Validação de método CLAE para determinação de resíduos de oxitetraciclina em camarão cultivado

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
DEPARTAMENTO DE PESCA E AQUICULTURA
PROGRAMA DE PÓS -GRADUAÇÃO EM RECURSOS PESQUEIROS
E AQUICULTURA

Beatriz Regina Brito de Oliveira

VALIDAÇÃO E APLICAÇÃO DE MÉTODO PARA
DETERMINAÇÃO DE OXITETRACICLINA POR
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
(CLAE) EM CAMARÃO CULTIVADO

Orientadora: Profa Dra Emiko Shinozaki Mendes

Recife/PE
Agosto, 2008

Introdução
 Cultivo de camarão no Brasil
(FAO, 2007)

 2003: 90.190 t
 2007: 65.000 t

 Enfermidades: desafios da atividade

 Desequilíbrio ambiental
 Vulnerabilidade
 Bactérias oportunistas

Introdução

 Medicamentos veterinários

 Oxitetraciclina (OTC)
 Prevenir ou tratar

 Exigências dos mercados: segurança
alimentar

 Europa (RASFF)
 Análise de resíduos
 Utilização de metodologias validadas
 Técnicas conceituadas

Introdução

Objetivou-se validar um método para
determinação de OTC em camarão cultivado,
utilizando a técnica de cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAE), e avaliar os níveis de
resíduos da droga in vivo.

Revisão de literatura
 Produção de camarões
Tabela 1. Principais países produtores de camarão em 2005.
Principais países Produção (t) Produtividade
produtores (kg/ha/ano)
China 1.024.949 3.416
Tailândia 375.320 5.864
Vietnã 327.200 453
Indonésia 279.539 708
Índia 130.805 769
Equador 130.000 867
México 72.279 1.681
Brasil 65.000 4.333
Bangladesh 63.052 435
Filipinas 39.909 1.330
América Central* 41.919 1.048
* (Bahamas, Belize, Costa Rica, Cuba, El Salvador, Guatemala, Honduras, Jamaica,
Nicarágua, Panamá, Porto Rico, República Dominicana) Fonte: FAO (2007)


 Brasil (ABCC, 2005a)

Antidumping e
enfermidades

2003: 2004:
90.190 t 75.904 t

 Região Nordeste (SAMPAIO e COSTA, 2003):

93% da produção nacional
Empregos diretos e indiretos


 Enfermidades
 Vírus e bactérias

Figura 1. Camarão em grampo Figura 2. Lesão no hepatopâncreas
Fonte: Lightner (1996) Fonte: Lightner (1996)

Infecções secundárias: bacterioses
NHP: Rickettsia (FRELIER et al., 1992; LOY et al., 2003)
Vibrioses: Vibrio spp (LIGHTNER, 1996)


 Antibióticos na aquicultura
 Uso disseminado
 Ecotoxicidade em ambientes aquáticos
 Formas de administração
 Oxitetraciclina (LALUMERA et al., 2004; DIETZE et al., 2005;
LYLE-FRITCH et al., 2006; CHRISTENSEN et al., 2006)

Figura 3. Estrutura molecular da OTC. Fonte: (USP, 2005)


 Oxitetraciclina
 Ação e locais de ligação (ALIABADI e LEES,
2000; COUTO, 2000; OKA et al., 2000)

 CIM vibrioses: 0,2 a 100 ppm ou mg L-1
(RUANGPAN e KITAO, 1992; LIGHTNER, 1997)

 Concentração OTC na ração:
1,5 g Kg-1 por 14 dias (MOHNEY et al., 1997)
4,5 a 22,5 g Kg-1 por 14 dias (BRAY et al., 2006)
4,5 g Kg-1 por 14 dias (NOGUEIRA-LIMA et al., 2006)

 Sintomas (efeitos tóxicos para humanos)


 Resistência bacteriana e implicações
 Subdosagens e superdosagens (MENDES et
al., 2004)

 Bactérias resistentes:
Seleção e propagação de genes de resistência
(MORIARTY, 2004);
Isolamento de cepas em áreas de aquicultura
(TENDÊNCIA e DE LA PENA, 2001; LE et al., 2005);

