de una constante igual a ln2/T. Si el tiempo de generación T es muy grande, el
crecimiento tendrá poca pendiente (será lento) y si T es pequeño el crecimiento será
rápido.Esto es: el incremento en el número de células, en la biomasa de cultivo y en
la acumulación de metabolitos primarios, proteínas, ácidos nucleicos etc., es
paralelo.

Otra forma de representar la cinética es considerando el incremento en el número
de células (dN) en un intervalo corto de tiempo (dt). En este caso, la ecuación que
describe la cinética es la siguiente:

Esto es: el incremento del número de células (dN) por unidad de tiempo (dt) es
proporcional al número de células presentes en el cultivo (N). A la constante de
proporcionalidad (µ) se le denomina tasa de crecimiento y puede considerarse algo
así como la probabilidad de que una célula se divida en un tiempo determinado la
transformación de esta ecuación en una recta (tomando logaritmos) rinde lo
siguiente:

Esto es: el incremento del logaritmo del número de células aumenta linealmente
con el tiempo siendo la constante de proporcionalidad µ. Comparando esta
ecuación con la similar presentada más arriba, podemos concluir que µ = ln2/T y,
por consiguiente, que T = ln2/µ. Es decir, que hay una correlación inversa entre el
valor de la tasa de crecimiento (µ) y el tiempo de generación.


Estas ecuaciones nos permiten predecir cuál será el número de células, masa
celular, etc. después de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos µ; o bien, poder
calcular la tasa de crecimiento µ a partir de medidas experimentales del incremento
en el número de células, biomasa, etc.

Figura 1. Crecimiento celular

El gráfico representa la variación de la biomasa (o número de células, etc.) de un
cultivo (línea roja) a lo largo del tiempo. En este cultivo, se va consumiendo un
substrato cuya concentración (línea azul) decrece de forma proporcional al
crecimiento de la biomasa.

C) CINÉTICA DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA
Una fermentación aeróbica tipo batch o discontinua puede ser considerada como
un sistema cerrado. En el tiempo inicial el medio de cultivo estéril dentro del
fermentador se inocula con microorganismos y la incubación se da bajo condiciones
fisiológicas óptimas. En el transcurso de toda la fermentación, solo se adiciona
oxígeno (en forma de aire), un agente antiespumante, y un ácido o base para el
control del pH, con el fin de garantizar las condiciones óptimas de operación que
permitan obtener una alta concentración celular. La composición del medio de
cultivo, la concentración de biomasa, y la concentración del metabolito cambia
constantemente como resultado del metabolismo celular. En el transcurso de la
fermentación hay 4 fases de crecimiento, por las cuales pasa el microorganismo a
través el tiempo, como se muestra en la figura 4: fase lag, fase exponencial, fase
estacionaria y fase de muerte (Sánchez, 2003).

Figura 2. Curva de crecimiento de los microorganismos.

 Fase Lag o de adaptación: también llamada fase de latencia. Cuando las
células son transferidas de un medio a otro, no hay inicialmente un incremento
en el número de células. Durante esta fase los microorganismos se toman un
tiempo para adaptarse a su nuevo ambiente fisicoquímico y en ocasiones se
sintetizan nuevas enzimas o componentes estructurales (Sánchez, 2003;
Duarte, 1998). La duración de esta fase puede variar dependiendo del
crecimiento de las células en el inóculo, el cual debe tener una edad tal que la
mayor parte de las células que contiene deben encontrarse en fase exponencial
y metabólicamente activas (Barrera, 2004). Es recomendable utilizar inóculos
entre aproximadamente 5 y 10% del volumen total del reactor con el fin de
reducir el tiempo de latencia (Soto, 2004).
 Fase Exponencial o log: Al finalizar la fase lag, las células se han adaptado a
las nuevas condiciones de crecimiento. En este punto las células se reproducen
sin limitación de sustancias nutritivas a velocidad máxima. El crecimiento de las
células se puede describir cuantitativamente como la duplicación del número de
células o biomasa por unidad de tiempo. A través de esta fase las células
alteran el medio constantemente tomando los sustratos y excretando los
productos metabolizados. El crecimiento permanece constante durante esta
fase. La velocidad de crecimiento es independiente de la concentración de
sustrato mientras exista sustrato en el medio y se correlaciona con la velocidad
de crecimiento específico μ y la concentración de células x [células/ mL] según
la ecuación número 1.

