Thiết kế vector baculor virus mang gen HA của virus cúm A H5N1 phục vụ cho việc phát triển vaccine thế hệ mới bằng công nghệ Virus like particle.pdf

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TR Ư Ờ N G ĐẠI HỌC K H O A HỌC T ự NHIÊN
• • • •
Đ ào Thị N hư Hoa
THIÉT KẾ VECTOR BACULOR VIRUS MANG GEN HA
CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 PHỤC v ụ CHO VIỆC
PHÁT TRIỀN VACCINE THÉ HỆ MỚI BẰNG
CÔNG NGHỆ VIRUS LIKE PARTICLE
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
M ã số: 60.42.40
LU ẬN V Ă N TH Ạ C SỸ K H O A HỌC
N G Ư Ờ I HƯ ỚNG DẢN K H O A HỌC: TS Đ Ồ N G VÃN Q UYÊN
H à N ộ i-N ă m 2012

2. LÒI CẢM ON
Trước hết, tôi xin bậy tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tói Tố. Dồng Văn Quyền
, ngưòi đã tận tỉnh chỉ bảo, quan tâm, giúp đỡ vả dìu dắt tôi trong suốt quá trình học
tập, nghiên cứu, vả hoàn thành luận văn, giúp tôi có được nhiều kiến thức, kinh nghiệm
quỷ báu.
Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi đã nhận được <sự giúp đõ tận tỉnh, <
B
ự
ủng hộ động viên của các anh, chị, em đổng nghiệp tại Phòng Vi sinh vệt học phân tử,
đặc biệt là PGỔ.T&. Dinh Du/ Kháng, CN. Nguyễn Thị Phương, CN. Ngu/ễn Thanh Tùng,
những ngưòi đỗ chỉ bảo, giúp đõ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn thạc
&ỹ. Tôi cung nhận được sự giúp đõ, tạo nhiểu điều kiện thuận lợi của phòng Vi sinh vật
học Phân tử, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm quốc gia vổ công nghệ gen, Viện Công
nghệ ổinlì học.
Tôi cũng xin được bồ/ tỏ lòng biết ơn sâu (Sắc tới các thầy, cô trong bộ môn Vi
sinh vật học, Khoa ỗinh học, Trường Dại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điểu kiện vả
giúp đõ tôi trong quố trình học tập vồ nghiên cứu tại trường.
Cuối cùng tôi xin gửi lòi cảm ơn sâu sắc tỏi những ngưòi thân trong gia đình và
bạn bẻ đã ủng hộ, động viên giúp đõ bôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể
hoàn thành bản luận văn nồ/.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Đồo Thị Như Hoa

3. Luận văn thạc sĩ sinh học Đào Thị Như Hoa
MỤC LỤC
ĐẶT VÁN Đ È ..............................................................................................................................1
Chương 1: TỎNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................................3
1.1. Tổng quan về virus cú m .............................................................................................3
1.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus cúm ......................................................3
1.1.2. Đặc điểm các phân đoạn gen của virus..............................................................4
1.1.3. Các kháng nguyên quan trọng của virus cú m .................................................. 6
1.1.4. Tình hình dịch bệnh H5N1...............................................................................10
1.2. Vaccine phòng chống cúm ....................................................................................11
1.2.1. Đại cương về vaccine...........................................................................................11
1.2.2. Vaccine truyền thống............................................................................................13
1.2.3. Vaccine thế hệ m ới:.............................................................................................. 13
1.3. Hạt giả virus - V LPs..................................................................................................14
1.3.1. Phương pháp tạo VLPs........................................................................................ 14
1.3.2. Các hệ thống biểu hiện tạo V LPs...................................................................... 15
1.3.3. Vaccine VLPs........................................................................................................ 16
1.3.4. Cơ chế tạo đáp ứng miễn dịch của V L Ps........................................................ 21
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u ................................24
2.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................................24
2.2. Vật liệu ..........................................................................................................................24
2.2.1 Vector tách dòng....................................................................................................24
2.2.2. Vector biểu hiện trong tế bào côn trùng..........................................................25
2.2.3. Hóa chất và sinh phẩm ........................................................................................25
2.2.4. Trang thiết b ị:........................................................................................................26
2.3. Phương pháp nghiên cứ u :...................................................................................... 27
2.3.1. Tách chiết RNA tổng sổ ..................................................................................... 27
2.3.2. Kiểm tra RNA bằng quang phổ kế....................................................................27
2.3.3. Tổng hợp cD N A ...................................................................................................27
2.3.4. Thiết kế hộp gen HA của viruscúm A/H5N1................................................28

4. Luận văn thạc sĩ sinh học Đào Thị Nhu Hoa
2.3.5. Thiết kế các vector trung gian baculovirus mang hộpgen H A ....................28
2.3.6. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli.......................................................29
2.3.7. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E.coli.................................................. 30
2.3.8. Kiểm tra DNA plasmid bằng enzym giới hạn.................................................31
2.3.9. Thu đoạn DNA từ gel agarose......................................................................... 31
2.3.10. Chọn lọc các dòng plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO mang hộp gen HA32
2.3.11. Chuẩn bị tế bào SÍ9 cho quá trình đồng chuyền nạp................................32
2.3.12. Đồng chuyển nạp..............................................................................................33
2.3.13. Tách chiết DNA tổng số từ baculovirus tái tổ hợp....................................34
2.3.14. Kiểm tra sự có mặt gen HA trong tế bào côn trùng Sf9 bằng P C R ......34
CHƯƠNG 3: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................35
3.1. Thiết kế DNA bộ khung của baculovirus tái tổ hợp mang hộp gen HA .35
3.1.1. Thiết kế hộp gen H A ........................................................................................... 35
3.1.2. Tách dòng hộp gen HA vào vector pC R 2.1................................................... 35
3.1.3. Thiết kế vector trung gian baculovirus mang hộpgen H A .........................37
3.2. Nuôi cấy và bảo quản tế bào côn trùng Spodoptera/rugiperda (Sf9)............39
3.3. Đồng chuyển nạp tạo baculovirus tái tổ hợp mang hộp gen H 5 ......................40
3.4. Kiểm tra sự có mặt của gen HA trong virus tái tổ hợp bằng phương pháp PCR.. 41
KÉT LUẬN VÀ KIẾN N G H Ị.......................................................................................... 43
KẾT LU Ậ N ......................................................................................................................... 43
KIẾN N G H Ị........................................................................................................................ 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................. 44
PHỤ LỤC.................................................................................................................................51

5. BẢNG CÁC CHỮ VIÉT TẮT
Từ viêt tăt Y nghĩa
Amp Ampicillin
APS Amonium persulphate
Bp Base pair
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTP 2’-deoxyribonucleoside 5’-triphosphate
E.coli Escherichia coli
EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic Acid
Ka kanamycin
Kb Kilo base
KDa, Da Kilo Dalton, Dalton
LB Lauria-betani medium
mRNA Messeger RNA
OD Optical density
PCR Polymerase Chain Reaction
RNA Ribonuclecic Acid
v/p Vòng/phút
v/v Thê tích/thê tích
w/v Trọng lượng/thê tích
X-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D
galactopyranosite

