Produção de poligalacturonase a partir do fungo termofilo Thermoascus em Fermentação submersa

1. Annals of Microbiology
September 2012, Volume 62,Issue 3, pp 1199-1205
Production and characterization of polygalacturonase from
thermophilicThermoascus aurantiacus on submerged
fermentation
Eduardo da Silva Martins, Rodrigo Simões Ribeiro Leite,
Roberto da Silva, Eleni Gomes
Produção e caracterização de poligalacturonase a
partir do fungo termófilo Thermoascus aurantiacus
em fermentação submersa
Apresentação: Mauren Silveira

2. OBJETIVO
AVALIAR ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA
ENZIMA TERMOESTÁVEL
POLIGALACTURONASE PRODUZIDA
PELO FUNGO
THERMOASCUS AURANTIACUS
A PARTIR DE MEIOS DE RESÍDUOS
AGROINDUSTRIAIS

3. Polímeros lineares compostos de resíduos de ácido 1,4 β-d-galacturônico
esterificado, unidos mediante ligações glicosídicas do tipo α 1-4

4. PECTINA
• Protopectina: insolúvel em água e tem cátions
divalentes. Frutas imaturas.
•As exo-poligalacturonases
Pectina: solúvel em água, formamida e
glicerol. 75% dos grupos carboxílicos são
catalisam a hidrólise das
metilados.
Ác. Pectínico: terminais α1-4 da
• ligações ác. Poligalacturônico com alta %
de metoxila. Forma gel com açúcar, ácidos e
cadeia de ác.
íons metálicos.
poliGalacturônico
• Ác. Péctico: ác. Poligalacturônico coloidal, sem
metoxila.

5. À MEDIDA EM QUE OS SUBSTRATOS SÃO
INTERESSE INDUSTRIAL
HIDROLISADOS PELAS EXO-PG OBSERVA-
SE UM CONSIDERÁVEL AUMENTO DA
CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES
CLARIFICAÇÃO
REDUTORES CAUSADA PELA LIBERAÇÃO
DE MONÔMEROS DE ÁC. GALACTURÔNICO
DIMINUIÇÃO DA VISCOSIDADE
E CONSEQUENTE DECRÉSCIMO DA
VISCOSIDADE DASFRIO E A QUENTE
EXTRAÇÃO DE ÓLEOS A SOLUÇÕES.
AROMATIZAÇÃO
MODIFICAÇÃO DA INTENSIDADE DA COR

7. Thermoascus aurantiacus
CBMI756
Ascomycota; Eurotiomycetes; Eurotiales; Trichocomaceae; Thermoascus
Crescimento de hifas:
45-52,5°C
Formação de ascósporos:
47.5-60°C
CELOLÍTICA: CELOBIOHIDROLASE, ENDOGLUCANASE E β-
GLUCOSIDASE DEGRADAÇÃO DA HEMICELULOSE: ALPHA-D-
GLUCURONIDASE, XILANASE, β-XILOSIDASE, β-MANNOSIDASE E
ARABINOFURANOSIDASE.
DEGRADAÇÃO DA PECTINA: HIDRÓLISE:PECTINA LIASE,
POLIGALACTURONASE,
AMILASE E α-GLUCOSIDASE.

8. METODOLOGIA
COMPARAR ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA ENZIMA
PRODUZIDA EM MEIOS SINTÉTICOS COM
PECTINA SINTÉTICA
» KHANNA
» VOGEL
» CZAPEC
» SR
EM RELAÇÃO A ENZIMA PRODUZIDA EM MEIOS
DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAS CONTENDO
PECTINA NATURAL
» CASCA DE LARANJA
» CASCA DE MARACUJÁ
» FARELO DE SOJA
» ÁGUA AMARELA

9. 25 ml de meio + 2.0 ml de micélio (0,6mg de micélio/ml de meio)
MÉTODO
ATIVIDADE ENZIMÁTICA
MEIOS SINTÉTICOS X PRODUÇÃO 5.0 com NaOH
Solução tampão acetato 0,4 ml (0.2 M) pH DA ENZIMA
1% de pectina comercial esterificada (26 DE Sigma)
+
• CZAPECK (Sais +enzima retirada da amostra
0,1 ml da Amido + Sucrose)
8 INCUBAR agitação 110min
dias com 60°C por 10 RPM
• KHANNAAmostras coletadas Amido) horas
(Muitos sais + a cada 24
TESTES
• SR (Poucos Sais + Peptonaa+10000 g por 10 min a 10°C
Filtração a vácuo centrifugado Amido)
DNS para determinar quantidade de açúcares redutores do ácido
• VOGEL (Poucos sais +Cada amostra + Glicina)
Triptona
D-galacturônico
Atividade enzimática
UMA UNIDADE DE ATIVIDADE DEde biomassa
Produção PG CORRESPONDE A QUANTIDADE
• PECTINA LIBEROU MICRO-MOL DE AÇÚCAR REDUTOR DE
DE ENZIMA QUECÍTRICA1(BRASPECTINA)
ConcentraçãoDE SOLUÇÃO POR MINUTO
ÁCIDO POR ml
de açúcares redutores
pH