(1)


La velocidad de crecimiento específico μ, es generalmente una función de tres
parámetros: la concentración del sustrato limitante S , la tasa de crecimiento
máxima max μ , y la constante especifica de sustrato s K , en cuya concentración
se obtiene la mitad de la máxima velocidad específica de crecimiento (μ = 0.5 máx.
μ ). Esta relación puede ser expresada por medio de la ecuación de Monod (2):

(2)

La velocidad máxima de crecimiento específico max μ es de considerable
importancia a nivel industrial, debido a que es en este punto donde se obtiene el
valor máximo de μ a niveles de saturación de sustrato, relacionando la dependencia
de los microorganismos con las condiciones del fermentador, donde a medida que
aumenta la densidad de población decrece la concentración del sustrato limitante
del crecimiento, causando un descenso de μ . Fase estacionaria: ocurre cuando se
agota una sustancia nutritiva y el sustrato se ha metabolizado, cuando se han
formado sustancias tóxicas o ha ocurrido un cambio de condiciones como pH,
temperatura y concentración de oxígeno disuelto. El crecimiento celular desciende
lentamente o para completamente y en el caso en el que aun pueda estar
ocurriendo crecimiento, este se contrarresta por la rapidez de muerte o lisis celular.
La biomasa incrementa sólo gradualmente o permanece constante durante la fase
estacionaria, aunque la composición de las células puede cambiar (Sánchez, 2003;
Duarte, 1998).

 Fase de muerte: también llamada fase de decaimiento. En esta fase la reserva
de energía de las células se ha acabado, debido a condiciones de inanición o
como consecuencia del metabolismo de mantenimiento de algunas células. El
tiempo entre la fase estacionaria y la fase de muerte depende del
microorganismo y el proceso utilizado (Sánchez, 2003; Duarte, 1998).

D) CONSUMO DE SUBSTRATOS LA LEVADURA Sacchharomyces cerevisiae

La levadura Sacchharomyces cerevisiae es capaz de asimilar una gran variedad de
monosacáridos. También puede hidrolizar y consumir algunos carbohidratos
mayores, como la sacarosa, maltosa, rafinosa, maltotriosa y pectina, pero carece de
las enzimas necesarias para utilizar la lactosa, el glucan y el almidón. Estos últimos


substratos deben ser desdoblados previamente, ya sea por hidrólisis ácida y calor
(pH 2.5), o por la actividad de enzimas exógenas de origen microbiano o vegetal:
lactasa, glucanasa, a y b-amilasas o glucoamilasa. En los mostos de procesos
industriales, las concentraciones de carbohidratos fermentables fluctúan
generalmente entre 6-12% (p/v).

Los carbohidratos asimilados son degradados y oxidados durante el catabolismo a
través del ciclo de la Glucólisis (o vía Embden-Meyerhof-Parnas). La levadura
aprovecha la energía liberada de cada mol de glucosa: para formar dos moles de
ATP y los usa en la etapa anabólica. El ciclo se estabiliza al reducir finalmente dos
moles de NAD+, mientras forma los productos de la fermentación.

Además de la fuente de carbono, la levadura requiere que el medio de cultivo tenga
fuentes apropiadas y suficientes de otros macronutrientes: N, O, H, S y P; de
micronutrientes: Na, K, Ca, Mg, Mn y Fe; de elementos traza y de vitaminas. Se ha
observado un mejor aprovechamiento del nitrógeno cuando sus fuentes son
aminoácidos libres o péptidos pequeños, en comparación con las proteínas, porque
las proteasas de la levadura tienen actividad limitada.

La velocidad de consumo de substrato limitante (fuente de carbono) está ligada
directamente a la velocidad de crecimiento de la levadura. Al entrar en la célula, el
substrato tiene tres destinos: para funciones de mantenimiento, para crecimiento
microbiano y para la formación de productos excretados. En un cultivo sumergido
discontinuo (cinética) la cinética de consumo de substrato limitante se representa
así:

⁄ ⁄
⁄ ⁄

Dónde:

 qs: Velocidad específica de consumo de substrato
 m: Tasa de mantenimiento
Velocidad de consumo de substrato para el crecimiento microbiano:

⁄


Velocidad de consumo de substrato para la formación de los productos ligados al
crecimiento microbiano:

⁄

E) CRECIMIENTO DE LA LEVADURA

El proceso de reproducción normal de Saccharomyces cerevisiae es asexual
(mitosis) y se llama gemación. En éste se observa la formación de yemas o
blastosporas que dan origen a nuevas células haploides al crecer. Sólo en
condiciones críticas se combinan dos células para formar un cigoto diploide, y
después de la reducción de cromosomas (meiosis) se forman 4 esporas sexuales
(ascosporas) que al germinar producen nuevas células haploides.

