2. 2. PRODUZIONE DEL DNA RICOMBINANTE E INGEGNERIA GENETICA
A. Il fenomeno restrizione: cenni sul ciclo litico del batteriofago lambda.
B. Gli enzimi di restrizione: nomenclatura, purificazione, saggio di
funzionalit siti di riconoscimento (sequenze palindromiche), enzimi che
,
tagliano il DNA generando estremitt "coesive"(EcoRI, BamHI); enzimi che
tagliano il DNA generando estremitt "piatte"(HaeIII); efficienza della
reazione tra enzima di restrizione e DNA: concentrazione salina, qualitt del
DNA substrato, temperatura, mappe di restrizione; digestione completa e
digestione parziale del DNA.
C. Riassociazione intramolecolare e intermolecolare; la DNA ligasi;
clonaggio utilizzando DNA con estremit coesive; clonaggio utilizzando code
omopolimeriche: meccanismo d'azione della trasferasi terminale, uso della
lambda-esonucleasi, ricostituzione del sito PstI; clonaggio utilizzando
molecole linker.
D. Vettori del DNA ricombinante: plasmidi, siti singoli per enzimi di
restrizione, trasformazione del batterio e inattivazione inserzionale,
selezione dei plasmidi ricombinanti con antibiotici, pBR322; vettori del DNA
ricombinante: il DNA del batteriofago lambda: i geni del batteriofago
lambda, regioni indispensabili per il ciclo litico e il ciclo lisogenico, vettori a
rimpiazzo (lambda gtWES) e vettori ad inserzione (Charon).
E. Produzione di genoteche e cDNA teche.
F. Screening di genoteche o cDNA teche: ibridazione con sonde specifiche
di DNA, HART (hybrid arrested translation), selezione positiva di mRNA e
traduzione in vitro, utilizzo di anticorpi monoclonali, utilizzo di
oligonucleotidi a doppia elica per identificare sequenze codificanti per fattori
di trascrizione, utilizzo della sequenza aminoacidica codificata dal gene da
identificare.
G. Sequenziamento del DNA ricombinante clonato: M13, sequenziamento
secondo Sanger, sequenziamento progressivo.
3. Struttura del DNA
• Doppia elica formata da due filamenti di ac. nucleico uniti da ponti ad idrogeno
• Acido nucleico: catena di nucleotidi
• Nucleotide: nucleoside + ac. fosforico
• Nucleoside: desossiribosio + base azotata
• Basi azotate: adenina, citosina, guanina e timina
Sequenziamento:
individuazione della
successione delle basi azotate
nel filamento di acido nucleico
5. Struttura del DNA
La sequenza del DNA contiene tutte le informazioni genetiche
ereditarie che sono la base per lo sviluppo di tutti gli organismi
viventi.
All’interno di questa sequenza sono codificati i geni, nonché le
istruzioni per esprimerli nel tempo e nello spazio
Determinarne l’esatta sequenza è dunque utile nella ricerca del
perché e del come gli organismi vivono
Sequenziamento genico
6. Date storiche della
sequenza del DNA
1869 Miescher osserva
Avery propone il DNA per la prima volta il DNA
come materiale genetico 1944
Watson e Crick determinano la
1953 struttura della doppia elica
Holley sequenza il tRNA
di lievito 1965 Vengono sviluppate le tecniche
per la sintesi degli oligonucleotidi e per
1970 la degradazione chimica del DNA. Viene
METODO SANGER introdotta l’elettroforesi su gel per la
(terminazione di catena) 1977 Separazione di frammenti di DNA
METODO MAXAM-GILBERT
(degradazione chimica)
1980 Il DNA genomico viene clonato nel fago
M13 o in vettori plasmidici, nascono i
primi programmi informatici di analisi
KARY MULLIS 1986 dei dati, vengono sviluppate nuove
Introduce la PCR tecnologie per il sequenziamento
1989
AUTOMAZIONE PARZIALE
Vengono sviluppate le prime apparecchiature
per il sequenziamento che impiegano sistemi
Automazione completa per la rilevazione della fluorescenza.
