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- 1. Marlon Caianelo Dias Campos Orientador: Prof. Dr. José Roberto Guimarães Atividade Antimicrobiana Residual 27 de outubro de 2016 Faculdade de Engenharia Civil, Arquitetura e Urbanismo Pós Graduação em Saneamento e Ambiente 1
- 2. INTRODUÇÃO 2 Antimicrobianos Humano Veterinário Degradar: POA? Adsorção no lodo: biossólidos. Biodegradabilidade ETE < 10% Ocorrência ng - µg L-1 Não totalmente metabolizado Água Não são removidos por ETA < 50% Excretado in natura Solo Cloração : não degrada Produtos de degradação? Métodos para monitorar?
- 3. 3 Bactéria Grau de resistência bacteriana Antimicrobianos baixa alta Preocupações ambientais Desenvolvimento de resistência bacteriana Afeta a microbiota * Atualmente 700,000 mortes / ano Desequilíbrio ecossistema Resistência cruzada Desenvolvimento de novos medicamentos? Efeitos ecotóxicos desconhecidos
- 4. Bactéria Gram negativa 4 Gram negativa: Escherichia coli Principal representante de bactérias de águas superficiais Gram positiva Bacillus subtilis Principal representante de bactérias presentes no solo e Gram positiva
- 7. Avaliação da Atividade Antimicrobiana de soluções aquosas 7 Expor uma concentração de UFC conhecida de uma bactéria (Gram positiva ou Gram negativa) a uma amostra para avaliar sua atividade antimicrobiana. Avaliar o crescimento bacteriano Tempo determinado;
- 8. • Realizar os ensaios em um capela de fluxo laminar: Ensaio de Atividade Antimicrobiana Cuidados 6 • Esterilizar o material a ser utilizado em autoclave: Ponteiras, solução tampão, meios de cultura, todos os materiais utilizados devem ser estéril. • Autoclavar: 20 min a 120 °C
- 9. Método 9 Preparar: Meios de cultura (sólido e líquido); Tampão fosfato; Solução Mc Farland (= 1x108 UFC para E. coli e B. subtilis); Cultivar micro-organismos no meio sólido e líquido para avaliar possíveis contaminações e resultados falsos;
- 10. Meios de cultura •Líquido •Sólido •Utilizado no cultivo das bactérias •Utilizado para verificar possível contaminação das cepas cultivadas Placa de Petri Frascos T com 10 mL de meio líquido 7 Camadas finas e sem bolhas Água mili-Q Mueller-Hinton Agar (MHA) Água mili-Q Mueller Hinton broth (MHB)
- 11. 11 Tampão fosfato •Padrão Mc Farland •Solução de Fosfato de potássio monobásico anidro (1 mmol L-1) •Absorbância (620 nm) da solução deve estar entre 0,08 e 0,1. •Quando o valor da absorbância da solução Mc Farland for igual ao da cultura de bactéria, significa que a solução apresenta 1 X 108 UFC mL-1. Soluções utilizadas Solução H2SO4 (145,5 ml) + cloreto de bário (0,5ml) Cloreto de bário dihidratado (56,3 mmol L-1 ) H2SO4 (1% v/v) •Ajustes do pH •H3PO4 3M (pH 4) •KOH (pH 8) •Utilizado para diluir as amostras •Evitar variações de pH que prejudiquem o crescimento das bactérias
- 12. Cultivo das bactérias 12 Descongelamento Congelamento Inoculação Replique 24 hrs Durante 5 dias Tubo criogênico • 750µL de bactéria cultivada • 450 µL caldo MHB • 300 µL glicerol Inocular no MHA Inocular uma ponta de alça em 10 ml de MHB (37°C) durante 24 Hrs
- 13. Diluição Serial 13 Incubar por 8 h a 37 °C. A) B) D) C)
- 14. Análise dos dados • As medidas de absorbância são convertidas em inibição do crescimento (em %), I, de acordo com a equação: 100 controle controle A A A = I onde: • Acontrole é a absorbância correspondente ao crescimento da cultura não-inibida, obtida pela média das absorbâncias registradas no Controle 1 de cada microplaca (poço n°24) • A é absorbância a 620 nm registrada nos poços contendo as amostras. • Para determinar as curvas de dose-resposta e os valores de EC50 foi usado o software Prism 6.0 (GraphPad). 14
- 15. -3 -2 -1 0 0 5 0 1 0 0 L o g d ilu itio n I (G r o w th In h ib itio n ) t = 0 m in C o n tr o l -3 -2 -1 0 0 5 0 1 0 0 L o g d ilu itio n I (G ro w n th In h ib itio n , % ) t = 0 m in C o n tr o l Exemplo: AAM da Gatifloxacina 15 Bactéria Gram negativa (Escherichia coli) Bactéria Gram positiva (Bacillus subtilis) EC50 : 3,6 μg L-1 EC50 : 1,1 μg L-1 250 µg L-1 33 ng L-1 / (Inibição do crescimento, %) / (Inibição do crescimento, %) Logdiluição Logdiluição -2 -2 Controle Controle t = 0 min Controle = Solução de Gatifloxacina 500 µg L-1)
