1. Regulação e expressão gênica
bacteriana
Prof. Dra. Adriana Dantas
Genética de microorganismos
UERGS Bento Gonçalves

2. TRANSCRIÇÃO : EUCARIOTO X PROCARIOTO
EUCARIOTOS PROCARIOTOS

3. Enzimas responsáveis pela replicação
1 Rompem as pontes de hidrogênio às
custas da energia de hidrólise do ATP,
5
entre as bases.
2 Sintetiza o iniciador (primer):
1 + 2 = complexo de iniciação da
1 replicação (CIR).
2
3 Duas DNA polimerase (I e III)
acoplam-se ao CIR e iniciam o
alongamento da cadeia, uma na fita
contínua (leading) e outra na fita
descontínua (lagging).
DNA pol III - 30.000/min
DNA pol I –600/min.
3
4 Une a extremidade 5´fosfato de um
fragmento novo à extremidade 3´- OH
do próximo
5 Diminuem o grau de
4 superenrolamento do DNA no ponto
de origem da replicação

4. O RNA ou ARN
O Ácido Ribonucléico é um polinucleotídeo que difere do DNA
em três aspectos básicos:
 O açúcar é uma Ribose;
DNA
 É formado, geralmente, por
A-T
T-A uma fita simples que pode
G-C enrolar-se;
C-G
 Não existe a base pirimídica
Timina e no seu lugar se
encontra a base Uracila.
 Os pareamentos seguem a
RNA ordem A-U e G-C).
A-U
U-A
G-C
C-G

5. Tipos de RNA
 RNAm  O RNA mensageiro é formado no núcleo e
contém a “mensagem” - o código transcrito a partir do DNA -
para a síntese das proteínas. Cada conjunto de três
nucleotídeos no RNAm é chamado de CÓDON.
 RNAt  O RNA transportador está presente no citoplasma e
é responsável pelo transporte dos aminoácidos até os
ribossomos para a síntese protéica. No RNAt existe uma
seqüência de nucleotídeos correspondente ao códon
chamada de ANTI-CÓDON.
 RNAr  O RNA ribossômico ou ribossomal faz parte da
estrutura dos ribossomos e participa do processo de
tradução dos códons para construção das proteínas.

6. Regulação gênica
 As regulações metabólicas são catalisadas por enzimas;
 A transcrição e a tradução dirigem a síntese de proteínas,
muitas das quais servem como enzimas;
 Síntese de proteínas requer gasto energético;
 Regulação da síntese protéica é importante para a economia
energética celular;
 Produção de proteínas necessárias em momentos específicos

7. Genes
 Muitos genes, em torno de 60 a 80% não são
regulados, são constitutivos, ou seja seus produtos são
constantemente produzidos em velocidade fixa.
 Produção de outras enzimas é regulada, de modo que
estejam presentes somente quando necessário.
 Apenas 1% do DNA é transcrito em RNAm codificante
de proteínas e até 10% do DNA são transcritos em
RNA

8. Tipos de genes
 Os que já funcionaram em uma fase anterior e atualmente não
funcionam mais
 Os que estão em funcionamento em um determinado
momento
 Os que ainda irão funcionar mais tarde
 Os que funcionam sempre

9. Controle da expressão gênica
 Controle do que é expresso pode ocorrer em vários níveis:
 Transcrição
 Processamento
 Transporte do RNAm
 Tradução
 Pós-tradução
 Funcionamento enzimático

10. RNA polimerase
 Na maioria dos procariontes, uma única espécie de RNA
polimerase transcreve todos os tipos de RNA.
 RNA polimerase consiste em quatro tipos de subunidades:
 Beta: 150.000 dáltons (β); beta primo: 160.000 dáltons (β’);
 alfa: 40.000 dáltons (α); sigma: 70.000 dáltons (σ)

11. Estrutura do RNA polimerase
 O cerne da enzima contém dois polipeptídios α, um polipeptídio
β e β’.
 A adição da subunidade α permite a iniciação nos sítios
promotores, formando uma holoenzima
β’ α β’
α
+ σ
α β α σ β’
Fator sigma
Cerne da enzima Holoenzima

12. Subunidades da RNA polimerase de
E. coli
• Grande e complexa, a holoenzima RNA polimerase de E. coli possui 5 tipos de
subunidades.
•Seu centro catalítico se encontra no chamado cerne da enzima (a2bb’).
•E, além das funções descritas no quadro1, a RNA polimerase também interage
com proteínas ativadoras e repressoras que modulam a taxa de expressão gênica
nas células.