6. Luận văn thạc sĩ sinh học
• • • Đào Thị Như Hoa
ĐẶT VẤN ĐÊ
Cúm gia cầm đã và đang tiếp tục là mối đe dọa đối với sức khỏe cộng đồng
toàn cầu. Theo thông báo của Tổ chúc Y tế thế giới (WHO), tính từ năm 2003 đến
năm 2012, tổng số ca mắc cúm gia cầm đã lên tới 610 trường hợp, trong đó có 360
trường hợp tử vong [24], Điều đặc biệt nguy hiểm là các chủng virus cúm gia cầm
này luôn biến đổi, làm tăng khả năng lây nhiễm sang người cũng như độc lực của
virus. Con người đang phải chạy đua trong việc tìm và phát triển các liệu pháp mới
nhằm phòng, chống lại sự biến đổi liên tục của loại virus giết người này. Phương
pháp hữu hiệu nhất là tiêm chủng vaccine.
Với sự tiến bộ của khoa học, chúng ta đã phát triển được vaccine cúm
A/H5N1 và đã phần nào kiểm soát được sự lây nhiễm trong cộng đồng. Các loại
vaccine cúm gia cầm chính hiện nay đang được sử dụng đều sản xuất trên trứng gà
có phôi và có những hạn chế nhất định như đỏi hỏi thời gian sản xuất lâu, hiệu suất
thấp, chi phí cao... đặc biệt trong trường hợp đại dịch xẩy ra sẽ không thể đáp ứng
đủ yêu cầu.
Gần đây các nhà khoa học đã nghiên cứu và ứng dụng thành công công nghệ
virus-like particles (VLPs) để phát triển các vaccine thế hệ mới. Đây là một hướng
nghiên cứu mới đầy triển vọng, đang được triển khai nghiên cứu ứng dụng tại nhiều
phòng thí nghiệm tiên tiến và các công ty dược phẩm hàng đầu trên thế giới, nhằm
bổ sung cho các công nghệ truyền thống. Vaccine VLPs viêm gan B và vaccine
VLPs ung thư cổ tử cung là 2 vaccine đầu tiên được sản xuất bằng công nghệ tiên
tiến này và đã được Cục quản lý thực phẩm & dược phẩm Hoa kỳ (FDA) chứng
nhận. Các nghiên cứu mới nhất cho thấy, vaccine VLPs cúm gia cầm tạo đáp ứng
miễn dịch phòng vệ mạnh hom, kéo dài hơn so với vaccine cùng loại sản xuất bằng
công nghệ truyền thống.
Việt Nam là một trong hai quốc gia có tỷ lệ mắc và tổn thất cao nhất do cúm
gia cầm [2, 5, 24]. Vì thế nhu cầu vaccine này là rất lớn và cấp thiết. Xuất phát từ
các cơ sở trên, chúng tôi nghiên cứu đề tài: “Thiết kế vector bacuỉor virus mang
1

7. Luận văn thạc sĩsinli học
_•_ ______•__________ » Đào Thỉ Như Hoa
•
________
gen HA của virus cúm A/H5N1 phục vụ cho việc phát triển vaccine thế hệ mới
bằng công nghệ Virus like particle”
Đe tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật học Phân tử, Viện Công nghệ
Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2

8. Luận văn thạc sĩ sinh học
• _ • • Đào Thị Như Hoa
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về virus cúm
1.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus cúm
Bệnh cúm là bệnh của loài chim và động vật có vú do virus dạng RNA thuộc
họ Orthomyxoviridae gây ra. Họ Orthomyxoviridae đã được phát hiện, bao gồm 4
nhóm virus: nhóm virus cúm A, cúm B, cúm c và nhóm Thogotovirus. Các nhóm
virus khác nhau bởi kháng nguyên bề mặt capsid, ở virus cúm A và B là
Hemagglutinin, ở virus cúm c là Hemagglutinin Esterase Fusion, và ở
Thogotovirus là Glycoprotein [4, 6].
Virus cúm A có cấu tạo hình cầu hoặc hình khối đa diện, đôi khi cũng có
dạng hình sợi, đường kính 80 - 120 nm, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Da
(Hình 1.1 A). Kết quả phân tích thành phần hóa học cho thấy một hạt virus có chứa
khoảng 0,8-1,1% RNA; 70-75% protein; 20-24% lipid và 5-8% carbonhydrate[23].
Hệ gen virus cúm A là RNA sợi đon âm (-) ssRNA, bao gồm 8 phân đoạn gen riêng
biệt, mã hóa cho 11 protein khác nhau của virus gồm: HA, NA, M (MI và M2), NP,
NS (NS1 và NS2), PA, PB1, PB1 - F2 và PB2[6]. Mỗi phân đoạn RNA của virus
cúm A có cấu trúc bậc 2, xoắn a đổi xứng, dài 50-100 nm, đường kính 9-10 nm,
được bao bọc bởi nucleoprotein có bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc
ribonucleoprotein (RNP) (Hình 1.1 B). Mỗi RNP kết hợp với 3 protein enzym
polymerase chịu trách nhiệm trong quá trình phiên mã và sao chép RNA của virus.
Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bàng các cầu nổi peptide tạo
dạng vòm tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một sợi RNA duy nhất
có tổng độ dài từ lOkb - 15 kb (tuỳ theo từng chủng virus cúm A), chứa khoảng
13,5 kb thông tin di truyền và có cấu trúc xoắn a bên trong vỏ virus[6].
Bao bọc hạt virus là một lớp vỏ lipid kép có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm
được gắn protein màng của virus, đóng vai trò bảo vệ vật chất di truyền RNA của
virus. Bề mặt ngoài của vỏ được bao phủ bởi các glycoprotein phân bố dày đặc.
Mỗi glycoprotein có kích thước dài khoảng 10-14 nm, đường kính 4-6 nm. Virus
3

9. Luận văn thạc sĩ sinh học Đào Thị Như Hoa
cúm có hai loại protein kháng nguyên đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm
nhiễm của virus là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Các phân tử HA
và NA phân bố không đồng đều (cứ 4-5 phân tử HA thì có 1 phân tử NA). Ngoài ra
trên bề mặt vỏ còn có protein M2 nằm xuyên qua màng lipit kép và hoạt động như
kênh vận chuyển ion. Xen giữa hạt virus và vỏ là lớp protein nền M l (matrix) [6],
Influenza virus RNP
(■) sense ssRNA
3 polymerase subunits
NP
Hình 1.1: Virus cúm A/HINI chụp băng kính hiên vi (A) và hình ảnh mô phỏng
r __ >
câu trúc ribonucleoprotein (B) (nguôn internet).
1.1.2. Đặc điểm các phân đoạn gen của virus
Virus cúm cỏ hệ gen là RNA sợi đơn âm gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt
mang tên từ 1-8 theo thứ tự giảm dần của kích thước phân tử, mã hóa tổng hợp cho
11 protein (Hình 1.2). Trong hệ gen các phân đoạn 1; 2; 3; 5; 7; 8 có độ dài tương
đối ổn định và có tính bảo thủ cao. Hai phân đoạn 4 và 6 mã hóa cho các protein bề
mặt của virus (HA và NA) có độ dài không ổn định và đặc trưng theo từng chủng
virus [1,6].
> Phân đoạn 1 có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp protein enzym PB2.
Enzym này có khối lượng phân tử khoảng 84 kDa, là tiểu đom vị thành phần trong
phức hợp enzym polymerase chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA của virus.
Tính thích nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ có liên quan đến vị trí amino axít 627 ở
protein PB2.
4

10. Luận văn thạc sĩ sinh học Đào Thị Như Hoa
P B 1. PB2. PA
ha
NP
X N
A
3 M
1
I M
2
I NS2
4 1 NS1
Hình 1.2: Mô hình cấu trúc virus cúm A/H5N1.
> Phân đoạn 2 có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp enzym PB1. PB 1 có
khối lượng phân tử khoảng 87 kDa, là tiểu đon vị xúc tác của phức hợp enzym
polymerase chịu trách nhiệm gắn mũ RNA trong quá trình tổng hợp RNA virus.
Gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện thêm một protein PB 1 - F2 được mã hóa
bởi một khung đọc mở khác của phân đoạn 2.
> Phân đoạn 3 có kích thước 2233 bp, mã hóa tổng hợp protein enzym PA.
PA có khối lượng phân tử khoảng 83 kDa, là một tiểu đơn vị của enzym polymerase
chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của
virus. Phân đoạn gen này có tính bảo tồn cao.
> Phân đoạn 4 chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên
bề mặt virus cúm. Phân đoạn này gồm hai tiểu phần là HAI và HA2 có độ dài thay
đổi tuỳ theo từng chủng virus cúm A, ở A/H1N1 là 1778 bp. Protein HA có khối
lượng phân tử khoảng 63 kDa, đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm
của virus và có khả năng gây ngưng kết hồng cầu. Vùng nổi giữa HAI và HA2 là
một số amino axít mang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide.
Vùng này chứa vị trí nhận biết và cắt đặc hiệu của một số enzym protease của vật
chủ và là vùng quyết định độc lực của virus.
> Phân đoạn 5 có kích thước khoảng 1556 bp, mã hóa tổng hợp nucleoprotein
(NP). Protein NP là thành phần của phức hệ phiên mã chịu trách nhiệm vận chuyển
5