Sequenziamento completo
del genoma umano 2000
7. Tecniche di sequenziamento del DNA
-Metodo di Maxam e Gilbert
(della degradazione chimica del DNA)
-Metodo di Sanger
(a terminazione di catena)
-Pyrosequencing
(sequenziamento ad elevato parallelismo)
8. Il metodo Sanger
(o metodo a terminazione di catena)
Il sequenziamento secondo il metodo di Sanger, nella variante chiamata “a ciclo termico”,
consisteva nella sintesi di nuovi filamenti di DNA, complementari al DNA stampo
• La sintesi del DNA si eseguiva in 4 provette diverse e ciascuna richiedeva :
-
-Una piccola quantità di DNA stampo a doppio filamento;
-Un innesco specifico (un solo primer) complementare al filamento da sequenziare;
-L’enzima Taq DNA polimerasi
-Una miscela dei 4 dNTP di cui uno marcato (con 35S o 32P) per la visualizzazione finale
dei filamenti di nuova sintesi dopo elettroforesi
- 1 terminatore di catena: ddNTP , diverso per ciascuna delle 4 reazioni
9. ddNTPs :dideossinucleotidetifosfato
Nucleotide, detto terminatore, che blocca l’allungamento del
filamento di acido nucleico poiché la mancanza del gruppo ossidrilico
in 3’ impedisce l’attacco all’acido fosforico del nucleotide successivo
ddNTP
dNTP
10. principio del sequenziamento
(Sanger, metodo manuale, a ciclo termico)
I nuovi frammenti di DNA prodotti, chiamati anche “frammenti di Sanger”,
sono prodotti mediante amplificazione lineare di una piccola quantità di
DNA stampo, utilizzando i cicli termici della PCR
• La reazione incomincia con la
denaturazione del DNA stampo
• l’annealing del primer
• La Taq polimerasi incomincia la sintesi del
filamento complementare
• Se viene inserito uno dei 4 dNTPs
l’allungamento prosegue
• Se invece viene inserito il ddNTP
terminatore l’allungamento si blocca
11. principio del sequenziamento
(Sanger, metodo manuale, a ciclo termico)
In ciascuna delle 4 provette contenente
nucleotidi terminatori con una diversa base
azotata si formano soltanto filamenti che
terminano con tale base. Tali filamenti avranno
tutte le lunghezze possibili a seconda che il
nucleotide terminatore si sia legato alla 1°, 2°, . . ,
ennesima, posizione possibile.
Al termine della reazione, ogni miscela
contiene una popolazione di filamenti di
nuova sintesi, che hanno in comune l’estremità 5’
ma che differiscono in
lunghezza perché la loro sintesi è stata
bloccata in diverse posizioni al 3’.
I filamenti marcati sono separati mediante
elettroforesi su gel di poliacrilammide-urea
ad elevato voltaggio.
12. principio del sequenziamento
(Sanger, metodo manuale, a ciclo termico)
Si esegue una elettroforesi disponendo i prodotti di amplificazione delle 4 provette in
4 corsie parallele così che in ognuna di esse siano presenti filamenti che terminano
con una diversa base.
Si usa un gel ad altissima risoluzione, capace di separare frammenti di DNA che
differiscono fra loro per un solo nucleotide. Il gel (0,3-0,4 mm di spessore) è
interposto fra due lastre di vetro di notevole lunghezza (40 cm circa ).
13. principio del sequenziamento
(Sanger, metodo manuale, a ciclo termico)
La migrazione è inversamente proporzionale alla lunghezza del filamento
La posizione della banda indica la posizione occupata all’interno della sequenza,
mentre il tipo di base è indicato dalla corsia in cui tale banda si trova
A
T
A
C
A
G
C
T
G
T
T
SEQUENZA OTTENUTA : A TA C A G C T G T T . . . . . .
14. Evoluzione del sequenziamento Sanger:
metodo automatizzato, con marcatori fluorescenti
I nucleotidi terminator i (ddNTPs) sono marcati con un fluorocromo.
Si usa un fluorocromo diverso per ciascuno dei quattro tipi di terminatori
Coniugando a ciascun ddNTP un diverso marcatore fluorescente, è
possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico
tubo da saggio e caricare il tutto in un solo pozzetto di gel
15. Nucleotidi terminatori (ddNTPs) marcati con un fluorocromo
ddATP ddGTP
ddCTP ddTTP
I nucleotidi terminatori (ddNTPs) sono marcati con un fluorocromo.
Si usa un fluorocromo diverso per ciascuno dei quattro tipi di
terminatori
18. Metodo automatizzato, con marcatori fluorescenti:
Il sequenziatore automatico
LO STRUMENTO
Composto da un unità in grado di
alloggiare il gel e far avvenire
l’elettroforesi in campo elettrico, e
l’acquisizione dei dati di
fluorescenza, connesso ad un
computer contenente il software
L’APPARATO PER IL GEL
Apparati verticali di lunghezza
variabile a seconda del numero di
basi da leggere (22 cm-1 m)
IL GEL
“slab” gel di poliacrilammide (dal
4% al 6%) molto sottili in condizioni
denaturanti (Urea)
19. Metodo automatizzato, con marcatori fluorescenti:
Il sequenziatore automatico
L’intensità e la lunghezza d’onda delle emissioni fluorescenti vengono
captate durante l’elettroforesi quando i frammenti del DNA, eccitati
dalla luce laser, passano davanti ad un rilevatore
20. L’elettroferogramma
Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le
informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore
diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.
