Este documento descreve 3 estudos de caso de isolados de S. aureus resistentes à meticilina que não continham os genes mecA ou mecC. Análises genômicas revelaram mutações em genes que codificam proteínas de ligação à penicilina, sugerindo que essas mutações podem mediar a resistência observada.

1. Novel mutations in penicillin-binding protein genes in clinical
Staphylococcus aureus isolates that are methicillin resistance on
susceptibility testing, but lack the mec gene.
Xiaoliang Ba, Ewan M. Harrison, Giles F. Edwards, Matthew T. G. Holden, Anders Rhod Larsen,
Andreas Petersen, Robert L. Skov, Sharon J. Peacock, Julian Parkhill, Gavin K. Paterson and Mark A. Holmes
George Alves do Nascimento
Biologia Molecular Aplicada a Farmácia

2. Introdução
• Os
antibióticos
β-Lactâmicos
interferem na síntese da parede
celular bacteriana. A penicilina
acopla num receptor presente na
membrana interna bacteriana (PBP)
e interfere com a transpeptidação
que ancora o peptidoglicano
estrutural em volta da bactéria,
impedindo a síntese da parede
celular bacteriana.

3. Introdução
• Inicialmente, a primeira forma de
defesa bacteriana descoberta era
mediada pela expressão da
enzima β-Lacmatamase.
• Com o objetivo de escapar da
ação da β-Lactamase, foi criada a
primeira penicilina semi-sintética.
A meticilina.
• Porém, desde sua introdução, em
1961, surgiram várias linhagens
de SA que haviam desenvolvido
resistência a meticilina, os MRSA,
sendo estes resistentes a maioria
dos antibióticos β-Lactâmicos.
Desenvolvimento da Oxacilina.

4. Introdução
Mecanismo de resistência
Importância Clínica
• A resistência dos MRSA aos βLactâmicos se dá pela aquisição do
gene mecA ou seu variante, o gene
mecC, que codificam uma (PBP)2a
alternativa, que tem menor afinidade
pelos antibióticos β-Lactâmicos.
• Também tem sido estudada a
resistência a oxacilina (BORSA),
atribuindo
essa
resistência
a
superprodução de β-Lactamase e
também à mutações cromossômicas.
• A detecção dos mec genes ou da
PBP2a, são padrão ouro no diagnóstico
de MRSA.

5. Objetivos
• 4 linhagens isoladas de MRSA, que não possuíam os genes mecA
ou mecC, mas ainda sim eram fenotipicamente resistentes aos
antibióticos β-Lactâmicos, foram estudas quanto ao possível
mediador dessa resistência.
• As 4 linhagens tiveram seus genomas sequenciados e analisados
em uma gama de ensaios fenotípicos.
• MRSA mec-negativos podem ser causas de infecções em seres
humanos , mas podem ser classificados como susceptíveis a
meticilina, com base apenas nos testes para PBP2a e mec genes.
Um potencial motivo para a falha do tratamento.

6. Métodos
• Os isolados foram cultivados em
placa Agar sangue e em caldo TSB a
37°C.
• Os
testes
de
sensibilidade
antimicrobiana foram realizados
usando um disco de susceptibilidade
de acordo com os critérios da BSAC
(Methods
for
Antimicrobial
Susceptibility Testing).
• Os isolados foram testados para
produção de β-Lactamase usando o
β-Lactamase
(nitrocefin)
indentification sticks.

7. Métodos
• O DNA dos isolados foi extraído
em overnight cultures usando o
MasterPure Gram-positive DNA
Purification Kit.
• A sequencia genômica foi obtida
através da Illumina Library e Hiseq sequencing.
• Os genes que codificam as PBP
foram identificados usando o
software BLAST.

8. BLAST – ferramenta básica de busca por alinhamentos locais
• Existem variações nos programas BLAST, mas todos
compartilham a característica comum de encontrar regiões
de similaridade entre diferentes genes codificantes de
proteínas.
• Uma pesquisa BLAST permite que um investigador compare
uma sequencia fornecida em uma consulta com uma
biblioteca ou base de dados de sequências e identificar as
bibliotecas de sequências que se assemelham à sequência
consultada e que estejam acima de um certo grau de
semelhança.

9. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

11. Resultados
• Foram identificadas 4 mecA/C-negative isolados (XB84,
XB85, XB86 e XB87) que exibiam resistência a
penicilinas. Pertencentes ao STs 15, 1, 15, 8
respectivamente.
• Todos os quatro apresentaram resistência a oxacilina,
cefoxitin e penicilina nos testes de sensibilidade (BSAC),
exceto XB84 que apresentou um limite de tolerância
para oxacilina.

