Applicazione in campo biomedico del modelling di proteine
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- 10. Proteine in biomedicina ✓proteine come biofarmaci ✓proteine della famiglia delle citokine per scopi terapeu7ci ✓PEGhilazione di proteine per aumentarne la biodisponibilita’
- 11. Biofarmaci Come e’ il farmaco ideale ? •Altamente specifico ed affine, buona solubilita’, stabile e sicuro (effetti collaterali minimi) •di produzione economica, facile da formulare, di semplice assunzione e con il giusto profilo farmacocinetico. Grazie agli studi gene7ci sappiamo che molte mala?e sono provocate dal mulfunzionamento o dalla assenza di specifiche proteine. Dal punto di vista farmacologico, le proteine hanno il grande vantaggio di essere naturalmente adaDe ad essere metabolizzate nel corpo umano
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- 13. Biofarmaci Biofarmaci: sostanze biologiche o loro deriva7 molto simili alla molecola naturale, prodoDe aDraverso processi biotecnologici.
- 14. Biofarmaci Biofarmaci: sostanze biologiche o loro deriva7 molto simili alla molecola naturale, prodoDe aDraverso processi biotecnologici. Il primo biofarmaco approvato per uso terapeu*co e’ stata l’insulina umana prodo>a a>raverso tecniche di DNA ricombinante
- 15. Biofarmaci Biofarmaci: sostanze biologiche o loro deriva7 molto simili alla molecola naturale, prodoDe aDraverso processi biotecnologici. Il primo biofarmaco approvato per uso terapeu*co e’ stata l’insulina umana prodo>a a>raverso tecniche di DNA ricombinante L’uso della tecnologia del DNA ricombinante perme>e la preparazione di buone quan*ta’ di proteina e riduce la possibilita’ di reazioni avverse: malaGa di Creutzfeld-‐Jakob, Hepa*te B o HIV, che possono essere causate da impurita’ presen* nelle proteine estra>e in natura.
- 16. Proteine come Biofarmaci An7corpi monoclonali: OKT3, an*corpo monoclonale an*rige>o, impiegato nei trapian* d’organo e nelle malaGe autoimmuni. Immunotossine, an*corpi monoclinali u*lizza* nelle terapie contro il cancro. Citokine : Interferone alfa, biofarmaco u*lizzato nella cura di epa** virali e nel cancro. Interferone beta, usato nel tra>amento della sclerosi mul*pla e di altre malaGe autoimmuni. Eritropoi*na, sostanza che controlla lo sviluppo delle cellule nel sangue, usata nelle anemie. Granulocyte Colony s*mula*ng Factor, incrementa la formazione di granuloci* neutrofili (specifici globuli bianchi) nel midollo osseo importan* per le difese immunitarie. Somministrato quando, a seguito di una chemioterapia, il numero di granuloci* neutrofili rischia di raggiungere valori troppo bassi, aumentando il rischio di infezione. Ormoni : Insulina u*lizzata nella cura del diabete. GH, è l’ormone della crescita u*lizzato per curare le forme di nanismo.
- 17. Citokine Le citokine sono proteine regolatrici della comunicazione intercellulare nel sistema immunitario. Sono secrete in risposta a microbi, an*geni e/o s*moli ambientali. Agiscono come modulatori, soppressori o enhancer di risposte specifiche del sistema immunitario Stru>ura molto semplice (4-‐alpha helix bundle) ma svolgono mol* ruoli diversi in pathways importan* ....
- 18. PEGhilazione Poly(ethylene glycol) (PEG) e’ un polimero inorganico idrofilo neutro usato per migliorare le proprieta’ farmauce*che dei biofarmaci. I farmaci PEGhila* presentano mol* vantaggi una migiore stabilita’ e solubilita’ in acqua, maggiore resistenza alla inaGvazione proteoli*ca ,bassa tossicita’,migliore profilo faramcocine*co, minore immunogeni*cita’ e minore clearence renale.
- 19. Il caso del G-CSF e dell’MTgase.
- 20. Il caso del G-CSF e dell’MTgase. BIOKER produce proteine per scopi terapeu*ci che sono so>oposte a PEGylazione per aumentarne la biodisponibilità ed emivita nel corpo umano.