13. Transcrição do DNA
• Quando se escreve um seqüência de nucleotídios
correspondente a um gene
•A seqüência é sempre escrita no sentido 5'-> 3'

14. Estágios da transcrição
 Iniciação
Alongamento
 Término

15.  A enzima RNA-polimerase abre
a dupla hélice do DNA;
 Inicia-se a produção de uma
molécula de RNAm, no sentido
5’  3’
 Os nucleotídeos são ligados
respeitando a ordem A-U, G-C.
Fita de RNA
em Fita molde  Finaliza a transcrição quando
formação DNA
a RNA-polimerase se desliga
do DNA, a molécula de RNAm
primário está formada e segue
para o citoplasma onde será
traduzida.

16. Iniciação
 Regiões que indicam o inicio da transcrição
em procariontes são chamadas de
promotores
 Seqüenciais promotoras em 13 pontos
diferentes de inicio de transcrição no
genoma E. coli.

17. A Unidade de T ranscrição
 A transcrição de um segmento se inicia quando a RNA polimerase
reconhece e liga-se a seqüências específicas de nucleotídios em uma
região especial, no início do gene, denominada promotor
 Além destas seqüências, o promotor engloba o ponto de início:
Primeiro par de bases a ser transcrito em RNA
 A partir daí a RNA polimerase move-se ao longo do molde,
sintetizando RNA, até alcançar uma outra seqüência específica
que sinaliza o término da transcrição.
 Unidade de transcrição estende-se do ponto de início (+1) no
promotor, até o terminador

18. Unidade de transcrição
Diagrama representativo de um promotor genérico de E. coli. As caixas -35 e -10
(também chamada caixa de Pribnow ou caixa TATA) são muito conservadas entre
distintos promotores.
Pequenas variações nestas seqüências podem reduzir drasticamente a afinidade do
fator sigma da RNA pol pelo promotor.
A base +1 é, por convenção, aquela onde se inicia a transcrição. A RNA pol, uma
vez acoplada ao promotor, ocupa cerca de 5 voltas do DNA.

19. Reconhecimento do P romotor
 Para que este processo ocorra é necessário, antes de mais
nada, que a RNA polimerase identifique sinais
específicos no DNA, os quais direcionarão a transcrição
de genes específicos no momento adequado
 Uma enorme variedade de sinais pode ser encontrada
nas regiões promotoras de diferentes genes.
 É por este motivo que os promotores são locais
extremamente importantes no controle da expressão
gênica

20. Promotor
 Existe, um consenso em torno de sua seqüência.
 A primeira base transcrita em RNA com a base +1 = seqüência de
consenso de um promotor da bactéria Escherichia coli.
 A freqüência com que um promotor é ligado e o gene é transcrito
pela RNA pol, está diretamente associada à homologia com a
seqüência de consenso.
consenso
 É através da variação das seqüências nas duas caixas (conhecidas
como caixa TATA, ou caixa de Pribnow, e caixa -35) que é modulada a
transcrição relativa dos genes constitutivos (aqueles que são
expressos o tempo todo durante a vida da célula).
 Um gene cujo produto deva ser abundante tem um promotor com
seqüência mais próxima ao consenso

21. Processo de T ranscrição
•Diz-se que as seqüências que antecedem o ponto de início localizam-se à
montante (upstream) e as que o sucedem localizam-se à jusante
(downstream)
•A posição das bases é numerada nos dois sentidos, a partir do ponto de
início, ao qual se atribui o valor +1. Os valores aumentam (valor positivo) à
jusante e diminuem (valor negativo) à montante
•A taxa de transcrição gênica também pode ser afetada pela ligação de
proteínas ativadoras e repressoras a sítios próximos aos pontos de
iniciação e pela distância entre as seqüências de consenso dos promotores,
sendo a separação ideal igual a 17 nucleotídeos (em procariotos).

22. Região consenso
 Essas seqüências podem ser bastante variáveis, porém, mantêm
conservadas regiões responsáveis pela função promotora.
 Em procariotos, duas dessas regiões:
 10 pb = 5´ TATATT 3´
 35pb = 5' TTGACA 3’

23. Processo de T ranscrição
 Regiões chamadas de -35 e -10 devido as suas localizações
relativas ao ponto de inicio de transcriçao
 A subunidade σ permite que a RNA polimerase reconheça
(sinalização) e se ligue especificamente a regiões de
promotores
 A holoenzima procura um promotor e inicialmente se liga
frouxamente a ele, reconhecendo as regiões -35 e -10
 Forma uma estrutura chamada “complexo promotor fechado”
fechado
 A partir daí a enzima se liga fortemente, deselicoizando bases
próximas a região -10.