Saccharomyces cerevisiae es anaerobia facultativa, por lo que se obtiene un mayor
rendimiento de biomasa en aerobiosis que en anaerobiosis. El cultivo aerobio es
importante durante la propagación del inóculo, llamado también cultivo semilla

El cultivo principal se realiza en condiciones anaerobias o microaerófilas
El valor de la velocidad específica de crecimiento microbiano (m) en anaerobiosis
fluctúa entre: 0.13 y 0.408 h-1. El rendimiento aproximado de biomasa con respecto
al consumo de substrato en estas condiciones es:

Y el de producción de ATP es de:

⁄

F) CRECIMIENTO Y SÍNTESIS DEL PRODUCTO EN PROCESOS INDUSTRIALES.

Hay dos tipos fundamentales de productos metabólicos: primarios y secundarios. Un
metabolito primario es el que se forma durante la fase primaria del crecimiento del
microorganismo, mientras que un metabolito secundario es el que se forma cerca
del final de la fase de crecimiento, frecuentemente cerca de, o en la fase
estacionaria del crecimiento. Las diferencias entre un metabolito primario y un
metabolito secundario se ilustran en la imagen de la izquierda.


 Metabolitos primarios microbianos.

Un proceso microbiano típico, en el que el producto se forma durante la fase
primaria del crecimiento, es el alcohol (etanol) obtenido por fermentación*. El etanol
es un producto del metabolismo anóxico de la levadura y de algunas bacterias y se
forma como parte del metabolismo de la energía. Debido a que el crecimiento sólo
puede tener lugar si puede producirse energía, la formación de etanol tiene lugar en
paralelo con el crecimiento.

 Metabolitos secundarios microbianos.

Un tipo más complejo de productos industriales es aquel en el que el producto
deseado no se produce durante la fase primaria del crecimiento sino durante la fase
estacionaria. Los metabolitos producidos durante la fase estacionaria se denominan
metabolitos secundarios y son algunos de los metabolitos más comunes y más
importantes de interés industrial. Mientras que el metabolismo primario es
generalmente similar en todas las células, el metabolismo secundario presenta
claras diferencias entre un organismo y otro. Las características reconocidas del
metabolismo secundario son:

 Cada metabolito secundario sólo lo forman relativamente pocos
organismos.
 Los metabolitos secundarios, aparentemente no son esenciales para el
crecimiento y la reproducción.
 Con frecuencia, los metabolitos secundarios se producen como un grupo
de estructuras estrechamente relacionadas.
 Con frecuencia es posible obtener una espectacular superproducción de
metabolitos secundarios, en tanto que los metabolitos primarios, ligados
como están al metabolismo primario, usualmente no se pueden
superproducir de una manera tan espectacular.


G) MEDIO DE CULTIVO.
La producción de levadura, requiere además de unas condiciones ambientales
óptimas, de una variedad de nutrientes esenciales y vitaminas (Gómez, 2003). Los
nutrientes existentes en los medios de cultivo dan a la célula microbiana todos los
ingredientes requeridos para que produzca más células semejantes a ella misma
(Ramírez y Pedroza, 2001). Por lo tanto, es conveniente considerar un diseño de
medio de fermentación que genere las mejores garantías de crecimiento, el mejor
desarrollo para el microorganismo y el máximo rendimiento de producción. El medio
debe satisfacer los requerimientos nutricionales y ambientales del microorganismo,
además de las restricciones técnico-económicas para minimizar los costos de
separación y purificación. La determinación de los requerimientos nutrimentales,
ambiéntales y la composición, dependen de la estequiometría de crecimiento y
formación de producto (Duarte, 1998).

