フリーソフトではじめるChIP-seq解析_第40回勉強会資料

フリーソフトではじめる
C h I P - s e q 解析
第 4 0 回勉強会資料
2014年12月18日

上記はほんの一部
日々、多くのソフトが公開されている
Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved.
2
N G S データ解析のフリーソフト
QC
• cutadapt
• FastQC
• FastX-toolkit
• Trimmomaic
:
多くのツールは公開されているフリーソフトであり、LinuxというOSで動作する
アライメント
• bowtie
• bwa
• BSMAP
• Tophat
:
ピーク検出
・アノテーション
• MACS
• QuEST
• ChIPpeakAnno
:
※Rなど、WindowsやMacでも動くものもある
メチル化解析・比較
・アノテーション
• BSMAP
• methylKit
• BisSNP
:

3
L i n u x とは
UNIX互換のサーバー向けOS（オペレーティングシステム）
つまり、多人数で同時に利用し、常時稼働していることを想定したコンピューター
UNIXは権利問題などで、一般人の手の届かない存在となったため、Linus氏がUNIXを
参考にして、PCで動く独自OSを開発
Linux
大多数の解析ツールを使用することができる
新しいツールが出た時、すぐ自分で試せる
次世代シーケンシングデータのように、大
きなデータは、Excel等で見る事が難しい
自分の思い通りにデータの可視化や加工ができる
バイオインフォマティクスで使用する解析ツールの
多くは、Linux用に作成されている
「Primerを数百個作りたい」「数万個の配列がどの遺伝子に当たるの
か確認したい」という時、同じ作業を何度も繰り返す事は、難しい
繰り返し作業を自動化する事ができる
大量データの扱い
繰り返し操作の簡易化
解析ツールの問題

4
L i n u x とは
Linuxにはさまざまなディストリビューション（配布形式）がある
Debian系・・・Ubuntuなど
Red Hat系・・・Red Hat Enterprise Linux（商用）、CentOS（無償）など
見た目やパッケージ管理形式が異なるが、基本的な操作コマンドは同じ
解析サーバにCentOSをお奨めする理由
• 更新方針が保守的で、アップデートが頻発しない
• 枯れた技術を使っていて、安定している
弊社販売の
解析サーバで
使用

5
解析手法のご紹介
• 今回の解析で用いたサーバ
OS CentOS6 64bit
CPU Intel Corei7-3930K[3.2GHz/6Core]
メモリ 64GB
SSD 64GB（OS用）
HDD 2TB × 4台
時間がかかる処理については実行時間を示します

C h I P - s e q 解析でできること
• タンパク質結合部位の検出
• 結合モチーフの探索
6
ChIP-seqとChIP-chIPの比較
• ヒストン修飾や特定のタンパク質に結合するDNA断片を免疫
沈降・回収する点は同じ
• ChIP-seqは回収したDNAを断片化してからシーケンシング
するため、ChIP-chipよりピークの解像度が高い

7
用いたテストデータ
• NCBI GEOに登録されているヒトのChIP-seqデータ
– GSM1295084： BF細胞（ヒト成人繊維芽細胞）のH3K27me3 ChIP-seq
• SRA ID：SRR1055695
– GSM1295086： BF細胞のH3 input（コントロール） ChipSeq
• SRA ID：SRR1055697
– すべてIllumina GAIIx、36bp Single-End
– URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE40740
H3K27me3
• ヒストンH3の27番目のリジンのトリメチル化→転写抑制に関与

8
• GEOからダウンロードしたファイルはSRAフォーマットという独自形式に
なっており、そのままでは解析に使えない
• NCBI SRA Toolkitを使ってSRAフォーマットをFASTQフォーマットに変換
クオリティコントロール → マッピング→ピーク検出→アノテーション
$ fastq-dump SRR1055695.sra
$ fastq-dump SRR1055697.sra
拡張子が「.fastq」のFASTQファイルができる
• データのクオリティを集計して可視化する
$ fastqc -o 1_qc -f fastq SRR1055695.fastq
$ fastqc -o 1_qc -f fastq SRR1055697.fastq

9
• クオリティの低い塩基・リードを除去する
$ fastq_quality_trimmer -t 20 -l 30 -Q 33
-i SRR1055695.fastq | fastq_quality_filter -q 20 -p 80
-Q 33 -o 1_qc/SRR1055695.clean.fastq
3’末端からクオリティ20未満の塩基をトリミングし、長さが30塩基未満になった
リードを破棄する
80%以上の塩基がクオリティー20以上のリードのみを抽出する
約3分
他のFASTQファイルに対しても実施する

