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- 1. 1. Introdução 1.1. Histórico 1.2. Importância dos processos fermentativos 1.3. Processo fermentativo genérico 2. Microorganismos industriais 2.1. Tipos de microorganismos 2.2. Metabolismo microbiano 2.3. Nutrição microbiana 2.4. Crescimento microbiano 3. Substratos de fermentação 3.1. Fontes de carbono 3.2. Fontes de nitrogênio 4. Fermentadores 4.1. Definição 4.2. Classificação 4.3. Desenho esquemático 5. Processos de fermentação 5.1. Fermentação descontínua ou batelada 5.2. Fermentação descontínua alimentada 5.3. Fermentação semi-contínua 5.4. Fermentação contínua 5.5. Comparação entre processos de fermentação submersa 5.6. Fermentação em meio sólido
- 2. 6. Cinética de processos fermentativos 7. Controle de processos fermentativos 8. Recuperação dos produtos de fermentação 8.1. Floculação → flotação e sedimentação 8.2. Centrifugação 8.3. Filtração 8.4. Extração 8.5. Cristalização e precipitação 8.6. Dessecação 8.7. Destilação 8.8. Cromatografia 8.9. Desintegração dos microorganismos 9. Higiene, limpeza e sanitização de equipamentos 9.1. Produtos usados na limpeza e sanitização de equipamentos 9.2. Operações de limpeza e sanitização 10. Principais processos fermentativos 10.1. Fermentação alcoólica 10.2. Biossíntese acética 10.3. Fermentação láctica
- 3. 1. INTRODUÇÃO 1.1. Histórico • Relação microorganismos x homem → evolução de ambos • Microorganismos → decomposição de alimentos • Microorganismos → fermentação de alimentos e bebidas • Vinho e vinagre → 10.000 AC • Cerveja → 5.000 – 6.000 AC → Egito • Pão → 4.000 – 7.000 AC → Egito • Queijo e leite fermentado → 5.000 AC • Soja fermentada → 3.000 AC → China
- 4. 1.2. Importância dos processos fermentativos Na indústria de alimentos Produto Microorganismo Queijo Bactérias e fungos Iogurtes Bactérias lácticas Manteiga Bactérias lácticas Bebidas alcoólicas ocidentais Leveduras alcoólicas Bebidas alcoólicas orientais Fungos e leveduras Produtos de panificação Levedura alcoólica Picles, azeitonas, chucrute Bactérias lácteas Carnes fermentadas Bactérias lácticas Vinagre Bactérias acéticas Café Bactérias lácteas, etc. Cacau Leveduras e bactérias Chá Soja fermentada Enzimas oxidases Fungos, leveduras e bactérias Leveduras comestíveis Leveduras Gorduras Leveduras Desenvolvimento de sabor Fungos Aromas Fungos Proteínas unicelulares (SCP) Ensilagem Fungos, leveduras e bactérias Bactérias lácteas
- 5. Na indústria química, farmacêutica e na agricultura 1. Etanol → carburante, farmacêutico, químico, doméstico 2. Ácidos orgânicos → cítrico, láctico, acético, giberélico, etc. 3. Solventes → acetona, butanol, isopropanol 4. Aminoácidos → glutâmico, lisina, triptofano 5. Nucleotídeos, nucleosídeos e compostos afins 6. Enzimas → amilases, proteases, lipases, pectinases, lactase, glicose isomerase, renina, etc. 7. Vitaminas → ácido ascórbico, riboflavina, ergosterol, β caroteno, B12 8. Antibióticos → penicilinas, estreptomicina, tetraciclinas, etc. 9. Vacinas → Neisseria, Mycobacterium, Corynebacterium, etc. 10. Alcalóides 11. Gomas → dextrânio 12. Transformações moleculares → esteróides, antibióticos e pesticidas 13. Tratamentos de resíduos agroindústriais, lixo e esgoto 14. Lixiviação 15. Fixadores de nitrogênio do ar em raízes → Rhizobium 16. Controle biológico de pragas → Bacillus