En la Figura 3, se muestran los requerimientos básicos de nutrientes para los
microorganismos y las formas comunes de satisfacerlos en los cultivos

Figura 3. Requerimientos nutrimentales para los medios de cultivo

Determinación de la curva de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae, aplicando UNT
el modelo de Gompertz

Los medios se clasifican de acuerdo a la naturaleza de los componentes, en: 1)
medios sintéticos o también llamados medios químicamente definidos y 2)
medios complejos, en cuya composición intervienen sustancias de origen
animal y vegetal, como peptonas, extracto de levadura, macerado de maíz,
harina de soya, de pescado, de sangre, extracto de carne, entre otros, que
aportan las sustancias fundamentales (macro y micronutrientes) (Ramírez y
Pedroza, 2001).

La formulación del medio tiene que ver con los aspectos cuantitativos,
estableciendo las concentraciones y cantidades de cada componente. Para
promover el crecimiento celular son requeridos factores esenciales en los
medios de cultivo como ciertos aminoácidos y vitaminas (Ramírez y Pedroza,
2001). En el caso de la célula de levadura, para su desarrollo ésta requiere de
nutrientes como el nitrógeno (sales de amonio, sulfato de amonio y urea),
fósforo (fosfato diamónico y ácido fosfórico), magnesio (sales de magnesio),
potasio, calcio, azufre, hidrocarburos y trazas de hierro, zinc, cobre, manganeso
y molibdeno (Guilliermond, 1920; CNMA, 1998). En cuanto a las vitaminas son
necesarias la biotina, inositol, ácido pantotenoico y tiamina (Asenjo, 1995;
CNMA, 1998).

Para la fabricación industrial de levadura de panadería las principales materias
primas son el cultivo puro de levadura y la melaza de caña que constituye la
principal fuente de carbono del medio de cultivo, debido a su alto contenido de
azúcares fermentables (45 a 55% en peso) en forma de sacarosa, glucosa y
fructosa (CNMA, 1998). A nivel de laboratorio S. cerevisiae se cultiva en medios
complejos que aportan a la célula los nutrientes necesarios para su crecimiento,
entre los que se destacan YM, Goering y Van Soest y el de Pell y Pschofield.
Sin embargo, la composición de los medios de cultivo debe ser constantemente
adaptada a los procesos de fermentación (Ramírez y Pedroza, 2001).


IV. MATERIALES Y METODOLOGÍA
A. MATERIALES Y EQUIPOS

Materiales

 Sacarosa
 Harina de soya
 fosfato de amonio
 Tiosulfato de sodio
 Ácido fosfórico
 Ácido cítrico
 Agua destilada
 Levaduras Fleshman

Equipo:

 Microscopio
 Cámara de Neubauer.
 Bioreactor
 Balanza analítica.
 Cocina.

Otros:

 Lámina cubreobjetos
 Jeringa de carga
 Balón
 Vaso de precipitación


B. METODOLOGÍA

Procedimientos

Cálculos
En primer lugar se procedió hacer los cálculos el medio de cultivo, tomando en
cuenta las necesidades de la levadura Sacharomyces Cerevisae y teniendo
en cuenta que la levadora se trató de calcular un medio lo más natural posible.

Preparación del medio de cultivo (ver en Anexos)

Se procedió a pesar los materiales necesarios en base a nuestros cálculos,
para la preparación el medio de cultivo los cuales son los siguientes:

 200g de sacarosa
 100g de harina de soya
 8.117g fosfato de amonio pentahidratado
 8.96g Tiosulfato de sodio
 469g Ácido fosfórico
 800g agua destilada

En un recipiente se combinó los materiales, la harina de soya fue agregada
poco apoco y paralelamente se fue removiendo con el fin de que no quedase
ningún grumo por la harina de soya.

Enseguida se procedió a medir los grados Brix del medio, el cual fue de 20º
Brix y con un pH de 6.2, se ajustó el pH con Ácido cítrico hasta que llegase a
un pH de 5.

Luego esta solución se puso en un balón de vidrio con un corcho en la boca, el
cual tenía un pequeño orificio para el termómetro.


Paralelamente en una olla se puso a calentar agua hasta que llegue a una
temperatura de 50ºC.

A esta temperatura de 50ºC recién se puso el balón conteniendo el medio de
cultivo, y se siguió calentando hasta que la solución dentro del balón llegase a
80 ºC y se conservó a esta temperatura por 15min con el fin de pasteurizar el
medio de cultivo.