11. Luận văn thạc sĩ sinh học
> • • Đào Thị Như Hoa
RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ, có khối lượng phân tử khoảng 56 kDa, tồn
tại trong các hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA trong hệ gen virus
tạo cấu trúc nucleocapsid đổi xứng xoắn bền vững.
> Phân đoạn 6 mã hóa tổng hợp protein NA - kháng nguyên bề mặt capsid
của virus. Chiều dài phân đoạn gen này thay đổi theo từng chủng virus cúm A (ở
cúm A/H6N2 là 1413 bp, ở cúm A/H5N1 thay đổi khoảng từ 1350 - 1410 bp).
Cùng với kháng nguyên HA, NA đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự lây
nhiễm của virus trong tế bào vật chủ, giúp quá trình nhân lên của virus diễn ra
nhanh hơn và giải phóng hạt virus ra khỏi tế bào bị nhiễm.
> Phân đoạn 7 có kích thước khoảng 1027 bp, mã hóa cho protein Mcủa
virus gồm hai tiểu phần là MI và M2 được dịch mã từ những khung đọc mở khác
nhau của cùng một phân đoạn RNA. Protein MI là protein nền, thành phần chính
của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào quá
trình nảy chồi của virus. Protein M2 là chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử là
11 kDa. Đây là protein xuyên màng cần thiết cho quá trình lây nhiễmcủa virus và
chịu trách nhiệm cởi áo virus trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ.
> Phân đoạn 8 mã hóa tổng hợp protein không cấu trúc. Phân đoạn này có độ
dài ổn định nhất trong hệ gen của virus cúm A, kích thước khoảng 890 bp, mã hóa
tổng hợp hai protein NS1 và NS2 có vai trò bảo vệ hệ gen của virus. Protein NS1 có
khối lượng phân tử khoảng 27 kDa, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA thông tin
của virus từ nhân ra bào tương tế bào nhiễm và tác động lên các RNA vận chuyển
cũng như các quá trình cắt và dịch mã của tể bào chủ, ức chế sự cắt dán tiền RNA
thông tin. Ngoài ra, NS1 có thể ức chế đáp ứng interferon trong các tế bào nhiễm
virus, làm cho sự sinh sản virus không bị cản trở. NS2 là protein được dịch mã từ
hai đoạn gen, khối lượng phân tử khoảng 14 kDa, đóng vai trò vận chuyển các RNP
của virus ra khỏi nhân tế bào nhiễm để lắp ráp với capsid tạo nên hạt virus mới.
1.1.3. Các kháng nguyên quan trọng của virus cúm
1.1.3.1. Hemagglutinin (HA)
HA là kháng nguyên bề mặt chủ yếu của virus cúm và là đích để kháng thể
6

12. Luận văn thạc sĩ sinh học Đào Thị Như Hoa
trung hòa. Nó đóng vai trò gắn virus vào thụ thể tế bào vật chủ, hòa tan màng tế
bào, giải phóng RNA hệ gen để thực hiện quá trình nhân lên trong tế bào cảm
nhiễm. Có tới 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của virus. Mỗi phân tử có dạng
hình trụ, dài khoảng 130 A°, cấu tạo gồm ba đom phân. Mỗi đơn phân được tạo
thành dưới hai đơn vị HAI và HA2 liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide. Tiểu
phần HA2 có dạng sợi, đóng vai trò gắn kháng nguyên vào màng virus. Phần đầu tự
do hình chỏm cầu được tạo bởi tiểu đơn vị HAI. Tiểu phần này có chứa những thụ
thể đặc hiệu, đóng vai trò gắn virus vào màng tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm.
Đoạn polypeptide liên kết giữa hai tiểu phần HAI và HA2 là trình tự nhận biết của
một số protease trong tế bào vật chủ. Đổi với chủng virus thể độc lực cao (Highly
Pathogenic Avian Influenza, HPAI), vị trí liên kết hai tiểu phần HA thường là một
chuỗi amino acid kiềm, dễ dàng bị cắt bởi các protease thông thường có mặt trong
nhiều loại mô tế bào và các cơ quan khác nhau trong cơ thể (Hình 1.3). Do đó, virus
có thể nhân lên trong toàn bộ cơ thể, gây nguy hiểm tới tính mạng vật chủ [3,4].
Hình 1.3: Mô hình cấu trúc phân tử HA
Các nhà khoa học đã phát hiện 17 loại HA gây bệnh ở gia cầm và vật nuôi,
nhưng chỉ có 3 loại là có khả năng gây bệnh ở người (H l, H2 và H3). Sự phù hợp
cấu hình không gian giữa thụ thể chứa axít sialic của tế bào đích với vị trí gắn thụ
thể này trên phân tử HA của virus cúm quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus
đối với các loài vật chủ khác nhau. Ở hầu hết các loại virus cúm lưu hành trong tự
7

13. Luận văn thạc sĩ sinh học
•________ •__________ » Đào Thị Nhu Hoa
nhiên, vị trí amino axít 226 và 228 của tiểu phần HAI quyết định khả năng liên kết
của protein HA với thụ thể đặc hiệu trên màng tế bào chủ. Sự thay đổi các amino
axít trên làm thay đổi thụ thể đặc trưng của virus, giúp virus vượt qua rào cản loài
và thích ứng với một loại vật chủ mới. Protein HA của virus cúm gia cầm chứa gốc
Glutamine 226 và Glycine 228 hình thành nên một dạng hốc hẹp phù hợp để gắn
thụ thể axít sialic dạng a2,3- Trong khi đó, chủng virus gây bệnh ở người chứa
Leucine 226 và Serine 228 hình thành nên một dạng hổc rộng để thích hợp với axít
sialic dạng a2,6. Do đó, đột biến điểm trên HA có thể chuyển đổi đặc tính gắn thích
hợp sang axít sialic dạng a2,6. Đây chính là điều kiện cần để chúng tiến hóa thành
một chủng có khả năng gây nên dịch cúm ở người [39].
ỉ .1.3.2. Neurominidase (NA)
Protein neuraminidase còn gọi là sialidase là một protein có bản chất là
glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm A, mang tính kháng
nguyên đặc trưng theo từng phân type NA [4,6]. Có khoảng 100 phân tử NA xen
giữa các phân tử HA trên bề mặt capsid hạt virus. Phân tử NA có dạng nút lồi hình
nấm, đầu tự do (chứa vùng hoạt động) gồm 4 tiểu phần dưới đơn vị giống như hình
cầu nằm trên cùng một mặt phẳng, và phần kị nước gẳn vào vỏ capsid. Protein NA
có vai trò là một enzym cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào nhiễm
với phân tử cacbonhydrate của protein HA, giải phóng hạt virus ra khỏi màng tế bào
vật chủ, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể vật chủ, và ngăn cản sự tập
hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào. Mặt khác, NA tham gia vào phân cắt
liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy nhanh quá trình cởi áo “uncoating”
giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào, giúp cho quá trình nhân lên
của virus diễn ra nhanh hơn. Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải
phóng neuraminic acid làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo
điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức
chế không đặc hiệu. Cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3 khâu tác động
trên của NA đều tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh của virus cúm A ở cơ thể
vật chủ. Do đó, NA là đích tác động của các thuốc, hóa dược ức chế virus không
8