24. Probabilidades dos arranjos
 O arranjo particular da estrutura do promotor permite que, com apenas um
par de 6 bases (cada caixa consenso tem em geral uma dúzia de bases) um
promotor seja determinado com imensa precisão.
 O que queremos dizer com isto?
 Podemos formular a questão de outra forma: qual a probabilidade de uma
seqüência de 6 bases ocorrer ao acaso no DNA?
 Para cada base a probabilidade de ser um T, digamos, é 1/4, pois podemos
ter T, A, G ou C.
 O mesmo se aplica para as demais bases da seqüência, portanto, a
probabilidade de se ter a seqüência TAATTA, por exemplo:
¼ x ¼ x ¼ x ¼ x ¼ x ¼ = (¼ )6 ~ 1/4000

25. Considerações
 Não é uma probabilidade muito pequena, considerando que há de
2 a 10 milhões de bases num genoma procarioto.
 O encontro de uma tal seqüência não pode ser fortuito!
 Embora se tenha mais liberdade em alterar a seqüência da região
promotora fora das caixas de consenso, não podemos retirar nem
acrescentar bases entre as caixas, porque a distância entre elas
deve ser mantida.
 Chegamos, então, a um importante conceito na biologia
molecular: distância também é informação.
 O fator σ deve reconhecer as duas caixas de consenso. primeiro a
TATA e depois a -35 e para tal elas devem estar a uma
determinada distância entre si.

26. Alogamento
 O RNA é sempre produzido no sentido 5’- 3’
 Durante essa fase, o RNA recém-sintetizado pareia-se
temporariamente com a fita molde de DNA = híbrido curto RNA-
DNA.
 Diferentemente da DNA polimerase, a RNA polimerase não tem
atividade de nuclease, ou seja, não revisa a cadeia de RNA
nascente.
 Conseqüentemente, a fidelidade da síntese de RNA (transcrição) é
bem menor que aquela observada para o DNA (replicação).
 Os RNAs sintetizados que apresentarem problemas serão
degradados e têm pouca probabilidade de serem prejudiciais,
uma vez que outros transcritos serão rapidamente produzidos.

27. Regiões Terminadoras
 A análise de muitas dezenas de regiões terminadoras mostrou
que sua sequência apresenta características comuns, que
comuns
podem ser resumidas da seguinte forma:
 Na fita de DNA que está servindo de molde para a síntese do
RNA surge uma sequência com cerca de 8 bases que, após um
espaçador de tamanho variável (4 a 15 bases, em geral),
 É seguida de outra sequência complementar a ela, porém em
sentido contrário;
 Logo após esta região simétrica há uma sequência longa de
Timinas (um poliT), na fita 5’-3’.
 Esta estrutura, conhecida como grampo de terminação, sinaliza
terminação
para a polimerase que ela deve terminar a síntese de RNA.

28. Sinais de início e término da síntese de RNA pela RNA polimerase bacteriana.
O sinal de início é o promotor, reconhecido pelo fator sigma.
O sinal de término é reconhecido a posteriori (isto é, pela estrutura formada no RNA),
e tem, no DNA uma sequencia poli-T.

29. Término
 O final da transcrição é um processo bem
controlado no qual seqüências típicas dos
transcritos de RNA (sinais de término) indicam o
local para a finalização da síntese dessa molécula.
 Na bactéria E. coli existem no mínimo duas classes
de seqüências de sinalização do término da
transcrição:
 uma utiliza a proteína r (rho)
 outra não (rho-independente).

30. Formação do grampo de
finalização
 O pareamento intramolecular das seqüências complementares do
RNA recém-sintetizado forma uma estrutura em grampo. Esse
acontecimento desencadeia os seguintes eventos:
 Parada da RNA polimerase:
 Destruição parcial do híbrido RNA-DNA (proporcionando
instabilidade da região que permanece ligada);
 Dissociação do RNA nascente da enzima RNA polimerase
 Restabelecimento da região dupla-fita do DNA;
 Liberação da RNA polimerase da fita molde do DNA.