10
• SRR1055695
QCによりクオリティが改善された

11
• SRR1055697
QCによりクオリティが改善された

$ samtools view 2_mapping/SRR1055695.sorted.bam |
awk '$3!="*"{print $1}' | sort | uniq | wc -l
12
• クリーニング後のデータをゲノムにマッピングする
$ bowtie2 -p 3 genomeファイルのBowtie2インデックス
-U 1_qc/SRR1055695.clean.fastq | samtools view -Sb -
| samtools sort - 2_mapping/SRR1055695.sorted
$ samtools index 2_mapping/SRR1055695.sorted.bam
約15分
もう一つのサンプルに対しても実施する
• マッピング率を計算する
他のサンプルに対しても実施する26699307
マッピング率は
26283268 / 26699307 = 98.4 %
$ awk 'NR%4==1' 1_qc/SRR1055695.clean.fastq | wc -l
26283268
マッピング結果をソートしたBAMに直接出力

13
• マッピング結果をIGVで確認する
（１）ゲノムを選択（２）ChiP-seqの
マッピング結果
ゲノムポジション↓
（３）コントロールの
マッピング結果

14
• ピークを検出する
$ macs14 -t ../2_mapping/SRR1055695.sorted.bam
-c ../2_mapping/SRR1055697.sorted.bam -f bam
-g hs -n 出力名
コントロール（SRR1055697）と比較し、SRR1055695に特異的なピークを検出する
約30分
-t ChIP-seqのマッピング結果
-c コントロールのマッピング結果
-f 入力ファイルのフォーマット（bamなど）
-g ゲノムサイズ（ヒトの場合は'hs'）
-n 出力ファイルの頭につく文字列

15
• ピーク検出ソフト・MACSのアルゴリズム
1. マッピング結果からポアソン分布に基づきピークを検出する。1つの結合部位につき、Forward
側とReverse側の2つのピークが検出される。
2. クオリティの高い1000ピークをランダムに取り出し、Forward側ピークとReverse側ピークの
距離（d）をモデル化する。
3. d/2をシフトし、2dをウィンドウサイズとして、その中の最大値を結合部位とする。
4. トリートメントのピークの数とインプットのピークの数からFDRを推定する。
d

16
• ピーク検出結果（xx_peaks.bed）
1. 染色体名
2. ピーク開始ポジション（0スタート）
3. ピーク終了ポジション
4. ピーク名
5. スコア：ピークの -10*log10(pvalue)

17
• ピーク検出結果（xx_peaks.xls）
1. 染色体名
2. ピーク開始ポジション
3. ピーク終了ポジション
4. ピーク領域長
5. ピーク開始ポジションから数えた
summitの位置
6. ピーク領域にマップされたリード数
7. ピークの -10*log10(pvalue) for
the peak region（pvalue=1e-10な
ら100）
8. fold enrichment for this region
against random Poisson
distribution with local lambda
9. トリートメントのピークの数とイン
プットのピークの数から推定した
FDR（%）
-10*LOG10(p)
↓

18
• ピーク検出結果（xx_MACS_wiggle）
pileup結果をwiggleフォーマットで記載したファイル
wiggleフォーマット：http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/wiggle.html
ChIP-SeqのWiggle
検出されたピーク
ChIP-SeqのBAM
ControlのWiggle
ControlのBAM

18,520 429 76 0
19
• FDRの小さいものに絞り込む
全結果 FDR<10% FDR<9% FDR<8%
[1] Zhang Y, Liu T, Meyer CA, Eeckhoute J, Johnson DS, Bernstein BE, Nusbaum C, Myers RM, Brown M, Li W, Liu XS.
Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 2008;9(9):R137. doi: 10.1186/gb-2008-9-9-r137. Epub 2008 Sep 17.
PubMed PMID: 18798982; PubMed Central PMCID: PMC2592715.
MACSの論文[1]ではFDR<1%に絞っていたが
今回のデータはFDRが大きかったため
FDR<9%に絞った