- 21. Il caso del G-CSF e dell’MTgase. BIOKER produce proteine per scopi terapeu*ci che sono so>oposte a PEGylazione per aumentarne la biodisponibilità ed emivita nel corpo umano. G-‐CSF ha una emivita corta in vivo, per superare questo problema si modifica legandola in modo covalente ad una molecola di polyethylene glycol (PEG).
- 22. Il caso del G-CSF e dell’MTgase. BIOKER produce proteine per scopi terapeu*ci che sono so>oposte a PEGylazione per aumentarne la biodisponibilità ed emivita nel corpo umano. G-‐CSF ha una emivita corta in vivo, per superare questo problema si modifica legandola in modo covalente ad una molecola di polyethylene glycol (PEG). Il processo di PEGylazione prevede l’uso di un enzima, la transglutamminasi ba>erica MTGase, in modo che la molecola di PEG si leghi chimicamente a specifici residui di glutammina della proteina.
- 23. Il caso del G-CSF e dell’MTgase. BIOKER produce proteine per scopi terapeu*ci che sono so>oposte a PEGylazione per aumentarne la biodisponibilità ed emivita nel corpo umano. G-‐CSF ha una emivita corta in vivo, per superare questo problema si modifica legandola in modo covalente ad una molecola di polyethylene glycol (PEG). Il processo di PEGylazione prevede l’uso di un enzima, la transglutamminasi ba>erica MTGase, in modo che la molecola di PEG si leghi chimicamente a specifici residui di glutammina della proteina. Per la approvazione da parte degli en* competen* e’ richiesta la riproducibilita’ e la predicibilita’ della aGvita’ del farmaco; per questo e’ necessario predire a priori potenziali si* di peghilazione ed in modo par*colare essere capaci di disegnare proteine con un unico sito di peghilazione .
- 25. Metodi computazionali Predizione di si* specifici di peghilazione nel G-‐CSF:
- 26. Metodi computazionali Predizione di si* specifici di peghilazione nel G-‐CSF: • metodi computazionali per lo studio della struDura di proteine
- 27. Metodi computazionali Predizione di si* specifici di peghilazione nel G-‐CSF: • metodi computazionali per lo studio della struDura di proteine allinemen*, patches idrofobici, Solvent Accessible Surface
- 28. Metodi computazionali Predizione di si* specifici di peghilazione nel G-‐CSF: • metodi computazionali per lo studio della struDura di proteine allinemen*, patches idrofobici, Solvent Accessible Surface • metodi computazionali per lo studio della dinamica:
- 29. Metodi computazionali Predizione di si* specifici di peghilazione nel G-‐CSF: • metodi computazionali per lo studio della struDura di proteine allinemen*, patches idrofobici, Solvent Accessible Surface • metodi computazionali per lo studio della dinamica: Dinamica Molecolare, Normal Modes Analysis
- 30. Metodi computazionali Predizione di si* specifici di peghilazione nel G-‐CSF: • metodi computazionali per lo studio della struDura di proteine allinemen*, patches idrofobici, Solvent Accessible Surface • metodi computazionali per lo studio della dinamica: Dinamica Molecolare, Normal Modes Analysis • metodi computazionali per lo studio delle interazioni con altre proteine:
- 31. Metodi computazionali Predizione di si* specifici di peghilazione nel G-‐CSF: • metodi computazionali per lo studio della struDura di proteine allinemen*, patches idrofobici, Solvent Accessible Surface • metodi computazionali per lo studio della dinamica: Dinamica Molecolare, Normal Modes Analysis • metodi computazionali per lo studio delle interazioni con altre proteine: Docking Proteina-‐Proteina