- 16. Bactéria Gram negativa (Escherichia coli) Exemplo: Avaliação da AAM de uma solução de GAT submitida a Fotólise e peroxidação /(Inibição do crescimento, %) Logdiluição 0 4 8 12 16 20 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 UVC UVA H2 O2 (2.4 mmol L -1 ) C/C 0 t (min) 16
- 17. Bactéria Gram positiva (Bacillus subtilis) Exemplo: Avaliação da AAM de uma solução de GAT submitida a Fotólise e peroxidação 0 4 8 12 16 20 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 UVC UVA H2 O2 (2.4 mmol L -1 ) C/C 0 t (min) 17 Logdiluição /(Inibição do crescimento, %)
- 18. 18 AAM: UV/H2O2 Bacteria Gram Negativa (Escherichia coli) <10% 97 % UV/H2O2 1,6 mmol L-1 UV/H2O2 2,0 mmol L-1 UV/H2O2 2,4 mmol L-1 UV/H2O2 0,4 mmol L-1 UV/H2O2 0,8 mmol L-1 H2O2 2,4 mmol L-1 UVC254 nm (Inibição do crescimento, %) Logdiluição
- 19. 19 AAM: UV/H2O2 Bacteria Gram Positiva (Bacillus subtilis) <10% 97 % UV/H2O2 1,6 mmol L-1 UV/H2O2 2,0 mmol L-1 UV/H2O2 2,4 mmol L-1 UV/H2O2 0,4 mmol L-1 UV/H2O2 0,8 mmol L-1 H2O2 2,4 mmol L-1 UVC254 nm (Inibição do crescimento, %) Logdiluição
- 20. AAM: UV/H2O2 (2,4 mmol L-1) Bacillus subtilis T= 0 min T= 2,5 min T= 4,5 min T= 6,5 min T= 10 min T= 20 min 15 diluições 15 diluições 11 diluições 8 diluições 6 diluições 4 diluições
- 21. 21 Marlon Caianelo Dias Campos: marloncaianelo@gmail.com AGRADECIMENTOS
Notas del editor
- Os antimicrobianos são compostos que matam ou inibem o crescimento de microrganismo. Podendo ser utilizados tanto na medicina veterinária quanto em humanos. Ao ser utilizados não são totalmente metabolizados pelo organismo. Podendo assim ser excretados para o ambiente na forma in natura ou de metabolitos ativos. Contaminando assim a água e solo e podendo atingir as estações de água e esgoto. O tratamento convencional destas estações não removem totalmente estes compostos do meio. Ocorrendo principalmente a transferência de fase do meio aquoso para os lodos . Como alternativa para a remoção destes compostos pode ser utilizado os processos oxidativos avançados que consiste na formação do radical hidroxila. Estas degradações podem gerar produtos de degradação que devem ser avaliados e monitorados seus efeitos
- Por conta da permanência do antimicrobianos no ambiente pode acontecer o contato do fármaco com as bactérias e assim elas desenvolverem resistência a estes compostos. O desenvolvimento destas bactérias resistentes atualmente causam cerca de 700 mil mortes por ano. Além de a presença destes antimicrobianos afetarem a microbiota e assim causarem um desequilíbrio naquele ecossistema. Além de adquirir resistência a um composto em especifico as bactérias podem estar adquirindo resistência a outros compostos também . E não se conhece muito bem os efeitos a longo prazo destes compostos no ambiente . Podendo assim por conta da resistência bacteriana ser necessário desenvolver novos medicamentos , cada vez mais poderosos e caros.
- Nestes ensaios para avaliar a atividade antimicrobiana foram escolhidos dos organismos. Uma bactéria gram negativa que é a ecoli e é a principal representante das bactérias de águas superficiais. E Tamebm foi utilizada uma bactéria gram positiva . Que é a b subitilis sendo a representando para bactérias no solo. Uma das grandes diferenças entre estes organismos é q a gram negativa tem uma camada peptideoglicana menor que a positiva. Mas possui uma parede celular maior
- O teste de atividade antimicrobiana consiste em expor uma concentração conhecida de bactérias (UFC) a amostras do fármaco . Por um tempo determinado. Estas UFC podem ser observadas na figura (bolinhas). Nestes testes são formados tantas UFC que seria inviável conta-las a olho nu. E por isto utiliza outro método de contagem e será mostrado posteriormente. Para avaliar assim se a concentração do fármaco é capaz de inibir o crescimento das bactérias. Para isto é necessário adicionar substrato para que as bactérias crescam . Manter temperatura ideal. Ter agitação para que as colônias não se precipitemdurante as 8 horas de contato com o fármaco.