10. CZAPEC KHANNA
0.5 U/ml 1.3 U/ml
SR VOGEL
2.0 U/ml
1.9 U/ml

11. MEIO SR

12. MEIOS DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS
A 2%
• Casca de Laranja
• Casca de Maracujá
• Farelo de Soja
• Água Amarela

13. 25 ml de meio + 2.0 ml de micélio (0,6mg de micélio/ml de meio)
8 dias com agitação 110 RPM
Amostras coletadas a cada 24 horas
Filtração a vácuo centrifugado a 10000 g por 10 min a 10°C
Cada amostra
Atividade enzimática
Produção de biomassa
Concentração de açúcares redutores
pH

14. Casca da Laranja Casca de Maracujá
Farelo de Soja Água Amarela

15. MÉTODO 4X2 NO MEIO
ÁGUA AMARELA
4 pH
• 4.5
• 5.0
• 5.5
• 6.0
2 TEMPERATURAS DETERMINADAS
• 45°C
• 50°C

16. TEMPERATURA E pH INICIAIS PARA PRODUÇÃO
DE PG EM ÁGUA AMARELA
45°C 50°C

17. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS

18. ATIVIDADE
DINÂMICA/CINÉTICA
• Tm 50% das enzimas desdobradas Temperatura ótima
• T1/2 meia vida das enzimas a uma Termoestabilidade
determinada temperatura
Proteínas desnaturadas: desaminação da
Asparagina (ASN) e da Glutamina (GLN) ou
quebra da ligação peptídica

19. ATIVIDADE ENZIMÁTICA/DINÂMICA
• pH ótimo a 55°C: 5.5
• Temperatura ótima: 60-65°C
Para determinar a temperatura ótima da enzima, foram feitos
experimentos incubando o extrato enzimático junto ao substrato, em
diferentes temperaturas (10-85°C), durante 10 minutos, tempo após
o qual foi determinada a atividade enzimática.

20. ATIVIDADE ENZIMÁTICA
MESOFÍLICOS/TERMOFÍLICOS
Temperatura ótima de atividade PG de fungos mesofílicos
50°C
Lentinus edodes
55°C
Moniliella sp SB9
40°C
Penicillium sp EGC5
Temperatura ótima de atividade PG de fungos termofílicos
70°C
Thermomyces lanuginosus
60°C
Thermomucor indicae-seudaticae N31

21. CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA/CINÉTICA
Para determinar a estabilidade do pH, incubou-se a enzima
sem substrato a 55°C em diferentes tampões:
Enzima bruta
Acetato de sódio (pH 3.0-5.5)
Fosfato Citrato (pH 6.0-7.0)
Tris-HCl (pH 7.5-8.5)
Glicina-NaOH (pH 9.0-11.0) 13%
6%
depois inseriu-se em substrato a 25°C - 24 horas, tempo após
o qual foi feito o teste DNS.
Para determinar a termoestabilidade, foram feitos
experimentos incubando o extrato enzimático SEM substrato,
em diferentes temperaturas, DURANTE 1 HORA. Após 1
hora, dosou-se a atividade enzimática, incubando no
91% Enzima bruta
substrato, por 10 minutos, o extrato enzimático que ficou
60%
exposto por 1 hora nas diferentes temperaturas.

22. CONCLUSÃO
A atividade enzimática de PG produzida por
T. aurantiacus na Água Amarela (3.2 U/ml) foi
melhor que a produzida no meio sintético
SR (2.0 U/ml) suportando uma
temperatura de até 55°C por 1 hora e
temperatura ótima no substrato de até
65°C por 10 minutos.

23. CONSIDERAÇÕES
• Aspergillus niger em cascaA CLARIFICAÇÃO
de limão por FS é
capaz de produzir 26.17 U/ml de
ENZIMÁTICA DE
POLIGALACTURONASE, porém, a DE SUCO uma
temperatura de 30°C. LARANJA PODE
• Sugere-se a pesquisa de isolamento do gene A
SER REALIZADA
responsável pela expressão
15°C DURANTE 12 da
poligalacturonase, sua amplificação e
HORAS
clonagem no vetor de expressão de OU A
Aspergillus niger, esperando obter 1 HORA
54°C POR enzima
termoestável em maior quantidade.

24. O BRASIL
AGRADECE