12. XB84
XB85
Positivo para a produção de βLactamase, medidos pelo Nitrocefin
XB86, Resultado negativo para a produção de β-Lactamase
XB87

13. Resultados
• Para melhor elucidar a base molecular da resistência, os quatros isolados
tiveram seu genoma sequenciado.
• Isso confirmou que nenhum dos isolados continha os mec genes A/C ou
nenhuma sequencia homologa a estes.

14. Resultados
• Depois foi usado o BLAST para identificar
outros isolados numa coleção genômica,
que
compartilhassem
100%
de
identidade de nucleotídeos ao longo
todo o locus da β-Lactamase (bla) (blaz,
blaI, blaR).
• Foram identificado 3 isolados com o gene
blaZ tipo A e 12 isolados com o gene blaZ
tipo C, sendo testada a resistência desses
isolados a oxacilina e cefoxitin ( Dados
não foram inclusos).
• Nenhuma associação foi encontrada
entre a presença do blaZ gene em sua
varias formas e a resistência.
• Realizou-se testes de susceptibilidade
nestes isolados, agora na presença do
acido clavulânico, nas proporções 2:1
ou 1:1.
• Nenhuma redução foi vista nas zonas
de inibição da oxacilina, cefoxitin ou
penicilina em combinação com o ácido
clavulânico. Isso sugere que a βlactamase não é a mediadora da
resistência.

15. Resultados
• Além da β-Lactamase e da PBP2a, outras cinco proteínas (PBP2,
PBP4, GdpP, YjbH, e AcrB) veem sendo relatadas por estarem
associadas a resistência em SA.
• As sequencias de DNA dos quatro isolados que codificam as
cinco proteínas foram comparadas com um painel de isolados
sensíveis pertencentes aos mesmos STs.
• Foi descoberto um pequeno número de substituições de
aminoácidos presentes nas PBP1, 2, 4 e YjbH em um ou mais
isolados resistentes mais ausente nas sensíveis.

16. Resultados: substituições de aminoácidos
• 1º Lugar: substituição no domínio da transpeptidase PBP1.
XB85 (ST1)
XB86 (ST15)
XB87 (ST8)
Substituição His 449
Tyr

17. Resultados: substituições de aminoácidos
• 2º Lugar: Substituição no domínio da transpeptidase de PBP2.
XB84 (ST15)
XB86 (ST15)
XB87 (ST8)
Thr – 552
Ile

18. Resultados: substituições de aminoácidos
• 3º Lugar: compartilhamento da substituição no domínio da
transpeptidase PBP3.
XB84 (ST15)
XB85 (ST1)
XB86 (ST15)
Ser – 664
Phe

19. Resultados: substituição de aminoácidos
• Foi identificado duas diferentes substituições não conservativas
na mesma posição do domínio da transpeptidase PBP1:
Tyr - 336
Asn
Tyr - 336
Cys

20. Resultados: substituições de aminoácidos
• Um número de substituições únicas também foram encontradas
em um dos isolados resistentes que estavam ausentes nos
isolados sensíveis do mesmo ST.
• Duas outras substituições foram encontradas em PBP2:
Thr – 31
Met em XB85
Asp – 156
Tyr em XB86
Thr – 371
Ile em XB85 no domínio de PBP1.

22. Discussão
• Neste trabalho foram identificados MRSA isolados pertencentes a
três STs. Esta resistência não parece ser mediada por hiperprodução
de β-Lactamase.
• Também foi identificada uma série de novas substituições nos
domínios das transpeptidase das PBPs 1, 2, 3 que poder ser os
mediadores dessa resistência.
• Os domínios das transpeptidases, são o alvo dos antibióticos βLactâmicos e substituições nesses domínios reduzem a eficácia da
acilação das PBP, proporcionando um certo grau de resistência.

23. Discussão
• Dado o pequeno número de isolados nesse estudo, a busca alvo
de mutações poderiam ter excluídos outros genes envolvidos na
resistência.
• Atualmente os MRSA mec-negativos não são amplamente
divulgados. É importante caracterizar seu mecanismo de
resistência, em especial para os laboratório clínicos, umas vez
que o diagnóstico atual dos MRSA limita-se a detecção dos
genes mecA/C ou da PBP2a.

24. Referências
• Biologia molecular do Gene. 5º edição, James D. Watson [et al]
• Microbiologia / Gerard Tortora, Berdell R. Funke. 8º edição.