 Efeitos dos fármacos em organismos não-
alvo (HALLING-SORENSEN et al. 2000)

 Uso restritivo e consequências (HOLMSTRÖM,
2003)

 Legislação para utilização de fármacos
em espécies animais

 BRASIL
PCRP (BRASIL, 2006)
PAMVet (BRASIL, 2003)

 LMR para OTC
FDA (1998): 2000 µg kg-1 em alimentos frescos
EMEA (1990): 100 µg kg-1 de OTC
CODEX (2006): 200 µg kg-1 de OTC em músculo de
pescado

 Métodos de análise de OTC em matrizes
animais

 Métodos oficiais
CLAE - músculo de bovinos e suínos (AOAC, 1995)
Bacillus cereus (AOAC, 2000)

 Técnicas

Eletroforese capilar
Cromatografia Camada Delgada
CLAE-DAD*


 Métodos para detecção de OTC por CLAE

Macrobrachium rosenbergii (BRILLANTES et al., 2001)

Penaeus japonicus (UNO, 2004)

Penaeus monodon (SANBGRUNGRUANG et al., 2004)

Litopenaeus setiferus (REED, 2006)

Litopenaeus vannamei (NOGUEIRA-LIMA et al., 2006*;
FROONGSARNG et al., 2007; GOMEZ-JIMENEZ et al., 2008)


 Validação de métodos analíticos

 Resultados confiáveis e qualidade analítica

 Exigência dos mercados

 ISO, USP, FDA, AOAC

 Documentação

 Características de desempenho ou parâmetros de
validação (INMETRO, 2007)


 De acordo com o exposto, fatores
econômicos, aspectos sanitários e
ambientais da utilização de OTC na
carcinicultura ainda são pouco conhecidos
e, portanto, faz-se necessária a validação e
a implantação de metodologias para análise
de OTC por CLAE.

Ferramenta: Qualidade processo
Métodos validados e produto

Consolidação do Saúde pública
consumo Estudos ambientais

Artigo científico

“ DETERMINAÇÃO DE OXITETRACICLINA
POR CLAE-DAD EM CAMARÃO MARINHO
Litopenaeus vannamei (Boone, 1931)”

REVISTA AQUACULTURE

Artigo científico – Material e Métodos

 Material e Métodos
 Material
Solventes e reagentes grau CLAE
Padrões de referência da USP (OTC e TC)


 Material

OTC comercial contendo 50% (m/m) de OTC base

Ração contendo 35% de proteína bruta

Camarões isentos de OTC e adicionados in vitro para os
testes de validação


 Preparação da amostra

Nogueira-Lima et al. (2006) com modificações: amostras
de músculo e carapaça


 Técnica de extração da OTC

Tampão McIlvaine

Adição de TCA 24%
Amostra (1,0 g) Centrifugação

SPE e evaporação Hexano, centrifugação e Repetição da extração e
descarte da fase união dos sobrenadante
superior
CLAE


 Análise de OTC por CLAE

Condições cromatográficas:

C18 Phenomenex (250 x 4,0 mm; 5 µm)
Injeção: 50 µL
Detecção: 365 nm
FM (75:18:7):
(A)OXA 0,01 M
(B)ACN
(C)MeOH
Fluxo: 1 mL minuto-1


 Validação da metodologia de análise

Laboratório de Contaminantes Químicos e Biológicos
(LEMI/ITEP)

INMETRO (2007)

Tempo de retenção
Linearidade
Faixa de trabalho
Recuperação
Limites de Detecção e Quantificação do Método (LDM e
LQM)
Seletividade


 Desenho experimental

Estação Experimental Prof. Johei Koike (UFRPE)

Camarões de fazenda aclimatados por 30 dias em tanques de 500 L
contendo água marinha tratada



Densidade: 28 cam/tanque
Tratamentos (duplicata):
OTC na ração por 14 dias

Testemunha
3000 µg OTC g-1
5000 µg OTC g-1
7000 µg OTC g-1


Desenho experimental
C

Á


Animais coletados
Carapaça e músculo: congeladas para análise de OTC
Hepatopâncreas: análise de Vibrio spp