20
ピーク検出ソフト Q u E S T
• 他の検出ソフト（QuEST）でも実行
– QuESTの特徴：実行時に結合タンパクの種類を選べる
– 入力フォーマットはMAQ、ELAND、bowtieなど（BAMには未対応）
$ bowtie -p 3 genomeファイルのBowtieインデックス
1_qc/SRR1055695.clean.fastq 2_mapping/SRR1055695.bowtie
bowtieによるマッピング（bowtieフォーマットで出力）
$ bowtie -p 3 genomeファイルのBowtieインデックス
1_qc/SRR1055697.clean.fastq 2_mapping/SRR1055697.bowtie
各約5分

21
SRR1055695.3 YILLUMINA-B8EC94_105:4:1:1555:1140 length=36 - chr22 32873017
ACACATAGTTCATTTGAGGTGTTTTTGCTTTTTCTG FGDGEDGEFFGGGEGEGGDD>@HHHHHHHFHGEHHH 0
SRR1055695.4 YILLUMINA-B8EC94_105:4:1:1583:1139 length=36 - chr12 34846311
TGAAACACTCTGTTTGTAAAGTCTGCACGTGGATAT DGHGHHHHHHHHHHHHHHHHHGBGBEHHHHHHFHGH 0
SRR1055695.2 YILLUMINA-B8EC94_105:4:1:1226:1131 length=36 + chr12 5193061
TTTTCTCTTATCTTTTCTAAAANTCNTAAACTAGGT GGGG8EDGGDEDGGGDDDDD=:#;;#;:9<BEEE@D 0
22:T>N,25:C>N
：
bowtieフォーマット

22
QuESTを実行
$ generate_QuEST_parameters.pl
-rp 染色体Fastaのディレクトリ/
-gt genome.fa.faiのパス
-bowtie_align_ChIP SRR1055695.bowtie
-bowtie_align_RX_noIP SRR1055697.bowtie
-ap 出力ディレクトリ
• -rp リファレンスゲノムの染色体ごとのFastaを置いたディレクトリ
• -gt リファレンスゲノムの染色体名とサイズの組のリスト
• -bowtie_align_ChIP ChIP-seqのマッピング結果（bowtieフォーマット）
• -bowtie_align_RX_noIP Controlのマッピング結果（bowtieフォーマット）
• -ap 結果出力ディレクトリ

23
QuESTを実行
結合タンパクの種類
・転写因子→1
・ PolII-like factor→2
・ヒストン→3
・自分でパラメータを設定→4
「3」を選択

24
QuESTを実行
結合タンパクに応じた
パラメータ値の候補
（厳しめにするか緩めにするか）
「2（推奨値）」を選択
約20分

25
• QuESTの結果:概要（module_outputs/QuEST.out）
## please cite:
## Valouev A, Johnson DS, Sundquist A, Medina C, Anton E, Batzoglou S,
## Myers RM, Sidow A
## Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based
## on ChIP-Seq data.
## Nat Methods. 2008 Sep; 5:(9):829-35
ChIP peaks: 13
ChIP peaks accepted: 13
ChIP peaks rejected: 0
ChIP regions: 11
ChIP regions accepted: 11
ChIP regions rejected: 0

26
• QuESTの結果:ピーク（calls/peak_caller.ChIP.out.accepted）
R-1 chr11 3674740-3676339 ChIP: 170.5 control: 22.6886 max_pos: 3675711 ef: 7.51476 ChIP_tags:
1572 background_tags: 118 tag_ef: 7.92329 ps: 17 cor: 0.485103 -log10_qv: 29914.9 -log10_pv:
29922.1 qv_rank: 1
P-1-1 chr11 3675169 ChIP: 123.088 control: 12.954 region: 3674740-3676340 ef: 9.50194 ps: 17 cor:
0.980156 -log10_qv: 231.8 -log10_pv: 238.99 qv_rank: 5
P-1-2 chr11 3675711 ChIP: 170.5 control: 22.6886 region: 3674740-3676340 ef: 7.51476 ps: 15 cor:
0.94687 -log10_qv: 238.543 -log10_pv: 245.732 qv_rank: 4
R-2 chr22 51081718-51084682 ChIP: 48.6881 control: 3.90919 max_pos: 51082255 ef: 12.4548
ChIP_tags: 430 background_tags: 22 tag_ef: 11.6247 ps: 13 cor: 0.171511 -log10_qv: 1053.29 -
log10_pv: 1059.78 qv_rank: 5
P-2-1 chr22 51082255 ChIP: 48.6881 control: 3.90919 region: 51081718-51084683 ef: 12.4548 ps: 13
cor: 0.875156 -log10_qv: 571.506 -log10_pv: 577.997 qv_rank: 1
：
ピークの位置、スコア、q-valueなどが記載されている