14. Luận văn thạc sĩ sinh học Đào Thi Như Hoa
đặc hiệu hiện nay, đặc biệt là Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu) phong tỏa enzym
này, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới khỏi các tế bào đích, bảo vệ cơ. Bên cạnh
đó, NA còn là một kháng nguyên bề mặt của virus, tham gia kích thích hệ thống
miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các
chủng virus đương nhiễm có tác dụng phong tỏa protein NA [4], Như vậy, kháng
nguyên NA cùng với kháng nguyên HA của virus là các đích chủ yếu của cơ chế
bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus cúm A, và là cơ sở điều chế các vaccine
phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm, nhàm ngăn chặn dịch cúm ở gia cầm và
hạn chế lây truyền sang người.
Men neuraminidase có dạng nút lồi hình nấm trên bề mặt virus. Nó có một
đầu gồm 4 bán đơn vị hình dạng gần hình cầu trên cùng mặt phẳng, và một vùng kị
nước gẳn vào bên trong màng virus. Đây là gen mã hóa tổng họp protein NA, kháng
nguyên bề mặt capsid của virus, có khối lượng phân tử khoảng 50.103 Dal. Các
nghiên cứu phân tử gen NA của virus cúm cho thấy phần đầu 5’- của gen này (hay
phần tận cùng N của polypeptide NA) có tính biến đổi cao và phức tạp giữa các
chủng virus cúm A, sự thay đổi này liên quan đến quá trình thích ứng và gây bệnh
của virus cúm trên nhiều đối tượng vật chủ khác nhau. Đặc trưng biến đổi của gen
NA trong virus cúm A là hiện tượng đột biến trượt-xóa một đoạn gen là 57
nucleotide, rồi sau đó là 60 nucleotide, làm cho độ dài vốn có trước đây của NA(N1) là
1410 bp còn 1350 bp [4,6],
1.1.3.3. Matrix protein ( M l) của virus cúm
Protein nền MI là thành phần chính của virion virut, nó bao quanh vRNP,
liên kết vRNP với vỏ virut và kênh ion. MI là một protein khá bền vững gồm 252
amino acid. Nó có hai vùng hình cầu (từ acid amin 1 đến 164 và từ 165 đến 252)
liên kết với nhau qua một vùng nhạy cảm với protease. cấu trúc của protein MI chủ
yếu là dạng xoắn.
Protein M l không chỉ là thành phần cấu trúc cần thiết của virion mà còn
đóng vai trò quan trọng trong chu trinh sống virut:
9

15. Luận văn thạc sĩ sinh học Đào Thị Như Hoa
> Tương tác với vRNP và NS2 và vận chuyển vRNP ra vào nhân. M l là yếu
tố điều chỉnh quá trình xuất nhập này. Sau khi virut đi vào endosome dưới tác dụng
của pH thấp do sự vận chuyển của ion H+ qua kênh ion M2 của virut và phức hợp
M l-vRNP bị phân tách hoàn toàn cho phép vRNP đi vào nhân. Ngược lại, khi các
vRNP mới được tạo thành trong nhân thì M I và NS2 sẽ đi vào nhân và kết họp với
vRNP cùng được vận chuyển ra khỏi nhân. Sự tương tác của MI với RNP đã được
nghiên cứu khá rõ. Hai domain trong MI bám vào RNA được xác định ở hai vùng
dộc lập: ngón tay kẽm (a zinc finger motif, ở vị trí amino acid 148 tới 162) và một
chuỗi amino acid RKLKR (ở vị trí amino acid 101 tới 105). Điều hoà sao chép
vRNP; vRNP chỉ được sao chép khi tách khỏi M l.
> Tương tác với protein vỏ của virut: HA, NA, M2 trong quá trình nảy chồi.
Huy động các thành phần của virut tới vị trí lắp ráp và khởi đầu nảy chồi. M l là yếu
tố trung tâm trong việc lắp ráp các thành phần của virut. Phân tử MI liên kết với
vRNP, màng tế bào qua các đuôi hướng tế bào chất của cả hai glycoprotein bề mặt
HA và NA, các phân tử M 1 khác thì tạo thành một lớp dưới lớp vỏ bọc của virut.
Liên kết của MI với màng dựa vào sự tổ hợp của cả hai tương tác tĩnh điện và kị
nước cũng như sự tương tác của protein đặc hiệu với protein vỏ. Huy động các
thành phần tế bào chủ cho việc hoàn thành nảy chổi và giải phóng virut. Tỉ lệ
M l/N P của phân tử virut ảnh hưởng đến hình thái của virion và sự lan truyền của
virut khi được giải phóng.
1.1.4. Tình hình dịch bệnh H5N1
Sự bùng phát của các chủng virus cúm A/H5N1 độc lực cao gần đây và khả
năng lây lan của loại virus chết người này sang người, đang làm tăng thêm mối lo
ngại về một trận đại dịch cúm mới có thể tái hiện như đại dịch cúm lịch sử H IN I
xảy ra vào năm 1918 tại Tây Ban Nha giết chết hơn 50 triệu người trên toàn thế
giới. Theo thông báo mới nhất của tổ chức Y tế thế giới (WHO), tính đến thời điểm
hiện tại, cúm gia cầm đã lan tràn trên 100 quốc gia. Tại các nước Đông Nam Á,
cúm H 5N 1 đã và đang gây tổn thất to lớn cho ngành chăn nuôi. Hàng trăm triệu gia
10

16. Luận văn thạc sĩ sinh học Đào Thi Như Hoa
súc, gia cầm bị chết hoặc bị thiêu hủy do nhiễm virus này. Điều đặc biệt nguy hiểm
là các chủng virus cúm gia cầm này đã có biến đổi lớn về mặt di truyền, tăng khả
năng lây nhiễm và gây tử vong cho người. Các số liệu thống kê gần đây cho thấy,
đã có hơn 400 ca lây nhiễm trên người và tỷ lệ tử vong lên đến hơn 60%, cao hơn
rất nhiều so với tỷ lệ tử vong 2.5-5% của dịch cúm lịch sử Tây Ban Nha năm 1918
[7, 8, 23, 46, 48]. Năm 1997, 18 người đầu tiên được phát hiện nhiễm cúm A/H5N1
và 6 người trong số đó đã tử vong [46]. Đợt dịch tái diễn vào năm 2003 làm 4
người nhiễm bệnh và cả 4 người sau đó tử vong. Trong giai đoạn từ năm
2003-2005, cúm A/H5N1 bùng phát trên diện rộng ở 9 nước châu Á làm 19 ca
nhiễm ở Thái Lan, 91 ca ở Việt Nam, 7 ca ở Indonesia và 4 ca ở Campuchia giết
chết 62 người [54]. Đến năm 2009, số trường hợp lây nhiễm H5N1 đã lên đến 417
người và làm tử vong 257 người trong số đó [24]. Theo thông báo của Tổ chức thú
y quổc tế (OIE), đến tháng 03 năm 2010, bảy tỉnh thành tại Việt Nam công bố cúm
gia cầm tái suất hiện làm chết hom 6 nghìn và làm tiêu hủy hơn 14 nghìn gia cầm.
Số trường hợp nhiễm và tử vong do H5N1 vẫn không ngừng gia tăng. Ca tử vong
gần đây nhất liên quan đến H5N1 được ghi nhận tại Việt Nam là một bệnh nhân nữ,
phát hiện vào tháng 2 năm 2010 [24].
1.2. Vaccine phòng chống cúm
1.2.1.Đại cưong về vaccine
Mỗi khi dịch cúm bùng phát, các quốc gia thường có những biện pháp kiểm
soát vệ sinh như đeo khẩu trang, rửa tay bằng xà phòng đặc biệt là sau khi ho, hắt
hơi vì vi rút cúm A/H5N1 có sức đề kháng yếu, dễ bị bất hoạt bởi bức xạ mặt trời,
tia cực tím và các chất tẩy rửa thông thường (xà phòng, chất tẩy Natri hypochlorite
0,05%, cồn ethanol 70% ...). Đồng thời tiến hành tiêu hủy gia súc bị nhiễm bệnh
hoặc nghi là bị nhiễm tại khu vực có dịch. Tuy nhiên, việc làm này là chưa đủ để
ngăn chặn sự lây lan của dịch bệnh, đặc biệt là những khu đông dân cư và có mật độ
động vật nuôi cao vì virus cúm A/H5N1 có thể tồn tại hàng giờ ở ngoại cảnh, đặc
biệt khi thời tiết lạnh. Ngoài ra còn ảnh hưởng nặng nề tới nền kinh tế mỗi quốc gia
11