Luego se dejó enfriar el medio de cultivo hasta 30ºC.

Activación de las levaduras

 Se hizo una solución de 20 ºbrix, con el fin de activar la levadura en polvo.
 Se adiciono la levadura en polvo, se removió y se dejó reposar por unos
minutos.
 Después de algunos minutos se notó rápidamente el crecimiento y la
activación de la levadura, puesto que la levadura la espuma que daba la
levadura (CO2) rebosó el vaso de precipitación donde se estaba
preparando el medio de cultivo.
 Luego se hizo un recuento en la cámara de neubauer, pero no se pudo
contabilizar pues eran demasiadas. Motivo por lo cual se procedió a hacer
una dilución de 1/10 para que la concentración llegara 107 levaduras/mL
esto de acuerdo a las indicaciones del docente.

Crecimiento de las levaduras en el birreactor

 Luego que se llegó a enfriar medio de cultivo a 30ºC recién se agregó las el
10% de levaduras en función al medio.
 En seguida se agregó esta solución al birreactor, el cual estaba en
constante agitación.
 Seguidamente por un lapso de 2 horas se extrajo muestra cada 15
minutos. La primera muestra extraída con una jeringa fue vertida en la


cámara de Neubauer sobre una laminilla y luego fue colocada en el
microscopio
 Luego procedimos con un aumento de 40X se realizó el conteo respectivo
de células
 Pasada ya las 2 horas las se iniciaron a extraer las muestras cada 30
minutos.
 Después de unas horas el crecimiento de la población aumento
considerablemente por ello se consideró realizar una dilución 10 -1.
 Finalmente se procede a realizar la respectiva curva de crecimiento para la
producción de levadura.


V. RESULTADOS DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE LEVADURA Sacharomyces
cerevisae , APLICANDO EL MODELO DE GOMPERTZ

TABLA 1. Datos de los números de levaduras de Sacharomyces cerevisae, tomadas al azar

MUESTRA
MEDIDAS NÚMEROS DE LEVADURAS AL AZAR TOTAL PROMEDIO VOLUMEN DILUCIÓN
ORIGINAL
1 79 88 73 77 83 400 80 0.000004 - 20000000
2 132 120 81 75 101 509 101.8 0.000004 - 25450000
3 16 20 22 13 13 84 16.8 0.000004 10 42000000
4 17 23 18 12 16 86 17.2 0.000004 10 43000000
5 16 14 15 17 9 71 14.2 0.000004 10 35500000
6 25 19 7 12 26 89 17.8 0.000004 10 44500000
7 25 26 23 24 22 120 24 0.000004 10 60000000
8 22 18 17 20 21 98 19.6 0.000004 10 49000000
9 25 21 28 25 24 123 24.6 0.000004 10 61500000
10 24 28 21 29 24 126 25.2 0.000004 10 63000000
11 27 28 23 25 27 130 26 0.000004 10 65000000
12 27 25 26 22 32 132 26.4 0.000004 10 66000000
13 41 43 40 38 35 197 39.4 0.000004 10 98500000
14 40 41 37 46 43 207 41.4 0.000004 10 103500000
15 42 46 35 39 47 209 41.8 0.000004 10 104500000


TABLA 2. Determinación de los parámetros de crecimiento de levaduras Sacharomyces cerevisae del medio de cultivo.

MUESTRA ORIGINAL
MUESTRAS TIEMPO (h) LOG( N/N0)(UFC/g)
N
1 0.166667 20000000 0
2 0.333333 25450000 0.104657791
3 0.500000 42000000 0.322219295
4 0.666667 43000000 0.33243846
5 0.833333 35500000 0.249198357
6 1.000000 44500000 0.347330015
7 1.166667 60000000 0.477121255
8 1.333333 49000000 0.389166084
9 1.500000 61500000 0.48784512
10 2.000000 63000000 0.498310554
11 2.500000 65000000 0.511883361
12 3.000000 66000000 0.51851394
13 3.500000 98500000 0.692406235
14 4.000000 103500000 0.713910354
15 4.500000 104500000 0.718086295