21. L’elettroferogramma
Normalmente il sistema interpreta automaticamente l’elettroferogramma.
Quando l’interpretazione non è ovvia, il sistema inserisce una N al posto
della base azotata mancante, questa può essere corretta manualmente,
dopo aver letto ad occhio l’elettroferogramma, o in base alla sequenza
del filamento reverse
22. Sequenziamento automatico
Sequenziatore a elettroforesi capillare
La separazione elettroforetica dei frammenti
fluorescenti avviene in un capillare del
diametro di 50 µm, contenente un polimero
di corsa.
Il sistema carica automaticamente il capillare
prelevando direttamente da una provetta o
da una micropiastra i campioni ottenuti dalla
PCR di sequenziamento,
I frammenti marcati di DNA vengono rilevati
man mano che correndo lungo il capillare,
raggiungono la “detection window”.
1-4-16-96 capillari
23. Sequenziamento automatico
Sequenziatore a capillare
• Durante l’attraversamento del
capillare i vari frammenti di DNA
vengono colpiti da un raggio laser
• Il raggio laser eccita i vari
fluorocromi che marcano i singoli
frammenti
• Ciascuno dei quattro fluorocromi
emette una diversa lunghezza d’onda
• Una cellula fotoelettrica rileva
sequenza, tipo ed intensità delle varie
emissioni luminose ed il tutto viene
registrato in forma grafica
• La sequenza dei picchi corrisponde
alla sequenza dei nucleotidi; il tipo
(colore del picco) corrisponde al tipo
di base azotata.
24. A cosa serve quindi il sequenziamento:
La comprensione dell’esatta sequenza del genoma degli organismi viventi è
importante per:
In biologia: per capire il perché e come gli organismi viventi si sono evoluti
(es: filogenesi)
Per comprendere meglio i meccanismi che sono alla base della vita e della
sopravvivenza
In medicina: per diagnosticare malattie ereditarie e sviluppare nuovi
trattamenti (es: mutazioni nucleotidiche)
La conoscenza del genoma degli agenti patogeni può portare allo sviluppo di
medicine contro malattie contagiose (es: antibiogramma)
La determinazione di sequenze del DNA è utile anche nelle scienze forensi ed
in quelle alimentari
26. Il progetto “Genoma Umano”
HGP: Human Genome Project
Il Progetto Genoma Umano è stato un progetto di ricerca
scientifica internazionale il cui obiettivo principale era quello di
determinare la sequenza delle coppie di basi azotate che
formano il DNA e di identificare e mappare i circa 30 mila geni
del genoma umano dal punto di vista sia fisico che funzionale.
Il progetto, originariamente della durata di 15 anni, ha avuto
inizio nel 1990 presso i National Institutes of Health degli Stati
Uniti. La prima bozza del genoma è stata rilasciata nel 2000
mentre quella completa si è avuta nel 2003, quindi con 2 anni di
anticipo dalla fine del progetto, e ulteriori analisi sono ancora in
corso di pubblicazione (in realtà una piccola % del genoma non è
ancora stata sequenziata).
27. Il progetto “Genoma Umano”
HGP: Human Genome Project
Il "genoma" di qualsiasi individuo (tranne quello dei gemelli
monozigoti e degli organismi clonati) è unico; mappare quindi il
"genoma umano" significa fare il sequenziamento delle variazioni
multiple di ciascun gene.
Per portare a termine la ricerca si è lavorato sul DNA offerto da un
certo numero di donatori selezionati con criteri di
rappresentatività statistica.
28. Il progetto “Genoma Umano”
HGP: Human Genome Project
COME E’ STATO EFFETTUATO
Le sequenze dei cromosomi interi vengono ricostruite a partire
dalle sequenze di centinaia di migliaia di frammenti di DNA,
normalmente di lunghezza compresa fra 500 e 800 pb
Si usano 2 strategie generali per la frammentazione e la
ricostruzione:
Il sequenziamento gerarchico
Il sequenziamento a rosa di pallini (shotgun)
Le due strategie sono reciprocamente complementari
29. Differenze:
Nel sequenziamento gerarchico il prmo passaggio è quello di costruire un
sentiero principale (tiling path) che serva ad assicurarsi che la sequenza sia
ottenuta in grandi pezzi ordinati tra di loro Mentre nel metodo shotgun
frammenta semplicemente il genoma in piccole unità sequenziabili e si affida
ad algoritmi del computer per ricostruire l’ordine dei frammenti
30.