17. Luận văn thạc sĩ sinh học Đào Tlti Như Hoa
và đặc biệt là người nông dân, môi trường sinh thái bị ô nhiễm ảnh hưởng tới sức
khỏe con người. Trên thực tế, thế giới đã sử dụng phổ biến một số loại thuốc dùng
trong điều trị cúm A, cơ chế hoạt động của thuốc dựa trên chu trình hoạt động của
virus cúm. Cụ thể là:
> Amantadine và Rimantadine: Đây là hai loại thuốc cản trở sự hoạt động của
kênh ion M2. Dan tới ức chế quá trình cởi bỏ lớp vở ngoài của virus. vRNP không
được đưa vào nhân cài xen vào gemone của tế bào chủ. Ở nồng độ nhỏ Amantadine
gây hiệu quả cao với virus cúm A song kém hiệu quả với virus cúm B và c ( do sự
khác biệt về kênh ion). Amantadine còn hoạt động như một bazơ yếu, trung hòa H+
trong endosome và bộ máy golgi. Trong hai loại thuổc này thì Rimantadine được sử
dụng phổ biến hốn vì gây ít tác dụng phụ. Tuy nhiên thực tế chúng đều gây tác đông
phụ tới hệ thần kinh đồng thời cũng xuất hiện những chủng cúm kháng thuốc. Sự
kháng thuốc này chủ yếu liên quan tới các đột biến xảy ra trong trình tự nucleotid
mã hóa cho kênh M2.
> Leptomycine B: Cơ chế của loại thuốc này là ngăn cản sự vận chuyển
vRNP ra khỏi nhân tế bào.
> Zanamivir (Relenza) và Tamiflu (Oseltmavir): hai loại này có cấu hình
không gian tương tự như NA. Do vậy chúng ngăn cản sự liên kết của NA với các
thụ thể sialic acid, cản trở quá trình giải phóng virus, ức chế sự lan nhiễm virus.
Việc tiêm phòng được xem là lựa chọn đầu tiên để chống lại sự xâm nhiễm
và lây lan của dịch cúm. Trên thế giới có nhiều quốc gia tham gia vào việc nghiên
cứu sản xuất vaccine phòng cúm , chủ yếu tập trung ở những nước phát triển như:
Mỹ, Pháp, Đức, Hà Lan,... Với mỗi loại vaccine, yêu cầu cơ bản là phải có tính
miễn dịch bảo hộ, tính kháng nguyên, tính đặc hiệu và tính không độc. Việt Nam
đang trong giai đoạn tập duyệt sản xuất vaccine để phòng cúm H5N1. Các vắc-xin
ngừa bệnh cúm mùa trước đây không có hiệu quả đối với cúm A /H5N1 mới. Các
vaccine phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vaccine truyền thống và
vaccine thế hệ mới.
12

18. Luận văn thạc sĩ sinh học Đào Thị Như Hoa
1.2.2. Vaccine truyền thống
- Vaccine bất hoạt:
Vaccine này được tạo ra từ các chủng virus ngoài tự nhiên, đã bị làm bất hoạt
bằng các tác nhân lý hóa khác nhau và không còn khả năng nhân lên trong vật chủ.
Hiện nay, phương pháp tạo vaccine này được sử dụng phổ biến nhất là nuôi virus
trong trứng rồi làm bất hoạt bằng các tác nhân vật lý như: nhiệt độ, sóng siêu âm, tia
tử ngoại, hay các tác nhân hóa học như: các loại thuổc nhuộm, axít, formol. Loại
vaccine này có ưu điểm dễ sản xuất và bảo quản, giá thành rẻ, độ an toàn cao. Tuy
nhiên, nhược điểm lớn của loại vaccine này là gây đáp ứng miễn dịch ngắn hạn, cần
tiêm nhắc lại nhiều lần, khả năng sinh đáp ứng miễn dịch chậm, lượng vaccine tiêm
mỗi lần nhiều và hiệu quả không cao [2].
- Vaccine giảm độc lực:
Là loại vaccine đã được làm nhược độc hoặc vô độc nhưng vẫn bảo toàn tính
kháng nguyên. Thường vaccine được tạo từ các loại virus đã bị làm mất các gen quy
định tính độc, do đó không còn khả năng gây bệnh nhưng vẫn còn khả năng gây đáp
ứng miễn dịch. Vaccine này có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch nhanh chóng và
tốt hơn vaccine bất hoạt, tác dụng bảo vệ phòng bệnh hiệu quả, không phải tiêm
nhắc nhiều lần. Theo một số nghiên cứu, loại vaccine này có khả năng bảo vệ chéo
giữa các chủng virus cúm A khác nhau. Tuy nhiên, mức độ an toàn của loại vaccine
này thấp hơn so với vaccine bất hoạt do có khả năng biến đổi thành kiểu hoang dại
và gây bệnh ở vật chủ [2].
1.2.3. Vaccine thế hệ mói:
- Vaccine tái tổ hợp:
Các gen mã hóa cho kháng nguyên virus có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch
bảo hộ được đưa vào các hệ biểu hiện khác nhau như: vi khuẩn, nấm men, tế bào
động vật hay virus để tổng hợp. Các kháng nguyên sau khi tổng họp ra có thể được
sử dụng làm vaccine. Vaccine TrovacAIV - H5 của hãng Merial (Pháp), được tạo
ra từ gen H5 của chủng A/Turkey/IrelDNA/83 (H5N2) là một ví dụ về loại vaccine
13

19. Luận văn thạc sĩ sinh học
I __________ •_______________ •
Đào Thi Như Hoa
•
___
tái tổ hợp. Loại vaccine này được sử dụng được cho gia cầm lúc 1 ngày tuổi và có
khả năng bảo vệ trong hơn 20 tuần, hiện được sử dụng rất rỗng rãi. Tại Việt Nam,
vaccine TrovacAIV-H5 được áp dụng tiêm phòng cúm cho gà từ năm 2006 [2].
- Vaccine DNA:
Gen mã hóa kháng nguyên gây bệnh của virus được gắn vào một vector biểu
hiện cùng với một promoter mạnh có khả năng biểu hiện tốt trong tế bào vật chủ.
Khi biến nạp thành công vào vật chủ, protein kháng nguyên sẽ được tổng hợp ra từ
gen mã hóa cho kháng nguyên và kích thích cơ thể sinh miễn dịch chống lại protein
đó. Vaccine DNA rất gọn nhẹ, an toàn, phương thức gây miễn dịch đơn giản do chỉ
chứa DNA thuần khiết nên bền với nhiệt độ [2],
- Vaccine virus nhược độc nhân tạo sản xuất bằng kĩ thuật di truyền ngược:
Phương pháp này được áp dụng cho virus có hệ gen gồm một sợi RNA gồm
nhiều phân đoạn nhỏ. Các phân đoạn được lắp ghép tạo thành virus với đầy đủ hệ
gen. Trong đó, các gen kháng nguyên H5 có vùng độc được biến đổi bằng kỹ thuật
gen. Có 3 loại vaccine đã được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công nhận về độ an
toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản xuất vaccine trên thế giới hiện nay đó
là NIBRG - 14 (NIBSC), VN/04xPR8 - rg (SJCRH) và VNH5N1 - PR8/CDC - rg
(CDC) [2].
- Vaccine dưới đơn vị:
Là loại vaccine chỉ sử dụng một phần của hạt virus để kích thích đáp ứng
miễn dịch. Do các kháng nguyên đã được tinh chế khi sử dụng làm vaccine nên có
độ an toàn cao, không gây các phản ứng phụ. Quy trình sản xuất lượng lớn vaccine
dưới đơn vị khá đơn giản, không đòi hỏi trang thiết bị phức tạp và đắt tiền [2].
1.3. Hạt giả virus - VLPs
1.3.1. Phương pháp tạo VLPs
Để tạo ra các VLPs, người ta thường sử dụng các protein có tính sinh miễn
dịch cao của virus gây bệnh, thông thường là các protein bề mặt. Các gen mã hóa
cho các kháng nguyên quan trọng của virus sẽ được thiết kế vào baculovirus
14