- 6. 1.3. Processo fermentativo genérico MATÉRIAS PRIMAS PREPARO DO MEIO DE FERMENTAÇÃO MICROORGANISMOS FERMENTAÇÃO SUBPRODUTOS TRATAMENTOS FINAIS RESÍDUOS PRODUTO TRATAMENTO DE RESÍDUOS
- 7. 2. MICROORGANISMOS INDUSTRIAIS 2.1. Tipos de microorganismos • Bactérias → procariotos, quimioorganotrofos • Fungos → eucariotos, quimioorganotrofos • Bolores • Leveduras Eucariotos x Procariotos Características Procariotos Eucariotos 1. Organelas - + 2. Núcleo - + 3. Nº moléculas DNA 1 >1 4. DNA em organelas - + 5. DNA → cromossomo - +
- 8. 2.2. Metabolismo microbiano Sol O2 Produtos orgânicos Seres autotróficos fotossintetizantes Seres heterotróficos CO2 H20 Aspectos macroscópicos do metabolismo dentro do inter- relacionamento global dos organismos vivos na biosfera. Fonte: Lehninger, 1988.
- 9. 2.2. Metabolismo microbiano Nutrientes liberadores de energia Macromoléculas Carboidratos Gorduras Proteinas Catabolismo Energia química ATP NADPH Anabolismo celulares Proteínas Polissacarídeos Lipídios Ácidos nucléicos Produtos finais pobres em energia Moléculas precursoras CO2 H2O NH3 Aminoácidos Açúcares Ácidos graxos Bases nitrogenadas Metabolismo = Catabolismo + Anabolismo Fonte: Lehninger, 1988.
- 10. 2.2. Metabolismo microbiano GLICOSE Glicólise 2 PIRUVATO -- O2 -- O2 2 ETANOL + 2 CO2 2 LACTATO Fermentação Alcoólica Fermentação Láctea O2 2 CO2 2 ACETIL CoA Ciclo de Krebs e Cadeia respiratória 4 CO2 + 4 H2O Fonte: Lenninger, 1988.
- 11. FERMENTAÇÃO Mecanismo anaeróbio de produção de energia que não envolve cadeia respiratória ou citocromos.
- 12. 2.3. Nutrição microbiana Fonte de energia dos organismos fermentadores Quimiorganotróficos → obtém energia de reações químicas Fonte de carbono → energia x esqueleto carbônico Carboidratos → açúcares e polissacarídeos Aminoácidos, protídeos e proteínas Ácidos monocarboxílicos Lipídios Álcoois Fonte de nitrogênio → síntese material plástico Orgânico → Aminoácidos, protídeos, proteína Inorgânico → sais de amônio, (nitratos e nitritos)
- 13. 2.3. Nutrição microbiana Sais minerais Macronutrientes P → ATP e ácidos nucleicos S → aminoácidos / proteínas K → ativador enzimático, regulador da pressão osmótica Mg → cofator enzimático Ca → cofator enzimático Micronutrientes → Cu, Co, Zn, Mn, Na, Bo, etc. Fatores de crescimento Vitaminas Aminoácidos Nucleotídeos Ácidos graxos
- 14. 2.3. Nutrição microbiana Água Não é considerada nutriente Solvente universal → nutrição celular e reações enzimáticas Regulação da pressão osmótica Regulação térmica → alto calor específico Oxigênio atmosférico Não é considerado nutriente Receptor de elétrons na respiração Aeróbios Microaerófilos Anaeróbios Facultativos
- 15. 2.4. Crescimento microbiano Reprodução Bactérias → fissão binária (sexuada ou assexuada) Leveduras → brotamento ou gemulação (assexuada) fissão binária (assexuada) esporulação (sexuada) Fungos → esporulação (sexuada ou assexuada) Modelo matemático da reprodução População inicial = uma célula População inicial = B células b = 1 . 2n → → b = B . 2n Número de gerações após o crescimento Tempo de geração = t / n → → n = 3,3 . log b / B t / 3,3 . log b / B Curva de crescimento 3 Log N 2 1. Lag 2. Log 4 3. Estacionária 1 4. Declínio Tempo