31. Il progetto “Genoma Umano”
HGP: Human Genome Project
ALCUNE SCOPERTE DEL PROGETTO GENOMA
3.Nell’uomo, sequenziare l’intero genoma ha voluto dire esattamente identificare ed
ordinare ciascuna delle 3 * 109 (3 miliardi) paia di basi di cui è costituito
5.Gli esseri umani hanno circa 30.000 geni, più o meno lo stesso numero di quelli dei
topi e il doppio di quelli di alcune specie di vermi. La comprensione dell'espressione
di questi geni potrà fornire degli indizi sulle cause di alcune malattie.
7.Tutte le razze umane sono uguali al 99,99%, quindi le differenze razziali sono
geneticamente insignificanti. Questo potrebbe significare una discendenza da
un'unica madre.
9.La maggior parte delle mutazioni genetiche avviene nel maschio della specie, il
quale è quindi da considerare un agente del cambiamento. I maschi hanno quindi
una responsabilità maggiore nella trasmissione delle anomalie genetiche.
11.La genomica ha portato a progressi nel campo dell'archeologia genetica e ha
migliorato la nostra comprensione di come ci siamo evoluti in quanto esseri umani e
di come ci siamo separati dai primati 25 milioni di anni fa.
32.
33. Il progetto “Genoma Umano”
HGP: Human Genome Project
Adesso che il genoma umano è stato sequenziato il prossimo
obiettivo, è quello di associare ad ogni sequenza genica una
funzione, considerando che buona parte del DNA non ha
probabilmente una funzione ma rappresenta solo un fossile
genetico. Questo lavoro richiederà molto tempo anche perché
alcuni geni possono dar luogo a più proteine diverse o ad una
proteina unica che però può avere una funzione diversa a seconda
del tessuto o dello stadio embrionale in cui viene espressa.
34. un sito dedicato al Progetto Genoma
Umano gestito dal NHGRI (The
The Human Genome Project http://www.nhgri.nih.gov
National Human Genome Research
Institute)
un sito in cui si possono trovare
GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov
sequenze di DNA e di proteine.
EMBL http://www.ebi.ac.uk un sito dove sono raccolte le
sequenze del genoma umano.
il pii importante database
GDB (genome database): http://www.gdb.org/
concernente la mappatura del
genoma.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/i
Elenco dei siti che dbEST
ndex.html
raccoglie le sequenze parziali
ottenute dai cDNA
contengono OMIM (on-line Mendelian
catalogo elettronico di Mendelian
accesso attraverso GDB Inheritance in Man di Victo
informazioni sul Inheritance in Man)
McKusick, un elenco delle malattie
umane ereditarie.
Progetto Genoma MGD (Mouse Genome Database) http://www.informatics.jax.org
Umano e sui database del genoma murino,
frammenti di DNA GŽnŽthon http://www.genethon.fr/ mappa genetica basata sui marcatori
con ripetizioni (CA)n
sequenziati. database contenente una mappa
CHLC (Co-operative Human Linkage genetica e dati riguardanti il
http://lpg.nci.nih.gov/CHCL/
Center) genotipo e i marcatori genetici,
contenente un programma per
lÕanalisi di linkage
http://www.cephb.fr/bio/ceph-
mappa fisica del genoma umano
CEPH genethon-map.html
basato sugli YAC.
http://www.celera.com/ il sito internet della societˆ privata
CELERA
americana diretta da Greg Venter
bibliografia sul progetto genoma
www.nature.com/genomics/0
umano
http://www-genome.wi.mit.edu/
Whitehead Institute mappa fisica del genoma umano
basata sugli YAC
35. GenBank
• Banca dati pubblica (in Internet) contenente circa 50
milioni di sequenze geniche delle più varie regioni di,
praticamente, tutti gli organismi viventi
• Chiunque può depositare (ovviamente non in maniera
anonima) sequenze in GenBank
• E’ possibile confrontare la propria sequenza con tutte
quelle presenti in GenBank
• Un motore di ricerca individua e restituisce le
sequenze presenti in GenBank che hanno il più
elevato grado di somiglianza con la sequenza in
esame