20. Luận văn thạc sĩ sinh học Đào Thị Như Hoa
transfer vector. Các vector này sau đó được đồng chuyển nạp (co-transfect) với
DNA của baculovirus đã được xử lý với enzyme Bsu36 I để loại bỏ đầu c của
ORF 1269, promoter polyhedrin và polyhedrin ORF. Việc xử lý với Bsu36 I đã loại
bỏ các thành phần quan trọng cho sự tổng họp và nhân lên của baculovirus trong tế
bào chủ. Cách duy nhất để DNA của baculovirus có thể tổng hợp lên virus khi được
đưa vào trong tế bào nuôi cấy là chúng phải được bổ sung lại vùng bị loại bỏ này.
Do đó khi đồng chuyển nạp với baculovirus transfer vector, các vùng thiết yếu
(ORF 1629) sẽ được bổ sung từ vector này bằng cơ chế tái tổ hợp trình tự tương
đồng tạo lên các virus tái tổ họp biểu hiện ra protein cần nghiên cứu (gen of interest
- GOI) (Hình 1.4).
C ircu lar Bsc-N-Blu«* D N A
p M 3 Ssu361 pPH ß*u3e I fi
R estrict w ith B su 36 I
R ecom b in ation
R ecom b in an t A cM N P V D N A
p«03 PETL Pp h Piea*
Hình 1.4: Sơ đồ tái tổ hợp giữa DNA của baculovirus và baculovirus transfer vector
để tạo VLPs.
1.3.2. Các hệ thống biểu hiện tạo VLPs
Có nhiều hệ thống biểu hiện để sản xuất VLPs bao gồm: các dòng tế bào
động vật có vú; tế bào côn trùng; các chủng nấm men khác nhau như
Saccharomyces cerevisiae và Pichia pastoris, Escherichia coli và vi khuẩn khác.
Vaccine VLP theo đường miệng (vaccine HBV, vaccine virus Norwalk) đã được tạo
15

21. Luận văn thạc sĩ sinh học
• _ ______•__________ • Đào Thị Như Hoa
ra từ các loài thực vật khác nhau bao gồm thuốc lá, rau diếp và khoai tây [26, 31,
47]. Các hệ thống biểu hiện này đều có những ưu và nhược điểm riêng. Việc dễ
dàng trong biểu hiện, khả năng mở rộng quy mô và chi phí sản xuất thấp đã khiến
nấm men là một lựa chọn phổ biến, tuy nhiên xét về các yếu tố khác như glycosyl
hóa, gấp nếp (folding) chính xác các protein tái tổ hợp biểu hiện ra và quá trình lắp
ráp thành các hạt giả virus cũng như tối ưu hóa codon...hệ thống này vẫn bộc lộ
những hạn chể, vì vậy đòi hỏi cần có hệ thống sản xuất thay thế tối ưu hơn.
Escherichia coli có un điểm là dễ dàng nuôi cấy, đòi hỏi thiết bị và môi trường nuôi
cấy rẻ tiền...nhưng protein biểu hiện ở hệ thống này không được glycosyl hóa,
trong khi nấm men và baculovirus bị hạn chế bởi khả năng sửa chữa sau dịch mã
đặc biệt là với các glycoprotein có mannose cao và khả năng này đôi khi không ổn
định.
VLP sản xuất trên hệ thống biểu hiện baculovirus mang nhiều ưu điểm như
khả năng sửa chữa sau dịch mã, quá trình gấp nếp protein...tuy nhiên hệ thống này
cũng tạo ra các thách thức trong việc tinh sạch các VLP ra khỏi baculovirus, vì cả
hai đều có kích thước tương tự nhau 80-120 nm [40]. Hệ thống nuôi cấy tế bào
động vật có vú đang được ưa chuộng bởi khả năng sửa chữa sau dịch mã và lẳp ráp
các VLP chính xác, nhưng chúng lại là hệ thống khó kiểm soát và tốn kém cho sản
xuất. Hệ thống Retrovirus có xu hướng mang các protein màng tế bào không mong
muốn trong vỏ của chúng trong quá trình lắp ráp virus. Hướng nghiên cứu sản xuất
tương lai có thể là việc lắp ráp VLPs từ các protein của virus trong ống nghiệm
bằng phương pháp hóa học [37].
1.3.3. Vaccine VLPs
Các vaccine được sản xuất theo công nghệ truyền thống đều dựa vào việc tạo
ra virus nhược độc (attenuated) hoặc virus bất hoạt (inactivated). Cả hai loại vaccine
này đều tạo ra các đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ, tuy nhiên đều có những hạn chế
nhất định. Với vaccine nhược độc, khả năng virus suy yếu hồi tính trở thành virus
độc lực còn đối với vaccine bất hoạt nguy cơ ẹn sót các virus chưa được bất hoạt
16

22. Luận văn thạc sĩ sinh học
• • • Đào Thị Nhu Hoa
hoàn toàn là những vấn đề lớn đặt ra các với các nhà sản xuất. Ngoài ra, việc tạo ra
được một lượng lớn virus cung cấp cho sản xuất vaccine ỉà vấn đề rất khó khăn, đặc
biệt khi không có hệ thống nuôi cấy mô phù hợp cho phép virus sao chép hiệu quả.
Với sự tiến bộ của công nghệ tái tổ hợp, người ta tổng hợp được các thành phần
riêng lẻ của virus và sử dụng các cấu phần virus này để sản xuất các vaccine tái tổ
hợp. Tuy nhiên các vaccine dựa vào các protein đom lẻ có hiệu quả quá thấp so với
vaccine virus toàn phần. Các vaccine dưới đơn vị thường hỏi liều kháng nguyên
cao, mang tính lập lại thường xuyên và cần phải kết hợp với các tá chất khác. Bên
cạnh đó, việc tổng hợp được các protein tái tổ hợp có tính sinh miễn dịch giống với
virus tự nhiên cũng rất khó khăn mặc dù hiện nay đã phát triển được các hệ thống
biểu hiện ở tế bào bậc cao cho phép protein tái tổ hợp biểu hiện ra có thể được sửa
chữa sau dịch mã, gấp nếp để tổng hợp ra các protein có cấu trúc giống với cấu trúc
tụ nhiên của chúng.
Với sự tiến bộ của công nghệ DNA tái tổ hợp, các nhà khoa học đã phát triển
được các vaccine mới như dùng công nghệ DNA tái tổ hợp loại bỏ các vùng độc của
virus tạo ra các chủng virus sản xuất vaccine an toàn trên trứng gà có phôi (ví dụ
vaccine cúm A/H5N1), hay tạo chủng vaccine bằng kỹ thuật di truyền ngược. Đây
được coi là bước đột phá trong công nghệ sản xuất vaccine. Mặc dù vậy, tương tự
như vaccine sản xuất bằng công nghệ truyền thống như đã nêu ở trên, cả 2 loại
vaccine này đều có những mặt hạn chế cần khắc phục. Vaccine sản xuất trên trứng
gà có phôi đỏi hỏi thời gian lâu, hiệu suất thấp...đặc biệt trong trường hợp đại dịch
xẩy ra sẽ không thể đáp ứng đủ yêu cầu. Vaccine sản xuất bằng kỹ thuật di truyền
ngược đã khắc phục được những hạn chế trên. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều lo ngại về
tính an toàn cũng như khả năng chủng vaccine này có thể tái tổ hợp với chủng đang
lưu hành tạo ra loại virus mới với những đặc tính mà chúng ta chưa kiểm soát được.
Quan sát thực nghiệm cho thấy nhiều protein cấu trúc của virus có khả năng
tự lắp ghép lại với nhau hình thành các hạt giả virus (VLPs) có cấu trúc giống với
các virus lây nhiễm tự nhiên, hoặc trong một số trường hợp tạo thành các hạt dưới
virus . Quan sát này đã mở ra một hướng nghiên cửu riầy triển vọng trong phát triển
17