TABLA 3. Parámetros para cálculo de gráfica de Gompertz

a 0.676447
b 0.706306
c 1.095409
µ máximo 0.74098544
λ -0.2681135
G 0.93543968


Figura 4. Determinación de la Curva de Crecimiento de la Sacharomyces cerevisae aplicando modelo de Gompertz


0.8

0.7

0.6

0.5
Log( N/N0)(UFC/g)

0.4

0.3 y = 0.2099ln(x) + 0.3749
R² = 0.9256
0.2

0.1

0
0.0000000.5000001.0000001.5000002.0000002.5000003.0000003.5000004.0000004.5000005.000000
-0.1
Tiempo (horas)

Figura 5. Tiempo (horas) vs Log (UFC/g) en Sacharomyces cerevisae


Según Ventanas (2000); nos cuenta que el desarrollo de los microorganismos
puede representarse mediante una gráfica que corresponde a una función
matemática relativamente compleja. El estudio de estas funciones matemáticas
tiene gran interés desde el punto de vista microbiológico, ya que puede servir para
predecir el crecimiento de los microorganismos, y de este modo saber mediante
un simple cálculo matemático, con un ordenador, la evolución que tendrían los
microorganismo de interés en un producto determinado. De hecho, se está
haciendo un considerable esfuerzo para diseñar y validar los modelos
matemáticos que permiten establecer el desarrollo microbiano y que son de gran
valor a la hora de tomar decisiones respecto al diseño de instalaciones y procesos,
adquisición de equipos o características de los productos. Una de las fórmulas
más ampliamente utilizadas es la ecuación de Gompertz. Así mismo; en la Figura
4 podemos observar los resultados arrojados por STATISTICA validados para el
modelo de Gompertz; donde, el valor de a es igual a 0.676 nos indica el numero
inicial de microorganismos viables. El valor de b nos indica una velocidad de
crecimiento relativa de 0.706 en unidades de 1/horas a la velocidad máxima de
crecimiento en las condiciones trabajadas. La diferencia entre el número inicial y el
recuento máximo que se puede alcanzar en el medio está indicado por el valor c
que es 1.095.

Según Hernández (2008), nos dice que la curva de crecimiento de un
microorganismo representa el comportamiento de su crecimiento a través del
tiempo. Con base en ella, se determina cuando se produce la mayor cantidad de


biomasa o de metabolitos (primarios o secundarios). Si hacemos un contraste
entre la curva de la figura 1 obtenida en el software statistica 7; y la curva de
crecimiento extraída de bibliografía (Figura 5); observamos que la fase de latencia
que presentó la levadura no fue tan marcada, casi imperceptible, esto se debe a
que la levadura presente en el inóculo entró al biorreactor en una fase logarítmica,
esto porque se puso a la levadura en un medio con sustrato (azúcar) y a la misma
temperatura que se trabajó en el biorreactor para que vaya adaptándose antes de
ser vertido en el reactor. En un proceso de obtención de biomasa la fase de mayor
importancia es la fase logarítmica, pues de la velocidad de cómo se de ésta
dependen factores como el costo. En la figura 4 se aprecia que la mayor pendiente
de la curva de crecimiento, es decir la máxima velocidad de crecimiento de la
levadura Saccharomyces cerevisiae se da entre los tiempos de 0.5 y 1 horas, es
decir el mayor crecimiento se dio entre los 30 min y 60min.

Según Scragg (1996), nos dice que la fase “lag”, es un tiempo de aparente no
crecimiento, el cual se da en nuestro caso para la primera 0.5 hora, pero estudios
bioquímicos demuestran actividad metabólica, indicando que las células están en
proceso de adaptación a las condiciones ambientales y que un nuevo crecimiento
comenzará, eventualmente. Existe, luego, una fase de aceleración transitoria
cuando el inóculo comienza a crecer que es seguida, rápidamente, por una fase
de crecimiento exponencial, esta fase exponencial se aprecia a un tiempo de 4
horas aproximadamente, ya que luego comienza a decaer. Esta fase final del ciclo,
es la fase de muerte, cuando la velocidad de crecimiento ha cesado. Y según el
mismo autor, la mayoría de los procesos biotecnológicos por lotes se detiene
antes de esta fase, debido a la disminución en el metabolismo y a la lisis celular.

