3. LATAR BELAKANG
o RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) adalah salah
satu teknik pertama yang secara luas digunakan untuk mendeteksi
variasi pada tingkat sekuen DNA
o RFLP merupakan marker yang sangat dapat dipercaya dalam analisis
linkage dan breeding dan dapat ditentukan dengan mudah jika
karakter terdapat dalam bentuk homozigot atau heterozigot.
o RFLP digunakan sebagai marker molekular karena spesifik untuk
setiap tunggal atau kombinasi dari enzim restriksi.
o Untuk dapat melakukan RFLP, maka perlu dilakukan proses isolasi
DNA.
o Isolasi DNA adalah perusakan atau pembuangan dinding sel yang
dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan
tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian
lisozim.
4. LATAR BELAKANG
o Aplikasi dari RFLP dapat digunakan untuk pemetaan genom, genome
typing, tes paternitas, forensic dan diagnostik hereditas penyakit
o Melihat banyaknya manfaat yang didapat dari RFLP untuk keperluan
penelitian maupun diagnosa suatu penyakit, maka sangat perlu
dilakukan praktikum Teknik Analisis Biomolekular tentang proses atau
tahapan RFLP secara keseluruhan.
5. RUMUSAN MASALAH
1. Apakah yang dimaksud dengan teknik RFLP?
2. Bagaimana tahapan – tahapan teknik RFLP?
3. Salah satu tahapan teknik RFLP adalah isolasi DNA. Apakah yang
dimaksud isolasi DNA?
4. Bagaimana proses atau tahapan isolasi DNA?
5. Enzim restriksi apakah yang digunakan dalam teknik RFLP?
6. Bagaimana sisi pemotongan enzim restriksi yang dipakai dalam
teknik RFLP?
7. Apakah manfaat teknik RFLP dalam bidang kedokteran hewan?
8. Apakah kerugian atau kelemahan dari teknik RFLP?
6. TUJUAN
1. Untuk mengetahui pengertian dari teknik RFLP
2. Untuk mengetahui tahapan – tahapan teknik RFLP
3. Untuk mengetahui pengertian dari isolasi DNA
4. Untuk mengetahui proses atau tahapan isolasi DNA
5. Untuk mengetahui macam – macam enzim restriksi yang
digunakan dalam teknik RFLP
6. Untuk mengetahui sisi pemotongan enzim restriksi yang dipakai
dalam teknik RFLP
7. Untuk mengetahui manfaat teknik RFLP dalam bidang kedokteran
hewan
8. Untuk mengetahui kelemahan dari teknik RFLP
7. MANFAAT
• Pemetaan genetik
• penentuan mutasi
• Menduga hubungan kekerabatan dari beberapa
individu yang dianalisis maupun kesamaan spesies
• Menduga ada tidaknya variasi genetik dari koleksi
plama nutfah
• Dapat memonitor proses seleksi (melalui linkage)
berbagai karakter
• Dapat memilah-milah komponen genetik dari karakter
kuantitatif
• Dapat menganalisis gen yang berasal dari proses
transformasi genetik
• Bersifat kodominan sehinggan dapat mendeteksi
adanya heterozigositas
• Memiliki kemampuan memisahkan yang tinggi pada
tingkat spesies, populasi
8.