27
• QuESTの結果:ピーク（tracks/ChIP_calls.filtered.bed）
track name=ChIP_filtered description=ChIP_filtered_regions itemRgb="On" priority=67 visibility=1
chr11 3674741 3676340 R-1 170.5 + 3674741 3676340 0,191,255
chr22 51081719 51084683 R-2 48.6881 + 51081719 51084683 0,191,255
chr17 153120 155470 R-3 43.6734 + 153120 155470 0,191,255
chr7 100547703 100553968 R-4 42.4881 + 100547703 100553968 0,191,255
chr20 46522428 46525209 R-5 35.9235 + 46522428 46525209 0,191,255
chr18 111978 112686 R-6 35.4676 + 111978 112686 0,191,255
chr20 62719779 62720414 R-7 34.2823 + 62719779 62720414 0,191,255
chr2 133021646 133031873 R-8 33.4617 + 133021646 133031873 0,191,255
chr7 944472 946396 R-9 32.6411 + 944472 946396 0,191,255
chr2 90448094 90454767 R-10 32.5499 + 90448094 90454767 0,191,255
chr1 17193078 17204129 R-11 30.6352 + 17193078 17204129 0,191,255
：
IGVで表示するために以下の処理が必要
・ピークとSummitの情報が混在しているので、分ける
・track行を除去しておく

28
• QuESTの結果:ピーク（tracks/ChIP_calls.filtered.bed）
ChIP-SeqのBAM
ControlのBAM
QuESTで検出されたピーク

29
• MACSとQuESTで共通するピークを探す
$ intersectBed -wa -a macsの.bed -b QuESTのbed
MACSのピークのうち、QuESTのピークとオーバーラップするものを探す
$ intersectBed -v -a macsの.bed -b QuESTのbed
MACSのピークのうち、QuESTのピークとオーバーラップしないものを探す

30
• ピークをアノテーション
MACSで検出されたピークの読み込みと変換
> macs_bed = read.table("MACSのbed")
> macs = BED2RangedData(macs_bed)
Rを起動し、ChIPpeakAnnoパッケージを読み込む
$ R
> library(ChIPpeakAnno)
EBI Biomartからヒト遺伝子情報をダウンロードし、アノテーション
> mart = useMart(biomart="ensembl",
dataset="hsapiens_gene_ensembl")
> myAnno = getAnnotation(mart)
> annotatedPeak = annotatePeakInBatch(macs, AnnotationData=myAnno)

31
• ピークをアノテーション
アノテーション結果をファイル出力
> write.table(as.data.frame(annotatedPeak),
file="annotatedPeakList.tsv", sep="¥t",
row.names=FALSE)
近傍遺伝子からの距離

32
R N A - s e q の結果と併せた考察
• ChIP-seqで検出されたBF細胞のH3K27me3部位のピークと
RNA-seqのHs68-BF間で発現が異なる遺伝子の位置関係を比較
→SIM1遺伝子の上流2kbpのヒストンメチル化が検出されていた
→SIM1は、Hs68と比較して、BFで発現が有意に減少していた遺伝子
BFのChIP-seqで
検出されたピーク
RNA-seqで
BFで発現が
低い遺伝子

33
R N A - s e q の結果と併せた考察
• SIM1は胎児の腎臓で特異的に発現することが報告されている
• メチル化と遺伝子発現の関係を検証するには、さらに以下のような解析が必要
（※本日は紹介しない）
→ Hs68のChIP-seq結果との比較
→ パスウェイ解析、Gene Ontology解析など
成人由来BFで発現が低下している
のと関連している可能性がある

34
共通モチーフ検索
• MEME（http://meme.nbcr.net/meme/intro.html）などで、ピークに
共通するモチーフ配列を検索
ピーク領域の塩基配列を取得
$ samtools faidx genomeファイルのFasta
chr1:17193078-17204129
$ samtools faidx genomeファイルのFasta
chr2:90446939-90454767
：
（各ピークに対して実行）
上記の結果からFastaファイルを作成

35
共通モチーフ検索
• MEME（http://meme.nbcr.net/meme/intro.html）などで、ピークに
共通するモチーフ配列を検索

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