- 16. 3 SUBSTRATOS DE FERMENTAÇÃO 3.1. Fontes de carbono 3.1.1. Carboidratos Cana de açúcar, sorgo sacarino, etc. Frutas → uva, laranja, jabuticaba, etc. Malte → cevada, trigo, milho, etc. Melaço → subproduto da fabricação do açúcar Licor sulfítico → subproduto da fabricação do papel Lígno-celulósicos → palha, bagaço cana, resíduos madeira Carboidratos puros → açúcares e amidos → preços elevados 3.1.2. Óleos vegetais → soja, algodão, palma → co-substratos 3.1.3. Álcoois → etanol, metanol 3.1.4. Alcanos → C12 – C14 3.2. Fontes de nitrogênio 3.2.1. Inorgânico → amônia e sais de amônio 3.2.2. Orgânica Líquido de maceração de milho → subproduto → amido Farinha de soja → subproduto da fabricação de óleo Extrato de levedura → preço elevado Peptonas → preço elevado Uréia → adubo
- 17. 4. FERMENTADORES 4.1. Definição Recipiente onde ocorre a fermentação 4.2. Classificação 4.1.1. Quanto à natureza do meio de fermentação De fermentação submersa → meio líquido De fermentação superficial → meio sólido 4.1.2. Quanto à forma espacial Cilíndrico → meio líquido e sólido Paralelepípedo → meio líquido e sólido 4.1.3. Quanto ao fechamento Aberto Fechado 4.1.3. Quanto ao material de construção Madeira Alvenaria Aço carbono Aço inoxidável Aço carbono revestido → aço inox, borracha, esmalte, plástico, resinas Plásticos e resinas
- 18. 4.3. Desenho esquemático de fermentador de cultivo submerso
- 19. 4.3. Desenho esquemático de fermentadores de cultivo superficial
- 20. 5. PROCESSOS DE FERMENTAÇÃO 5.1. Fermentação descontínua ou batelada
- 21. C P P = Produto X X = Célula S = Substrato S Tempo 5.2. Fermentação descontínua alimentada
- 22. C X X = Célula P P = Produto S = Substrato S Tempo 5.3. Fermentação semi-contínua
- 23. C X X = Célula P = Produto P S = Substrato S Tempo 5.4. Fermentação contínua
- 24. C X S X = Célula T P P = Produto S = Substrato T = Tempo geração D=F/V D 5.5. Fermentação em meio sólido Microorganismos utilizados Bactérias → crescem em substratos com elevada atividade de água Bacillus thuringiensis → bioinseticidas Zymomonas mobilis → etanol Acetobacter aceti → vinagre pelo processo alemão Levedura → crescem em substratos com atividade de água moderada Saccharomyces cerevisiae → etanol
- 25. Bolores → crescem em substratos com baixa atividade de água Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, etc. → enzimas, SCP Mucor e Rhizopus → renina Penicillium → antibióticos Fusarium e Giberella → ácido giberélico 5.6. Fermentação em meio sólido Meios Meio sólido → fonte de nutriente → farelos, grãos, farinhas Meio sólido → inerte → sabugo de milho, bagaço de cana → fonte de nutriente → meio de cultura líquido Características importantes do meio sólido Porosidade → fluxos de massa e energia → O2 / CO2 / calor
- 26. Tamanho da partícula → superfície específica → produtividade circulação de ar e dissipação de gases e calor Formato da partícula → superfície específica, porosidade Altura da camada do meio produção e remoção de calor aeração e remoção de CO2 e outros gases compactação do meio → porosidade 5.6. Fermentação em meio sólido Controle do processo • Umidade película de água sobre a superfície da partícula → difusão nutri. teor mínimo → 12% → FMS → 15 – 85% interfere no crescimento do microrganismo de processo interfere no crescimento de bactérias contaminantes • Atividade de água (Aw)