- Estes ensaios são realizados dentro de um capela de fluxo laminar. Esta capela cria uma área esteril que dificulta o contato interno e externo. Nesta capela deve se ter o cuidado de higienizar toda a área e material que entra no fluxo a fim de agarantir q somente o organismo de interesse esteja lá. Antes de colocar qualquer material no fluxo este é higienizado com álcool e depois é utilizado uma lâmpada uv para desinfecção do local por 20 min. Alguns materiais são autoclavados para a esterilização.
- Para os ensaios eu primeiro preparo as soluções com meio de cultura (liquido e solido) Tampão fosfato Padrao mc farland Cultivar as culturas em meio solido e liquido para avaliar se há contaminação. Diluir serialmente as amostras na placa de 96 poços. Inocular cada poço com as bactérias E incubar por 8horas a 37 grau e sob agitação. Fazer as leituras das placas.
- O meio de cultura solido é importantes para avaliar se há contaminação nas soluções. Para o meio de cultura solido é utilizado MHA . Onde depois de preparada esta solução o material é autoclavado. E depois disso é realizado o preparo das placas com esta solução. Q depois de despejar um pouco deste liquido ele se solidifica . O meio de cultura liquido é utilizado como substrato para cultivar as bactérias O meio de cultura liquido é preparado com ....
- Também é preparado diluir as amostras e manter ideal o pH para o desenvolviemnto das bactérias. É utilizado uma solução de fosfato ... Onde o ajuste de pH é realizado com ....acido fosfórico e hidróxido de potassio O padrão mc faland é preparado com ....acido sulfúrico Desta solução de acido e cloreto eu meço a absorbância e se ela estiver entre x e y isto corresponde a uma concentração de bactérias de z
- Para o cultivo das bactérias é utilizado primeiro o descongelamento da bactéria q estava congelada no tubo criogênico. Onde este tubo é mantido a temperatura ambiente ate descongelar (uns 20 min) Depois contamina a ponta da alça neste tubo e inocula (insere) esta alça no tubo t com ml de meio liquido. Este tubo t é colocado em estufa por 24 hrs na t de 37 graus e depois é realizado um novo replique em outro tubo t . Este procedimento é realizado durante 5 dias. Para avaliar a contaminação é inoculado a bactéria na placa de petri . Contamina uma alça e depois utiliza movimentos em zigue zag no meio solido com agar. Esta placa inoculada é mantida na estufa. E para ter sempre bactérias é realizado o congelamento de uma parte das que foram cultivadas. O congelamente é feito com com ....
- Controle positivo com Amostras Controle negativo usando tampão fosfato. . Diluição das amostras em tampão fostato. Inoculação das bactérias 10 ^6 UFC ( é utilizado uma solução estoque de mc farland para corresponder a absorbância ) Depois de inoculadas as bactérias elas são incubadas por 8 horas . E após este tempo é realizado a leitura . Absorbancia medida são convertidas em inibição do crescimento através das formulas Ec50 - onde 50 porcento de inibição do crescimento é observada
- Absorbancia medida são convertidas em inibição do crescimento através das formulas Ec50 - onde 50 porcento de inibição do crescimento é observada
- Ao se realizar a analise da atividade antimicrobiana de um fármaco é importante encontrar as concentrações onde se tem a inibição do crescimento e onde a bactéria cresce normalmente. Como podemos observar no exemplo abaixa para o fármaco gatifloxacina . Na concentração inicial de 250 ug há inibição de 100 % das bactérias ou seja , não tem crescimento delas. Mas com o passar das diluições as bactérias vão crescendo até chegar numa concentração de fármaco no qual elas crecem normalmente. A concentração de fármaco onde se tem 50 % de inibição do crescimento é considerado o ec 50 . Atraves deste método também é possível encontrar o valor do mic ( onde se tem pelo menos 90 % de inibição do crescimento.
- Aqui vou usar um exemplo de atividade amm para uma degradação que não foi eficiente. A fotolise e peroxidação não degradaram a gat e ao comparar as linhas de dose resposta com o t zero não é observada mudança no comportamento da atividade antimicrobiana
- Mas para as degradações onde há uma melhor eficiência da degradação o resultado de aam é diferente. Observando o gráfico de degradação uv peroxido onde são formados os radicais hidroxilas . A degradação d a gat foi melhor . Ate 97 % ao longo dos 20 min. E ao analisar as curvas de dose resposta para o tempo t zero e os demais é observado que há uma mudança da esquerda para a direita. E observando o ec 50 por exemplo do t zero foi necessário 11 diluições para atingi lo. E para atingir o ec50 no t 6,5 min foi necessário de 4 diluições. Ou seja . A amostra perdeu atividade biológica com as degradações e assim perdeu capacidade de realizar a inibição da bactéria.
- Aqui está um resultado de leitura da absorbância das placas. Quando não há crescimento da bactéria a absorbância medida tende a ficar em 0,04 . Onde tem a leitura de apenas a amostra diluída. Mas com o crescimento das bactérias a absorbância das amostras tende a crescer.