23. Luận văn thạc sĩ sinh học Đào Thị Như Hoa
các vaccine thế hệ mới đó là tạo các vaccine VLPs. Vaccine VLPs kết hợp các ưu
điểm của vaccine virus toàn phần và các vaccine dưới đơn vị tái tổ hợp. VLPs có
cấu trúc tương tự như virus tự nhiên nhưng do thiếu vật liệu di truyền (axit nucleic)
của virus nên chúng hoàn toàn không có khả năng lây nhiễm (Hình 1.5). VLPs có
thể được tạo ra bàng công nghệ tái tổ hợp trong các hệ thống biểu hiện mà không
phụ thuộc vào sự sao chép của virus. Ví dụ, VLPs của virus gây ung thư cổ tử cung
ở người (human papillomavirus-HPV) không chỉ được tạo ra trong tế bào động vật
có vú mà còn ở nhiều hệ thống nuôi cấy khác như vi khuẩn, nấm men, thực vật
chuyển gen và baculovirus/tế bào côn trùng [13, 22, 35, 53]. Do cấu trúc đồng nhất,
các hạt VLPs có thể dễ dàng được tinh sạch bàng phương pháp ly tâm siêu tốc
gradient hoặc bàng phương pháp sắc ký phân tách dựa vào kích thước (size-
exclusion chromatography).
Hình 1.5: Sơ đồ minh họa cấu trúc của hạt virus tự nhiên (native virus) và hạt giả
virus (virus-like particles). Virus tự nhiên có mang vật liệu di truyền (các axit
nucleic) nên có khả năng sao chép, trong khi đó VLPs chỉ được tạo ra bởi các
protein cấu trúc của virus và thiếu vật liệu di truyền do đó chúng không có khả năng
tự sao chép và lây nhiễm.
Điều quan trọng nhất là VLPs có tính sinh miễn dịch cao. Với các ưu điểm
trên, vaccine VLPs được xem là vaccine tiềm tàng trong việc phòng chống một số
bệnh virus mà cho đến nay con người chưa tìm hệ thống nuôi cấy tế bào thích hợp,
ví dụ như HIV ở người. Hiện trên thị trường có hai loại vaccine VLPs đã được
18

24. Luận văn thạc sĩ sinh liọc
_
• i_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
>
Đào Thị Như Hoa
thương mại hóa đó là vaccine VLP viêm gan B và vaccine VLP ung thư cổ tử cung.
Vaccine VLP viêm gan B với tên thương mại Recombivax (Merck & Co., Inc.) và
Energix (GlaxoSmithKline [GSK]), được FDA thông qua vào những năm 1980, là
những hạt dưới virus có kích thước 22 nm tạo ra bởi sự tự lắp ghép của kháng
nguyên bề mặt chính của virus viêm gan B (HBsAg). Trong khi đó, vaccine VLP
ung thư cổ tử cung được tạo ra bởi các hạt giả virus cấu tạo từ protein lõi LI của
HPV. Cả hai vaccine này đều có độ an toàn lý tưởng, hiệu lực cao và tạo ra đáp ứng
kháng thể lâu dài. Sau 4 năm, qua các thử nghiệm lâm sàng của Merck và GSK, đã
chứng minh được rằng vaccine VLP ung thu cổ tử cung có khả năng bảo vệ vật chủ
lâu dài chống lại sự lây nhiễm của HPV và tạo ra lượng kháng thể ổn định và cao
hơn ít nhất 10 lần so với lượng kháng thể được tạo ra do lây nhiễm tự nhiên [20,
30]. Kết quả tương tự cũng được quan sát thấy sau 10 năm tiêm vaccine VLP viêm
gan B [16].
Tại sao VLPs lại có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh như thế? Câu
hỏi này có thể được lý giải do VLPs được tạo ra bởi một hoặc nhiều protein được
sắp xếp về phương diện hình học thành một dãy protein tập trung, dầy đặc và lập
lại. Đây là cấu trúc độc đáo và duy nhất của các kháng nguyên vi sinh vật; trải qua
hàng triệu năm tiến hóa hệ thổng miễn dịch của động vật có vú đã được huấn luyện
để nhận biết và phản ứng mạnh mẽ lại cấu trúc kháng nguyên này giúp bảo vệ
chúng khỏi sự tấn công của các tác nhân gây bệnh vi sinh vật. Ví dụ tế bào B có thể
nhận biết đặc hiệu và tạo đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ đổi với các tác nhân gây bệnh
được sắp xếp theo dãy có tổ chức, liền kề nhau và lập lại, một dạng cấu trúc đặc thù
của bề mặt virus [10, 18]. Người ta tin rằng các kháng nguyên có tính lập lại cao
(highly repetitive antigens) kích thích các phân tử globulin miễn dịch liên kết màng
gắn lại với nhau tạo chuỗi oligo hình thành thụ thể tế bào B (B cell receptor-BCR)
[10]. Sự liên kết chéo của globulin miễn dich Ig thông qua kháng nguyên đa phân
(multivalent antigens) dẫn đến sự hình thành của các tiểu vùng tín hiệu-BCR bền
vững [49]. Tín hiệu này kích thích sự sinh trưởng và di chuyển của tế bào B, kích
hoạt cả MHC lớp II các phân tử truyền tải tín hiệu cho phép tế bào B tương tác với
19