- 32. Metodi computazionali Predizione di si* specifici di peghilazione nel G-‐CSF: • metodi computazionali per lo studio della struDura di proteine allinemen*, patches idrofobici, Solvent Accessible Surface • metodi computazionali per lo studio della dinamica: Dinamica Molecolare, Normal Modes Analysis • metodi computazionali per lo studio delle interazioni con altre proteine: Docking Proteina-‐Proteina Confronto con da* sperimentali
- 33. Metodi computazionali Predizione di si* specifici di peghilazione nel G-‐CSF: • metodi computazionali per lo studio della struDura di proteine allinemen*, patches idrofobici, Solvent Accessible Surface • metodi computazionali per lo studio della dinamica: Dinamica Molecolare, Normal Modes Analysis • metodi computazionali per lo studio delle interazioni con altre proteine: Docking Proteina-‐Proteina Confronto con da* sperimentali “Site-‐directed enzyma*c PEGyla*on of the human granulocyte colony-‐s*mula*ng factor.” C. Maullu, D. Raimondo, F. Caboi, A. GiorgeG, M. Sergi, M. Valen*ni, G. Tonon and A. Tramontano FEBS J. 276, 6741–6750 (2009)
- 34. Scale e tempi della modellazione Time hours Macro-homogeneous minutes Fluid-Dynamics (volume of fluids ) seconds Normal Coarse-grained mode microseconds Modelling analysis (blobs) nanoseconds Molecular Dynamics picoseconds Quantum (atoms) Mechanics femtoseconds (electrons) 1A 1nm 1µm 1mm meters Distance
- 36. G-CSF: sequenza e struttura secondaria
- 37. G-CSF: sequenza e struttura secondaria 17 Glutammine (Q)
- 38. G-CSF: sequenza e struttura secondaria 17 Glutammine (Q) 8 buried SAS < 25%
- 39. G-CSF: sequenza e struttura secondaria 17 Glutammine (Q) 8 buried SAS < 25% 5 not in alpha helix
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- 44. G-CSF: sequenza e struttura secondaria 17 Glutammine (Q) 8 buried SAS < 25% 5 not in alpha helix
- 45. G-CSF: struttura 3D Protein Data Bank (PDB): struttura 2D9Q (X-ray)
- 46. Dinamica Molecolare setup Set particle positions Assign particle velocities Calculate force on each particle Move particles by time step Save current positions and velocities Reached preset nos. no of time step? yes Il tempo totale di simulazione si divide in time -steps. Analyze data and print results Vengono aggiunta acqua e ioni per simulare le condizioni all’interno del corpo umano.
- 47. G-CSF DInamica Molecolare (MD)
- 49. MTgase Struttura X-rays (PDB code 1IU4). ha una struttura a disco con una tasca contenente la triade catalitica (CYS64, HIS274, ASP255).
- 50. G-CSF + MTgase Transglutamination site (GLN134) Active site (CYS64,ASP255,HIS274)
- 51. Protein-Protein Docking 1 Search Algorithms: esplora tu>o lo spazio delle configurazioni delle due proteine, generando mol*ssime configurazioni (decoys). 2 Scoring Func7on: per classificare ognuna delle stru>ure (decoys) generate. E’ basata su principi primi ma con*ene anche termini empirici. E’ un problema computazionalmente molto pesante! Per assicurare un buon sampling di tu>o lo spazio delle mutue posizioni bisonga generare un grande numero di stru>ure (100K).
- 52. Risultati docking Con il sopware Rose>aDock, in parallelo sul cluster di calcolo ad alta prestazioni del CRS4, sono stait genera* 100K decoys per ognuno dei quali le posizioni delle due proteine sono scelte in maniera random. Il decoy con score minimo non è come ci aspeDavamo!!! Cosa ci dice questo risultato?