Según Hidalgo (2003), nos recalca que los azúcares fermentables por las
levaduras son la principal fuente de alimentación carbonadas, especialmente la
glucosa y la fructosa como azucares mayoritarios, sirviendo de base para la
síntesis de los compuestos que necesitan, así como también de fuente de energía
para atender sus funciones vitales como en el caso de la práctica que se le añadió


soya que es un alimento con alto contenido de nitrógeno; además de fósforo,
azufre y amonio que se apoyó de compuestos químicos tales como el ácido
sulfúrico, fosfato de amonio y tiosulfato de sodio. Así el autor nos dice que en
medios muy pobre, con menos de 10 gramos/litro, la velocidad es muy lenta,
acelerando hasta concentraciones de 20 gramos/ litros, donde a partir de este
valor la velocidad se mantiene hasta los 200 gramos/ litro. Después de esta
cantidad la velocidad de fermentación decrece a medida que la concentración
aumenta, cesando totalmente a partir de los 600 gramos/litro por la elevada
presión osmótica presente en el medio. Esto se nota en la experimentación ya que
según la curva de crecimiento, existe un punto en el cual el crecimiento aumenta
la velocidad de crecimiento y otro punto en el cual este se detiene.

Según Doran (1998), nos afirma que una de las condiciones que se tiene que
tener en cuenta en el biorreactor para el crecimiento de la biomasa es el aporte de
oxígeno, y si analizamos lo que se dio en nuestra practica podemos decir que este
fue continuo para ayudar al aporte de estas (levaduras) y para evitar la
fermentación y así conllevar a la producción de alcohol y CO 2. El autor también
expresa que este aporte de oxigeno además de evitar la fermentación, sirve para
mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen del cultivo a
fin de prevenir la sedimentación o la flotación, mantener constante y homogénea la
temperatura.

Según IICA (1989), la biomasa de microorganismos es una excelente fuente de
nutrientes (proteínas, grasa, vitaminas, minerales y otros factores). Por lo tanto,
siempre ha existido un interés de incorporarla al sistema alimentario humano tanto
en forma directa como indirecta (a través de animales). Entre ellas, es la
proveniente de levaduras la que posiblemente se ha estudiado con mayor
profundidad. Por lo dicho se puede afirmar que no solo es un proceso previo a la
fermentación de un vino, cerveza o cualquier bebida alcohólica el hecho de poner
en un biorreactor un inóculo de levaduras con el fin de aumentar el número de
células y hacer más factible la fermentación alcohólica; si no es un proceso que


puede manejarse a nivel alimentario con el fin de obtener una fuente rica en
proteínas como lo son las levaduras, para ello se necesitaría producción de
grandes cantidades de biomasa en cortos tiempos. Todo esto se podría llevar a
cabo evaluando los mejores parámetros de temperatura, pH y nutrientes que
necesitan las levaduras.

VI. CONCLUSIONES

 Se preparó un medio de cultivó basado en soja, azúcar rubia y demás
componentes y se manejó adecuadamente la autoclave.
 Se confeccionó la gráfica de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae
mediante el modelo de Gompertz, obteniendo el modelo matemático de
y=0.2099Ln(x)+0.3749, con un R2 de 0.9256, un valor alto que se acerca a
uno, lo cual nos indica un índice de confianza aceptable. En las cuadros 1 y 2
se puede observar cómo va creciendo la levadura hasta llegar a un valor donde
se tiende a hacerse constante, lo cual nos indica que ha llegado a su punto
máximo de crecimiento.
 Se conoció un poco más acerca del método de Gompertz en el crecimiento de
levadura Sacharomyces cerevisae.
 Se identificó sus fases, las cuales se pueden apreciar en la Figura 1. Curva de
crecimiento microbiano, utilizando el método de Gompertz, las cuales son:Fase
Lag: Del Punto inicial hasta la intersección del punto 0.0-0.1. Fase exponencial:
Desde el segundo punto (0.0-0.1) hasta la lectura del punto 13. Fase
Estacionaria: Desde el punto 13 hasta el punto 15 donde tiene una tendencia a
mantenerse constante. Fase Muerte: No se determinó dado que solo se obtuvo
hasta Fase Estacionaria.
 Se calculó el tiempo de generación mediante el modelo:
y=0.2099Ln(x)+0.3749; donde Y= Log (N/No) – X=tiempo.