9. Isolasi DNA dr Organ Hewan
0,1 gr organ hewan
Homogenat
Supernatan
Supernatan
Pelet
Pelet
DNA
10. 0,1 gr organ
Homogenat
hewan
Dihomogenasi dgn mortar pd kondisi
dingin
• Menghomogenkan, menghancurkan
• Dingin agar DNA tidak rusak (menjaga)
(+) 0,5 mL buffer lysis campur
• Menghomogenkan
• (+) buffer mejaga kondisi fisiologis
11. Homogenat Supernatan
Dimasukkan tabung eppendorf steril
(+) 300 µL PCI divortex sebentar
• Memisahkan protein & DNA
• Menghomogenkan
Disentrifus v=13000 rpm (10 mnt, 4°C)
• Memisahkan molekul berdasarkan berat jenis &
gravitasi
12. Supernatan Supernatan
Dimasukkan tabung eppendorf steril
baru
(+) 300 µL CI divortex sebentar
• Memisahkan protein & DNA
• Menghomogenkan
Disentrifus v=13000 rpm (10 mnt, 4°C)
diulang 1x lagi
• Memisahkan molekul berdasarkan berat jenis &
gravitasi
13. Supernatan Pelet
Dimasukkan tabung eppendorf steril
baru
(+) amonium asetat (+) 1 mL
ethanol absolut (bolak-balik)
• Presipitasi DNA
Disentrifus v=8000 rpm (5 mnt, 4°C)
• Memisahkan materi berdasarkan berat jenis &
gravitasi
14. Pelet Pelet
Diambil, (+) ethanol 70% (bolak-balik)
• Resuspensi
Disentrifus v=8000 rpm (5 mnt, 4°C)
• Memisahkan berdasarkan berat jenis & gravitasi
15. Pelet DNA
Dikeringkan dlm inkubator (55°C, 5
mnt)
• Mengawetkan/mengambil DNA
(+) 20-50 µL TE buffer
disimpan pd freezer (-20°C)
16. RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism)
Thinwall 10 µL DNA hasil PCR
2 µL buffer enzim
dimasukkan 2 µL enzim restriksi
6 µL ddH2O agar gel
di mix gentle lurus/rata
diinkubasi (37°C, semalam)
diinkubasi (70°C, 10 mnt) u/ stop
reaksi (agar enzim rusak)
disimpan dlm freezer
Hasil
18. Pembahasan
• Pada foto hasil praktikum terlihat bahwa band
yang dihasilkan terlihat mengelompok karena
konsentrasi DNA yang digunakan terlalu tinggi
sehingga tidak menampilkan hasil yang baik
saat ditampilkan dalam foto
• Semakin terang warnanya maka semakin
banyak DNA nya yang terkandung… Hal it
dapat dilihat pada T1,T2,M7,M8
19. Prinsip Kerja
• Secara garis besar, prosedur AFLP dipilah
menjadi tiga tahap pokok:
• Pemotongan (digesti) oleh enzim restriksi
dan penempelan (ligasi) adapter
• Perbanyakan (amplifikasi) selektif atas
potongan-potongan DNA
• Analisis hasil amplifikasi lewat
elektroforesis gel
20. Troubleshooting
• Hasil yang didapatkan dari isolasi DNA tiap
spesimen tdak sama, mungkin tersebut terjadi
pada saat homogenisasi awal.
• Hasil dari RFLP menujukkan hasil yang
berbeda pada uji kuantitas yaitu pengukuran
dengan spektrofotometri.
21. Kelebihan dan Kekurangan
• Teknik RFLP memiliki beberapa kelebihan,
• tidak memerlukan pengetahuan atau data
tentang sekuens DNA genom yang akan dianalisa,
• hanya memerlukan sampel DNA dalam jumlah yang
sedikit,
• teknik ini dapat digunakan untuk berbagai jenis sampel
DNA,
• penanda yang dihasilkan lebih dapat dipercaya dan
hasil pengulangan lebih baik jika dibandingkan
dengan RAPD.
• Kekurangan dari RFLP adalah penanda DNA yang
dihasilkan hanya bersifat dominan.
22. Enzim Restriksi
EcoRI (diucapkan "eko R satu") adalah enzim
yang diisolasi dari endonuklease strain E. coli.
Dalam biologi molekuler digunakan sebagai
enzim restriksi. Ini menciptakan ujung lengket
dengan overhang akhir 5 '. Urutan asam
nukleat tempat pemotongan enzim GAATTC,
yang, sebagai urutan komplementer adalah
CTTAAG, memiliki simetri rotasi.
23. HindIII (diucapkan "Hin Dee Tiga") adalah tipe II
spesifik situs enzim restriksi deoxyribonuclease
terisolasi dari Haemophilus influenzae yang
membelah urutan DNA pada AAGCTT
Pembelahan urutan antara hasil AA dalam
overhang 5 'pada DNA yang disebut sticky end:
5'-A | A G C T T-3 '
3'-T T C G A | A-5 '
26. Kesimpulan
• Analisis Restriction fragment length
polymorphism (RFLP) adalah salah satu teknik
pertama yang secara luas digunakan untuk
mendeteksi variasi pada tingkat sekuen DNA.
• Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari
DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu
dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan
teknik untuk memisahkan campuran
berdasarkan berat molekul komponennya.
27. saran
• Untuk melakukan RFLP perlu diberi
kesempatan pada mahasiswa untuk
melakukan praktikum secara lengkap