25. Luận văn thạc sĩ sinh học Đào Thị Như Hoa
các tế bào trợ bào T (T-helper cells) làm tiết ra IgG và tạo ra các tế bào ghi nhớ B
tồn tại lâu dài (long-lived memory B cells). Kết quả là các kháng nguyên đa phân có
thể kích thích tế bào B ở nồng độ thấp hơn rất nhiều so với các kháng nguyên đơn
phân (monomeric antigens) [12, 14, 33]. Mặt khác, rất nhiều loại VLPs bao gồm cả
VLP HPV không cần phải kết hợp với các tá chất khác để gây ra đáp ứng miễn dịch
mạnh mẽ [21, 55].
Ngoài khả năng kích thích đáp ứng tế bào B, VLPs còn gây ra đáp ứng tế bào
T hiệu quả thông qua sự tương tác với các tể bào trình diện kháng nguyên (APC),
đặc biệt là tế bào đuôi gai (dendritic cells-DCs). Sử dụng các hạt nano cộng hợp,
người ta đã chứng minh được rằng các tế bào đuôi gai tiếp nhận tốt nhất các các
kháng nguyên có đường kính sấp sỉ 40 nm, kích thước phổ biển của hầu hết các
virus [19]. Hơn nữa, một số loại VLPs thường hướng tới các tế bào đuôi gai tốt hơn
với các tế bào khác. Ví dụ chỉ trong 90 phút sau khi tiêm VLP parvovirus lợn qua
tĩnh mạch thì khoảng một nửa tế bào đuôi gai đã tiếp nhận các VLP này [34]. Một
khi đã được tiếp nhận bởi tế bào trình diện kháng nguyên, cũng giống như các
kháng nguyên ngoại lai khác, VLPs sẽ bị xử lý và được trình diện bởi các phân tử
MHC lớp II và hoạt hóa các tế bào trợ bào T. Ngoài ra, chính các VLPs chứ không
phải các protein dưới đơn vị của chúng có thể đi vào dịch nội bào tế bào đuôi gai,
tại đó chúng được xử lý và trình diện tới các lympho bào T độc (CTLs) bởi các
phân tử MHC lớp I [9,42], Một số loại VLPs có khả năng kích thích trực tiếp làm
cho tế bào gai trở lên thành thục cả về chức năng và hình thái. Ví dụ trong trường
hợp của VLPs virus ung thư cổ tử cung, chính các VLPs chứ không phải protein lõi
L 1 tái tổ hợp riêng rẽ, đơn vị cấu tạo lên VLPs này, có thể trực tiếp hoạt hóa các tế
bào đuôi gai [28,44] dẫn đến sự biểu hiện của các phân tử điều khiển đáp ứng miễn
dịch (costimulatory molecules) và cytokine. Đây là các chất đóng vai trìí quan trọng
trong việc hoạt hóa tế bío T CD8+. Các VLP HIV [50], virus Ebola [11] và virus
PPV [34] được thông báo là có thể kích thích sự thuần thục tế bào đuôi gai. Qua đây
ta thấy, hệ thống miễn dịch có nhiều cơ chế phân tử khác nhau giúp chúng có thể
đáp ứng mạnh mẽ lại các virus lây nhiễm.
20
Tải bản FULL (55 trang): https://bit.ly/3LSWjKY
Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net

26. Luận văn thạc sĩ sinh học Đào Thi Như Hoa
1.3.4. Cơ chế tạo đáp ứng miễn dịch của VLPs
Để tạo đáp ứng miễn dịch hiệu quả với hiệu giá kháng thể cao, các kháng
nguyên đích phải bộc lộ trên bề mặt VLPs với mật độ cao. Nhờ sự tiến bộ của các
ngành khoa học sinh học khác, đặc biệt là ngành sinh học cấu trúc, rất nhiều protein
của virus đã được phân tích cấu trúc do đó chúng ta có được lượng thông tín rất lớn
về các protein cấu trúc của virus và từ đó có thể cải biến VLPs theo hướng xác định,
tạo ra các VLPs hoạt động như những giàn trình diện kháng nguyên. Phương pháp
phổ biến nhất để tạo các VLPs mang cùng một lúc nhiều quyết định kháng nguyên
(epitopes) đó là dùng kỹ thuật gen để chèn các các gen kháng nguyên khác nhau vào
VLPs. Rất nhiều loại VLPs đã được cải biến để đạt mục đích trên và nhiều vaccine
VLPs đã được thử nghiệm thành công trên mô hình động vật chống lại các bệnh
virus như virus sốt xuất huyết (malaria) [45] và virus cúm [36]. Ưu điểm của kỹ
thuật lai ghép kháng nguyên này đó là khi đã chèn thành công gen kháng nguyên
ngoại lai vào VLPs thì đảm bảo kháng nguyên này sẽ được biểu hiện với cấu hình
tương tự với cấu hình tự nhiên của chúng và với mật độ cao trên bề mặt của VLPs.
Mặc dù vậy cũng có những khó khăn trong việc tạo các VLPs lai (chimeric VLPs).
Các peptit được chèn vào VLPs chỉ mang lại hiệu quả khi chúng được bộc lộ trên bề
mặt VLPs và không cản trở quá trình gấp nếp (folding) và lắp ghép của các protein.
Trong rất nhiều trường hợp, để có thể chèn các kháng nguyên ngoại lai và biểu hiện
được chúng trên bề mặt VLPs người ta thường thay thế các kháng nguyên này vào
đúng vị trị các epitop thiết yếu của virus mẹ. Tuy nhiên chúng ta không thể dự đoán
trước được liệu các peptit chèn vào này có tương thích với VLPs hay không và liệu
chúng có tính sinh miễn dịch không. Một hạn chế khác của kỹ thuật tạo VLPs lai đó
là chỉ chèn được các peptit có kích thước từ 20 đến 30 axit amin hoặc ít hơn, mặc dù
cũng có một số trường hợp ngoại lệ chèn được các peptit có kích thước lớn hơn [27].
VLPs còn có thể được sử dụng như các giá đỡ để gắn các hợp chất có bản
chất không phải là protein nhờ phản ứng cộng hóa trị. Khả năng các họp chất phi
protein có thể gắn vào VLPs là nhờ các nhóm amin hoặc sulfuhydryl trên bề mặt
của VLPs.
21
Tải bản FULL (55 trang): https://bit.ly/3LSWjKY
Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net

27. Luận văn thạc sĩ sinh học Đào Thi Như Hoa
Phương pháp phổ biến nhất mà các nhà nghiên cứu sử dụng đó là gắn các
hợp chất này vào các axit amin lysine trên protein vỏ bộc lộ trên bề mặt VLPs. Ví
dụ, bằng việc sử dụng các cầu nối liên kết chéo lưỡng chức (bifunctional cross­
linker) với “tay” hoạt động là các amin và sulfuhydryl, các peptit mang cysteine có
thể được gắn vào VLP MS2 hoặc VLP Qị3 bacteriophage hoặc các hạt HbsAg [15,
25]. Tương tự, các axit amin lysine bộc lộ trên bề mặt VLPs có thể được biotin hóa
và sau đó gắn vào các kháng nguyên đích đã biotin hóa nhờ phân tử “cầu nổi”
streptavidin [15, 29]. Ngoài ra người ta còn có thể cải biến tạo thêm các vị trị gắn
kết trên bề mặt VLPs. Bằng phương pháp này người ta đã tạo ra các VLP MS2 và
VLP virus cowpea mosaic chỉ chứa một axit amin cystein bộc lộ trên bề mặt [38,
52], Các VLPs mang cystein này có thể gắn kết dễ dàng với các kháng nguyên đã
biến đổi có các nhóm maleimit hoạt hóa sulfhydryl. Nói chung, kỹ thuật này được
áp dụng linh hoạt tùy vào nguồn gốc và đặc điểm của các VLPs khác nhau.
Điều quan trong nhất là chúng ta phải xác định được các quyết định kháng
nguyên quan trọng của các virus gây bệnh và biểu hiện được chúng ở cấu hình
giống với cấu hình tự nhiên của chúng. Ưu điểm nổi bật của việc gắn các hợp chất
phi protein vào VLPs bằng phản ứng cộng hóa trị là chúng ta có thể gắn nhiều loại
kháng nguyên với các kích thước khác nhau. Ví dụ điển hình là người ta đã gắn
thành công toàn bộ interleukin-17, một phân tử có khối lượng khoảng 35 kDa, lên
bề mặt VLPs bằng phương pháp này [43]. Các hợp chất có kích thước lớn hơn sẽ
làm tăng khả năng tạo đáp ứng miễn dịch phổ rộng hom với các epitop mạch thẳng
cũng như mạch vòng trên phân tử đích. Đây là yếu tố rất quan trọng của hệ miễn
dịch trong việc nhận biết các chất gây bệnh. Bởi vì hầu hết các chất gây bệnh đều
trải qua sự biến đổi kháng nguyên ở một vài mức độ, kháng thể tạo ra chỉ bởi một
epitop đơn lẻ tế bào B thường có hiệu quả thấp. Phản ứng cộng hợp ngoài việc cho
phép gắn các hợp chất phi protein còn cho phép gắn các hapten lên bề mặt VLPs
[41]. Một dẫn chứng gần đây nhất là vaccine cai nghiện thuốc lá phát triển bởi
Cytos Biotechnology, vaccine này được tạo ra bàng cách gắn nicotine, một dạng
22
6732012