- 27. água não ligada ao substrato e disponível ao microorganismo fungos → Aw ≥ 0,7 leveduras → Aw ≥ 0,8 Aw = Psubstrato *100 Págua bactérias → Aw ≥ 0,9 • Temperatura microorganismos → psicrófilos, mesófilos, termófilos remoção de calor produzido na fermentação injeção ar frio no meio de cultivo reator encamisado controle da temperatura da sala de fermentação 5.6. Fermentação em meio sólido Controle do processo • pH difícil controle devido à natureza do meio de cultivo meios → boa capacidade tamponante uso de solução tampão → umidificação do substrato • Agitação → velocidade e freqüência homogeneização → inóculo, umidade, ar, temperatura substrato
- 28. fragmentação do micélio → crescimento e formação de esporo • Aeração microorganismos → anaeróbios, aeróbios, facultativos ar → fluxo de massa (O2 / CO2) e energia fluxo de ar → espessura da camada de substrato • Estimativa de crescimento medida direta → muito difícil → interação micélio / meio medida indireta → proteína, ATP, CO2, O2 • Nutrientes • Características do substrato 6. CONTROLE DE PROCESSOS FERMENTATIVOS 6.1. Monitoramento de parâmetros físicos, químicos e biológicos 6.1.1. Parâmetros físicos Tempo Temperatura Atividade de água Pressão Vazão de líquidos Vazão de gases
- 29. Velocidade de agitação 6.1.2. Parâmetros químicos pH e acidez Sólidos solúveis (°Brix) O2 dissolvido O2 na fase gasosa CO2 na fase gasosa 6.1.3. Parâmetros biológicos Medidas de crescimento → biomassa Medida de contaminação 6.2. Controle de processos fermentativos ATUADOR CONTROLADOR FERMENTADOR
- 30. SENSOR 7. RECUPERAÇÃO DOS PRODUTOS DE FERMENTAÇÃO Recuperação → separação, purificação e concentração 7.1. Localização dos produtos de fermentação 1. Intracelular → ácidos nucleicos, vitaminas, enzimas, antibióticos; 2. Extracelular → AA, ácidos orgânicos, álcoois, enzimas, antibióticos;
- 31. 3. Intra e extracelular → antibióticos e vitaminas 7.2. Operaçõres unitárias usadas na recuperação de produtos 7.2.1. Floculação → flotação e sedimentação 7.2.2. Filtração profunda ou convencional → separação de micélios de fungos e de actinomicetos; 7.2.3. Filtração absoluta em membrana ou tangencial Microfiltração → 0,1 - 10 µm → bactérias e leveduras Ultrafiltração → 0,001 - 0,1 µm → PM > 1000 → macromolécula Osmose reversa → 0,0001 – 0,001 µm → PM < 1000 → solutos
- 32. 7.2.4. Centrifugação Sistema líquido / sólido → separação de células Sistema líquido / líquido → separação de solvente 7.2.5. Extração → solventes → alguns antibióticos 7.2.6. Destilação → ponto de ebulição → etanol 7.2.7. Cristalização 7.2.8. Desidratação Uso do calor → produto sem vida → levedura seca Liofilização → produto vivo → inóculos 8. HIGIENE, LIMPEZA E SANITIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS Higiene → preservação da saúde e prevenção das doenças → Limpeza → remoção de sujidades Sanitização → manutenção das condições de higiene Contaminações da fermentação • desvio de uso do substrato → queda de rendimento fermentativo • produção de substâncias indesejáveis → queda de produtividade
- 33. • modificação das condições de fermentação • decomposição do produto de fermentação 8.1. Produtos usados na limpeza e sanitização de equipamentos Água Ação mecânica → “varre” a superfície do equipamento → remoção partículas em suspensão ou solução Ação química → solubiliza detergentes e sanitizadores 8.1. Produtos usados na limpeza e sanitização de equipamentos Detergentes função → facilitar a remoção de sujidades molhagem → redução da tensão superficial da água penetração → em poros, orifícios e fissuras da sujidade saponificação de gordura → formação de sabão emulsificação de gordura → formação de colóides solúveis peptização de proteínas → formação de colóides solúveis