VII. BIBLIOGRAFÍA

ASENJO A. (1995). Microbiología de las fermentaciones industriales. (7ª ed.).
Zaragoza: Editorial Acribia.
DORAN, P. (1998) .Principios De Ingeniería De los Bioprocesos. Edit.Acribia. S.A
Zaragoza- España.
DUARTE P. (1998). Biotecnología de la fermentación, Primera Edición, Editorial
Acriba S.A., Zaragoza (España).
GOMEZ E. (2003), ASPECTOS BÁSICOS DE BIOTECNOLOGÍA. Instituto
Tecnológico y de Estudios Superiores de Occidente, A
HERNÁNDEZ, A. (2008). Microbiología Industrial.
Hidalgo J. (2003) Tratado de etnología Editoria: Mundi-Prensa Libros S.A., México.
IICA (1989). Oportunidades de las biotecnologías Agropecuarias en América
Central. Programa II; Generación y Transferencia de Tecnología.
RAMÍREZ O. PEDROZA M. (2001). Evaluación De Parámetros Cinéticos Para La
Sacharomyces Cerevisiae Utilizando Agua De Coco Como Sustrato, San José,
Costa Rica.
SANCHEZ A. (2003). Las biotecnologías: desafíos y promesas Investigaciones
Biológicas. La Habana..
SCRAGG, A.(1996). Biotecnología. Edit. El Manual Moderno. México D.F.
VENTANAS, J. (2000). Tecnología del jamón Ibérico: Delos sistemas tradiciones a
la explotación racional del sabor y el aroma. Ediciones Mundi-Prensa. Madrid.
España.


ANEXOS

ANEXO 01.Diseño de un medio de cultivo

Levadura
Reacción general

A C12H22O11 +BO2 +C NH3 C3.72H6.11O1.95N0.61 +D CO2 +E H2O

Donde:
90.5g (90%)

10g (10%)

≈ 100g

Si:

100g sacarosa  100g levadura 10,4 (NH3)102,6g (O2)

Para el diseño de un medio se necesita de ciertos componentes tales como Macronutrientes
(CHONPS) y Micronutrientes (P y S) teniendo

Materiales.

 Harina de soya (100g)
Fuente.
P 0.61g
Mg 0.27g
S 0.42
Zn 0.5g
Proteína 43g

Proteína
 Sacarosa (azúcar rubia) 200g 20ªBrix
 Fosfato de amonio (NH3)4 PO4 ≈ 163g/mol
 Acido fosfórico H3PO4 ≈ 98g/mol
 Tiosulfato de sodio Na2S2O3 ≈ 164g/mol


Requerimientos

Macronutrientes
Fosforo (P) 4g
Azufre (S) 4g
Amonio (NH3) 10.4g
Sacarosa 200g
Oxigeno 102.6g
Micronutrientes
Zinc (Zn) 5mg
Magnesio (Mg) 5mg

Dónde: la harina de soya se completa los requerimientos de Zn (5mg), de P(faltaría 3,39g), de Mg
se completa , de S (falta 3,5g) y del NH3 ( faltaría 2.g)

Entonces calculamos para completar:

 NH3

 Azufre

 Fosforo
gP
Entonces nos faltaría
3,39-1.905=1.485g P

Finalmente nuestras moléculas para el medio de cultivo serian.

 200g sacarosa
 100g harina de soya
 8.117g fosfato de amonio 800g H2O
 8.96g tiosulfato de sodio
 469g
 Buffer

 El cual se encontrara en agitación constante


Figura 6. Materiales para el diseño Figura 7. Harina de Soya para Figura 8. Pesado de la
del medio de cultivo el medio de cultivo Harina de Soya.

Figura 10. Preparación del Figura 11. Medio de Cultivo
Figura 9. Pesado de los Medio de Cultivo
materiales

Figura 12. Medio de cultivo 2 Litros Figura 13. Medición de la Figura 14. Medio de Cultivo en
temperatura del medio de Cocción.
cultivo


Figura 13. Pesaje del Figura 14. Medio de Cultivo Figura 15. Materiales para el conteo
Cultivo para la medición de Levaduras Sacharomyces
de Levaduras cerevisae

TUTORIAL MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA GOMPERTZ


 Model is: YA=a*exp(-exp(b-c*TA))

 OK , OK


 OK


 Summary: Parameter estimates

Determinación de la curva de crecimiento de levadura

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