32. Afinal, qual é o destino dos RNAs na
bactéria?
 A verdade é que a vida média de um mRNA bacteriano é muito
curta, raramente ultrapassando 60 segundos;
 Por isso, um mRNA só é necessário por breves instantes, sendo
em seguida descartado.
 No caso dos mRNA de procariotos, a sua degradação é
controlada por um processo engenhoso.
 A transcrição e a tradução estão de tal forma acopladas
que, imediatamente após a síntese de um pequeno trecho de
mRNA, os ribossomos já se ligam a este RNA nascente,
protegendo-o da degradação pelas RNases bacterianas.

33. Mecanismo de transcritos
 Uma primeira categoria em que se dividem os mecanismos reguladores, é
a que consiste em ligar (indução) ou desligar (repressão) óperons em
resposta a alterações ambientais (este sistema têm maior significância entre
os microorganismos).
 A segunda categoria envolve o desencadeamento de circuitos pré-
programados de óperons.
 Existem três categorias de genes:
 o regulador
 o operador
 os estruturais;

34. O modelo ÓPERON LAC:
 O regulador controla o operador e este, os estruturais;
 O gene regulador produz uma proteína chamada repressor ;
 O repressor se liga ao gene operador, impedindo a ligação da RNA pol e
portanto impedindo a transcrição dos genes estruturais que codificam as
enzimas de degradação da lactose;
 Quando o indutor (no caso a lactose) é adicionada ao sistema, este se
sistema
liga ao repressor, liberando o operador, o que permitirá a ligação da RNA
pol ao sítio promotor e consequentemente os 3 genes estruturais serão
transcritos.

35. •Esquema representativo do controle
da transcrição dos genes para as
enzimas responsáveis pelo uso da
lactose em E. coli.
• O repressor, produto do gene i,
i
liga-se ao operador (em verdade, duas
moléculas), impedindo a ligação da
RNA polimerase ao sítio promotor P
e bloqueando a transcrição.
•A lactose no citosol bacteriano liga-se
ao repressor, inativando-o e liberando
o promotor para ser ligado pela
RNApol.
• O processo de transcrição estará
liberado até que a concentração
citosólica de lactose seja insuficiente
para garantir a inativação das
moléculas do repressor.

36. Que importância tem o operon
lac na genética molecular?
 Muitos dos vetores de expressão, sejam eles fagos ou
plasmídeos, empregados em engenharia genética, têm o gene
clonado sob o controle de um promotor/operador lac.
 Este sistema propicia o controle da expressão do gene clonado
através da adição de um análogo da lactose, o IPTG
(isopropiltiogalactosídeo).
 Este produto é muitas vezes mais efetivo que a lactose na
indução da expressão do operão lac, além de não ser degradado.

37. Processo de Tradução
 O processo de tradução se inicia pela ligação da sub-unidade
menor do ribossomo a um sítio (sequência) específica no
mRNA chamado RBS (ribosome binding site).
 Esta ligação é mediada pelo pareamento de uma sequência do
rRNA 16 S (que faz parte da composição da sub-unidade
leve) com a sequência de Shine-Delgarno (ou RBS).
 À sub-unidade menor acopla-se, então, o primeiro tRNA
(sempre para formil-metionina, em E. coli), e o conjunto
formil-metionina
desliza pelo mRNA até encontrar o códon AUG (identificado
pelo anticódon correspondente no tRNA).

38. Sítio E ( “empty” =
vazio), onde se aloja o
tRNA descarregado
antes de sair do
ribossomo
Estão representados
os diversos fatores que
participam do processo
de tradução, além do
ribossoma e dos
tRNAs.

39. Síntese Protéica
 O RNAm transcrito no núcleo
chega ao citoplasma e se liga a
um ou mais ribossomos.
 O ribossomo “lê” o primeiro
códon e um RNAt com o
anticódon correspondente
transporta um aminoácido e se
liga ao códon.
 O ribossomo se desloca, no
sentido 5’3’ e lê o próximo
códon.
 Os aminoácidos são unidos por
ligações peptídicas.
 Ao final da tradução o
polipeptídeo se desliga e se
constituí na proteína.

40. TRADUÇÃO: SÍNTESE PROTEICA
Adição do aminoácido
Terminal 3´que liga ao
aminoácido -
correto: pareamento do
fenilalanina (Phe) códon (RNAm) com o
anticódon (RNAt)
Nucleotídeos
modificados

42. Proteínas
 As proteínas se definem como polímeros formados pela
união, mediante a cadeias peptídicas, de unidades de menor
massa molecular chamadas aminoácidos;
 As proteínas são macromoléculas
 São compostos mais abundantes da matéria viva
 São especificas
 Através delas se expressam a informação genética