- 53. Protein-Protein Docking L’ interpretazione dei risulta* del Docking e’ un problema sta*s*co: bisogna tenere in considerazione sia il miglior score che la distribuzione spaziale dei decoys con miglior scores. Più spesso una conformazione viene trovata più probabile è in realta! Cluster analysis dei 200 decoys con score migliore (RMSD cut-‐off=2.5Ǻ)
- 54. Protein-Protein Docking L’ interpretazione dei risulta* del Docking e’ un problema sta*s*co: bisogna tenere in considerazione sia il miglior score che la distribuzione spaziale dei decoys con miglior scores. Più spesso una conformazione viene trovata più probabile è in realta! Cluster analysis dei 200 decoys con score migliore (RMSD cut-‐off=2.5Ǻ)
- 55. Protein-Protein Docking L’ interpretazione dei risulta* del Docking e’ un problema sta*s*co: bisogna tenere in considerazione sia il miglior score che la distribuzione spaziale dei decoys con miglior scores. Più spesso una conformazione viene trovata più probabile è in realta! Non è presente alcun cluster significa*vo per numerosità! Cluster analysis dei 200 decoys con score migliore (RMSD cut-‐off=2.5Ǻ)
- 56. MTgase: Normal Modes Analysis La stru>ura cristallografica del MTgase presenta una conformazione piu>osto chiusa della tasca contenente il sito catali*co. Normal Mode Analysis (NMA) evidenzia i mo* oscillatori della proteina su scale di tempo molto lunghe. Calcolo dei normal modes del MTgase tramite sopware Betagm (gaussian network model, MicheleG et al.,Proteins 2004)
- 57. MTgase: Normal Modes Analysis La stru>ura cristallografica del MTgase presenta una conformazione piu>osto chiusa della tasca contenente il sito catali*co. Normal Mode Analysis (NMA) evidenzia i mo* oscillatori della proteina su scale di tempo molto lunghe. Calcolo dei normal modes del MTgase tramite sopware Betagm (gaussian network model, MicheleG et al.,Proteins 2004) E’ stata scelta una configurazione con la tasca del sito catali*co piu’ aperta: “MTGase open”
- 59. MTgase open :risultati docking Nel caso di docking “open” è stato generato un cluster di 158 configurazioni che mostrano una interazione specifica dell’MTgase con la GLN134, indicando che tale glutammina è un sito di transglutamminazione del G-‐CSF.
- 60. Esperimenti Mutagenesi E’ stato studiato computazionalmente anche il Mut4, dimostrando che la P132 rende rigida la Q131!
- 61. Inoltre... Nell’ambito della collaborazione con BIOKER sono state studiate anche altre 2 proteine delle citokine :IFNb ed IFNa scopo dello studio era migliorarne la solubilita’ per evitare aggregazioni che rendono difficile il delivery di queste proteine. Abbiamo studiato la dinamica dei patches idrofobici, suggerendo possibili mutazioni per o>enere patches idrofobici piu’ piccoli e sparsi sulla superficie proteica, salvaguardando la funzionalita’ della proteina.
- 62. Conclusioni
- 63. Conclusioni Studi computazionali fanno parte della pipeline di sviluppo di biofarmaci.
- 64. Conclusioni Studi computazionali fanno parte della pipeline di sviluppo di biofarmaci. Proteine sono en*ta’dinamiche, nel loro studio non si puo’ prescindere dalla capacita’ di riconformazione
- 65. Conclusioni Studi computazionali fanno parte della pipeline di sviluppo di biofarmaci. Proteine sono en*ta’dinamiche, nel loro studio non si puo’ prescindere dalla capacita’ di riconformazione I tempi di studio delle dinamiche di proteine sono oramai brevi e quindi perfe>amente integrabili nella fase di proge>azione e studio di farmaci.
- 66. Conclusioni Studi computazionali fanno parte della pipeline di sviluppo di biofarmaci. Proteine sono en*ta’dinamiche, nel loro studio non si puo’ prescindere dalla capacita’ di riconformazione I tempi di studio delle dinamiche di proteine sono oramai brevi e quindi perfe>amente integrabili nella fase di proge>azione e studio di farmaci. Il dialogo tra sperimentali e computazionali perme>e risparmio di tempo e denaro ed una comprensione piu’ approfondita del problema.
- 67. Ringraziamenti Bioker SRL : Carlo Maullu, Francesca Caboi, Sergio Mauri, Rodolfo Schrepfer, Giancarlo Tonon. CRS4 : gruppo di bioinforma*ca , gruppo AGCT Ilenia, Ma>eo sistemis* ed High Performance Compu*ng group. CNR -‐IRGB (ex INN) : con cui lavoro ora per l’analisi di da* genomici (spero che prima o poi troviamo un target di interesse per il modelling !)