- 34. destruição de microorganismos Tipos de detergentes Alcalinos → removem proteínas → boa capacidade emulsificante soda cáustica →NaOH soda → Na2CO3 borax → tetraborato de sódio 8.1. Produtos usados na limpeza e sanitização de equipamentos Tipos de detergentes Ácidos minerais → remoção de crostas endurecidas (pedras) corrosivos e perigosos ácido clorídrico → HCl ácido nítrico → HNO3 ácido fosfórico → H3PO4 Ácidos orgânicos → menos corrosivos e perigosos
- 35. ácido acético ácido cítrico ácido lático Detergentes surfactantes → removem gorduras produtos umectantes e de penetração aniônicos → sulfonatos catiônicos → amônio quaternário não iônicos 8.1. Produtos usados na limpeza e sanitização de equipamentos Sanitizantes Antissépticos → previne / interrompe crescimento microbiano Bactericida → elimina bactérias Bacteriostático → inibe crescimento de bactérias Fungicida → elimina fungos Fungistático → inibe crescimento de fungos
- 36. Desinfetante → elimina germes sobre superfícies Germicida → elimina flora banal e patogênica Cloro → Bactericida de largo espectro → Efetivo contra esporos, fungos e bacteriófagos Iodo → Bactericida Amônio quaternário → Bactericida Compostos fenólicos → Fungicida Agentes ácidos → ácido propiônico, sórbico, benzóico e SO2 Atuação sobre fungos, leveduras e bactérias 8.2. Operações de limpeza e sanitização Pré-lavagem Produto → água (fria, morna, quente) ou vapor Função → dissolver resíduo de superfície Técnica → imersão → água → pressão → jato d’água ou vapor (CIP) Aplicação do detergente
- 37. Produto → água e detergente Função → remoção de sujidades Técnica → CIP Aplicação do sanitizante Produto → água e sanitizante Função → eliminação microorganismos → superfície equipa/. Técnica → CIP Rinçagem ou lavagem final Produto → água Função → remover resíduos de detergente ou sanitizante Tecnica → CIP 9. Principais processos fermentativos 9.1. Fermentação alcoólica 9.1.1. Microbiologia • Leveduras → Saccharomyces → S. cerevisiae • Bactérias → Zymomonas → Z. mobilis 9.1.2. Bioquímica
- 38. C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO2 + 2 ATP + calor 180 g 2 * 46 = 92 g RT = 51,11% C6H12O6 + 6 O2 → 6 CO2 + 6 H2O + 38 ATP + calor 9.1.3. Matérias primas • Fonte de carboidratos → açúcar, amido, celulose, inulina, etc. 9.1.4. Principais produtos • Bebidas alcoólicas → fermentadas, destiladas, retificadas, mist. • Etanol carburante → álcool anidro e álcool hidratado 9.2. Fermentação láctica 9.2.1. Microbiologia • Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus 9.2.2. Bioquímica C6H12O6 → 2 CH3CHOHCOOH + 2 ATP 180 2 * 90 = 180 RT = 100%
- 39. 9.2.3. Matérias primas • Origem animal → leite → lactose • Origem vegetal → hortaliças → glicose, frutose, sacarose, etc. 9.2.4. Principais produtos • Origem animal → leites fermentados (iogurtes), queijos, etc. • Origem vegetal → chucrute, picles, azeitona 9.3. Biossíntese acética 9.3.1. Microbiologia • Acetobacter → matérias primas alcoólicas • Saccharomyces e Acetobacter → matérias primas açucaradas 9.3.2. Bioquímica C2H5OH + O2 → C2H3OOH + H2O