Temperatura Oxímetro
Oxigênio dissolvido

Salinidade - Refratômetro

pH – pHmetro

Avaliados todos os tanques diariamente


 Ração

Fornecida a aproximadamente 4% biomassa por dia e
dividida em duas alimentações diárias

Concentração teórica de OTC fornecida na ração para
cada tratamento:

3000 µg g-1 120 µg g-1

5000 µg g-1 200 µg g-1

7000 µg g-1 280 µg g-1


 Análise de Vibrio spp

Silva et al. (1997)
Remoção dos hepatopâncreas

Diluição, inoculação, incubação e leitura


 Análise estatística

Experimento OTC:Teste de Tukey com p< 0,05

Bacteriologia: técnica dos máximos e mínimos

Validação: INMETRO (2007)

Artigo científico – Resultados

 Resultados
 Metodologia e parâmetros de validação
Tempo de retenção OTC: 6,2 – 6,9 minutos (Figuras 1 e 2)
Linearidade (coeficiente de correlação linear) na faixa de trabalho de
0,02 a 0,4 µg mL-1 ou g-1 :
Em solução: 0,9998
Em extrato da matriz: 0,9997
Recuperação relativa e incerteza de medição a 0,1 µg g -1:
106,0 ± 17,1%
Repetitividade (coeficiente de variação): 16,1%
LDM e LQM: 0,006 e 0,019 µg g-1, respectivamente.
Seletividade: sem interferentes no TR do analito (Figura 2)

Figura 2. Cromatogramas para OTC:
(A) solução padrão OTC 0,1 µg mL-1
(B) extrato do músculo do camarão
fortificado a 0,1 µg g-1 e
(C) extrato do músculo de camarão
isento de OTC.

Figura 3. Cromatogramas
para carapaça isenta de OTC
(A) e para carapaça com
OTC (B).


 Eliminação de resíduo de OTC no músculo e na
carapaça

Tabela 1. Tempo de depleção da OTC
Tratamentos (µg g-1)
Dia após a 3000 5000 7000
medicação Músculo Carapaça Músculo Carapaça Músculo Carapaça
1º 0,028 ± 0,006 0,14 ± 0,06 0,037 ± 0,007 0,15 ± 0,09 0,014 ± 0,004 0,051 ± 0,006
5º ND 0,049 ± 0,001 ND 0,045 ± 0,001 ND 0,017 ± 0,007
10º ND 0,019 ±0,007 ND ND ND ND
13º ND ND ND ND ND ND
N = 4: ND = não detectável


0,20 -1
3000 µg g
y = -50,638Ln(x) + 133,87
2
R = 0,7549
-1
0,16 5000 µg g
y = -65,023Ln(x) + 149,61
2
R = 0,7643
-1
7000 µg g
Nível OTC (µg g )

0,12 y = -22,706Ln(x) + 49,309
-1

2
R = 0,9237

0,08

0,04

0,00

0 2 4 6 8 10 12 14
Dias após suspensão da medicação

Figura 3. Níveis de resíduo de OTC na carapaça nos diferentes
tratamentos


Análise da OTC comercial utilizada nos tratamentos

Rótulo: 50%
Resultado da análise: 5%

Análise da ração utilizada nos tratamentos

Tratamento Concentração teórica Concentração real
de OTC fornecida* de OTC
fornecida*
3000 µg g-1 120 µg g-1 8 µg g-1

5000 µg g-1 200 µg g-1 16 µg g-1

7000 µg g-1 280 µg g-1 20 µg g-1
*
Por camarão/dia


Análise da água

Temperatura: 30,54 ± 2,78ºC
Salinidade: 30,18 ± 0,61 g L-1
pH: 8,36 ± 0,34
Oxigênio dissolvido: 5,75 ± 0,82 mg L-1