- 40. 46 60 RT = 130% 9.3.3. Matérias primas • Alcoólicas → vinho de uva e de outras frutas, álcool, etc. • Açucaradas → mosto de uva, de frutas, de cana, etc. 9.3.4. Principais produtos • Vinagre • Ácido acético
- 41. Perguntas para o estudo orientado I - INTRODUÇÃO 1. Desde há quanto tempo o homem conhece os processos fermentativos? 2. Na sua opinião, os microorganismos são benéficos ou maléficos à humanidade? Justifique. 3. Na sua opinião, quais são os principais processos fermentativos? Justifique. 4. Descreva um processo fermentativo genérico através de fluxograma de blocos. I - MICROORGANISMOS INDUSTRIAIS 5. Quais os principais grupos de microorganismos industriais que você conhece? 6. Descreva as principais características celulares de cada grupo. II - METABOLISMO MICROBIANO 7. Defina metabolismo, catabolismo e anabolismo. 8. Defina fermentação. 9. Faça um mapa metabólico único e sintético da glicólise, fermentação alcoólica, fermentação láctica e respiração. III - NUTRIÇÃO MICROBIANA 10. Quais são as principais fontes de carbono e nitrogênio para os microorganismos fermentativos? Cite as funções metabólicas das fontes de C e N. 11. Explique as principais funções metabólicas da água, oxigênio, minerais e vitaminas nos microorganismos fermentativos. III - CRESCIMENTO MICROBIANO 12. De que forma as bactérias se reproduzem? 13. Idem para as leveduras. 14. Idem para os bolores 15. Qual a fórmula matemática que expressa o crescimento microbiano? 16. Num gráfico, faça a curva de crescimento de um microorganismo genérico. Explique. IV - MEIOS DE FERMENTAÇÃO 17. Quais são as principais matérias primas usadas no preparo dos meios de fermentação? 18. Quais devem ser os atributos dessas matérias primas? IV – FERMENTADOR (EQUIPAMENTO) 19. Defina fermentador. 20. Quais as formas e os tamanhos dos fermentadores? 21. De que materiais são construídos os fermentadores? 22. Faça um desenho esquemático de um fermentador de meio líquido. 23. Idem para meio sólido. V - PROCESSOS DE FERMENTAÇÃO 24. Defina processo de fermentação descontínuo. Faça um desenho esquemático e um gráfico cinético deste processo.
- 42. 25. Idem para descontínuo alimentado. 26. Idem para semi-contínuo. 27. Idem para contínuo. 28. Comparar um processo contínuo com outro descontínuo. VI - CONTROLE DOS PROCESSOS FERMENTATIVOS 29. Quais os principais parâmetros físicos, químicos e biológicos que devem ser controlados nos processos fermentativos? Explique sucintamente a importância de cada um deles. VI - RECUPERAÇÃO DOS PRODUTOS DE FERMENTAÇÃO 30. Cite os principais produtos de fermentação que você conhece. 31. Cite as principais operações unitárias usadas na recuperação dos produtos de fermentação. Explique o princípio de funcionamento de cada uma. VII - HIGIENE, LIMPEZA E SANITIZAÇÃO DOS EQUIPAMENTOS DE FERMENTAÇÃO 32. Defina higiene. 33. Defina limpeza. 34. Defina sanitização. 35. Cite os principais produtos de limpeza usados nos processos fermentativos. 36. Idem para os produtos sanitizantes. 37. Quais as fases de um processo de limpeza e sanitização de equipamentos de fermentação. VIII - PRINCIPAIS PROCESSOS FERMENTATIVOS 38. Faça um mapa metabólico sintético da fermentação alcoólica, mostrando os pontos de consumo e produção de ATP. Calcule o seu rendimento teórico. 39. Idem para fermentação láctica. 40. Idem para a fermentação acética.