 Análise de Vibrio spp

Tabela 2. Valores máximos e mínimos obtidos na contagem de
Vibrio spp
UFC mL-1
Tratamento (µg g-1) Máximo Mínimo
Hepatopâncreas Água
3000 7,4 x 105 1,1 x 102
5000 8,9 x 105 4,2 x 102
7000 9,0 x 103 1,15 x 102

Artigo científico – Discussão

 Discussão
 LDM abaixo do LMR de 0,1 µg g-1 (EMEA, 1990) e o
mais baixo para um método que utiliza CLAE-DAD

Nogueira-Lima et al. (2006): 0,05 µg g-1
Uno, 2004; Reed et al., 2004; Uno et al., 2006; Reed et al., 2006;
Froongsarng et al., 2007; Gomez-Jimenez et al., 2008: entre
0,008 e 0,5 µg g-1.

 Recuperação relativa e repetitividade aceitáveis pelo
Codex (2002) e recuperação maior que a obtida no
método original

Nogueira-Lima et al. (2006): 81,68 ± 1,54%


 Os coeficientes de correlação linear em solução e no
extrato da matriz fortificado foram aceitáveis segundo
INMETRO (2007);

 As concentrações reais de OTC fornecidas nas rações
se encontraram abaixo da administração indicada por
Lightner (1996) de 45 a 150 µg g-1 por camarão/dia
devido a baixa concentração do fármaco comercial
utilizado;

RESISTÊNCIA
SUBDOSAGENS
BACTERIANA

TRANSFERÊNCI
ECOSSISTEMAS
ADE
SAÚDE HUMANA
RESISTÊNCIA
Holmström et al., 2003; Lalumera et al., 2004; Xuan Le et al., 2005; Christensen
et al., 2006; Lyle-fritch et al., 2006


 Observou-se que o número de Vibrio spp no
hepatopâncreas foi, em média, superior ao verificado
na água;

 Não foi verificada diferença estatística entre os
tratamentos em relação aos resultados
bacteriológicos, assim como também não foi possível
estabelecer relação entre estes e os níveis de OTC na
carapaça e no músculo;

 O tempo de depleção da OTC na carapaça (13 dias)
foi maior que no músculo (5 dias);
Nogueira-Lima et al. (2006): 25 dias (4500 µg g-1)
Gómez-Jimenez et al. (2008): 10 dias (4500 µg g-1)


OTC x Interrupção
crescimento
exoesqueleto
(Bray et al., 2006)

Propriedade de
Importante lugar formar complexos
para distribuição c/ cátions
de OTC CARAPAÇA divalentes
(Uno, 2004) (Arias et al., 2007)

Formada 15 a 20%
de quitina, 25 a 40% de
proteína e 40 a 55% de
sais carbonato cálcio
(Martur e Narang,
1990)


 Os níveis de OTC na carapaça podem diminuir em até
20% quando aplicou-se processos com elevadas
temperaturas;

 Quando o mesmo processo é aplicado em músculo,
observou-se uma diminuiç4ao de até 80% (uno et al.,
2006);

 Necessidade de avaliar o camarão inteiro e não
somente o músculo, como recomendado pelo FDA e
pela CE, que estabeleceram LMR de 0,1 e 0,2 para
OTC em tecidos animais (EMEA, 1990; Codex, 2006).

Artigo científico – Conclusão

 Conclusão

Ficou demonstrado que o método definido e validado
atende ao uso pretendido, por apresentar um dos
mais baixos limites de detecção definidos para
métodos que empregam a CLAE-DAD; Os resultados
de coeficientes de correlação para OTC em solução
e no extrato da matriz fortificado, faixa de trabalho,
recuperação relativa e repetitividade foram
satisfatórios de acordo com as normas vigentes. O
acúmulo de resíduo de OTC, quando administrada
na ração, é maior na carapaça que no músculo
devido sobretudo à composição estrutural da
carapaça.

Artigo científico – Agradecimentos

 Agradecimentos

Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE)
Conselho Nacional de Desenvolvimento e Pesquisa
(CNPq)
Agência Financiadora de Estudos (FINEP)
Instituto de Tecnologia de Pernambuco (ITEP)

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