Méthode cinétique appliquée à la reconnaissance isomérique
1. MÉTHODE CINÉTIQUE
appliquée à la reconnaissance isomérique
T. Fouquet - groupe masse – méthode cinétique
1
10 juillet 2009
2. MÉTHODE CINÉTIQUE STANDARD
2
M H
+
MH
+
+ AP = -ΔHréaction
A H
+
H2
B iAH
+
B i +
k 1
HBi
+
A+
k 2
AH
+
B i +
HBi
+
A+
A H
+
H2
B i
∆ ε 0
A ≈ Bi
(Structure et interactions)
(voies uniques de fragmentation)
~ fonctions de partitions
Méthode de mesure de propriétés et données
thermochimiques
Cinétiques de dissociations compétitives d’un
cluster formé :
De l’analyte A
D’un composé de référence Bi
Nécessité d’une fragmentation limitée
Liaisons faibles
Energie de collision faible
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
3. MÉTHODE CINÉTIQUE STANDARD
(2)
Tracé (« kinetic method plot »)
Différentes versions
Standard
Isentropique
Erreur sur la variation d’entropie constante
Conservation de la linéarité
Etendue
Mesure de l’entropie pour chaque point
Tracés modifiés pour éliminer les corrélations
Nécessité de données sur les variations d’entropie des
références
3
ln(k2/k1)
AP(Bi)
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
4. MÉTHODE CINÉTIQUE APPLIQUÉE
À LA DISTINCTION ISOMÉRIQUE
4
[MII
+ réf*2 + sucre – H]+
r é f *
M I I
s u c r e
r é f *
s u c r e
M I I
r é f *
- H
+
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
5. MÉTHODE CINÉTIQUE APPLIQUÉE
À LA DISTINCTION ISOMÉRIQUE (2)
Dissociation du cluster primaire (trimérique)
5
r é f *
s u c r e
M I I
r é f *
- H
+
r é f *M I I
r é f *
- H
+
M I I
r é f * s u c r e
- H
+
k 2
k 1
R =
k 1
k 2
[ M I I
+ r é f * 2 - H ] +
[ M II
+ r é f + s u c r e - H ] +
=
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
6. MÉTHODE CINÉTIQUE APPLIQUÉE
À LA DISTINCTION ISOMÉRIQUE (3)
Modélisation des cinétiques de dissociation par
l’abondance des ions fragments.
6
100 200 300 400 500
0.0
2.0e+5
4.0e+5
6.0e+5
8.0e+5
1.0e+6
1.2e+6
1.4e+6 [MnII
+ Asp2 + sucre – H]+
- réf*
- sucre
R =
[ M II
+ A s p 2 - H ] +
[ M II
+ A s p + f r u - H ] +
[MnII
+ Asp2 – H]+
[MnII
+ Asp + sucre – H]+
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
7. 0
2e+5
4e+5
6e+5
8e+5
1e+6
MÉTHODE CINÉTIQUE APPLIQUÉE
À LA DISTINCTION ISOMÉRIQUE (3)
Par exemple
D-gal et D-fru discriminés par Mn – L-Asp
7
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
0.0
2.0e+5
4.0e+5
6.0e+5
8.0e+5
1.0e+6
1.2e+6
1.4e+6
D-gal
R = 0,40
D-fru
R = 0,88
8. DANS NOTRE CAS
Métal :
Ca, Mn, Fe, Co, Cu, Zn
Références
Acides aminés
Similitudes structurales
Interaction Pi
Analytes
Monosaccharides : glucose, galactose et fructose
8
NH2
OH
O
O
OH
L - a c id e a s p a r t iq u e
A s p
NH2
OH
O
O
OH
L - a c id e g lu t a m iq u e
G lu
NH2
OH
O
O
NH2
L - g lu t a m in e
G ln
NH2
OH
O
O
NH2
L - a s p a r a g in e
A s n
NH2
OH
O
OH
L - t h r é o n in e
T h r
NH2
OH
O
OH
L - s e r in e
S e r
NH2
OH
O
L - p h é n y la la n in e
P h e
O
OH
H
H
H
OH
OH
H OH
H
OH
O
OH
H
H
OH
H
OH
H OH
H
OH
O
OH
OHH
H
OH
H
OH H
H
OH
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
9. QUELQUES SYSTÈMES
DISCRIMINANTS
métal (II)
Ca Mn Fe Co Cu Zn
référence
L - Asp
gal 0,07 +/- 0,02 0,39 +/- 0,03 0,43 +/- 0,03
trimère quasi non formé
trimère peu formé 0,68 +/- 0,06
glc 0,66 +/- 0,06 2,3 +/- 0,5 2,6 +/- 0,2 fragmentation
secondaire forte
3,0 +/- 0,2
fru 0,16 +/- 0,02 0,88 +/- 0,05 2,0 +/- 0,2 3,3 +/- 0,3
L - Phe
gal perte de Phe unique,
fragmentation secondaire
forte
fragmentation secondaire
forte
fragmentation
secondaire forte
fragmentation
secondaire forte
perte de sucre quasi
unique --> ligand fixe
0,21 +/- 0,03
glc 5,9 +/- 0,9
fru 5,7 +/- 0,5
L - Asn
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
gal 1,7 +/- 0,1 R > 6 R > 10 R > 10 R > 30 R > 10
glc 11,3 +/- 0,9
fru 4,5 +/- 0,3 > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe
L - Ser
gal
fragmentation secondaire
forte
fragmentation secondaire
forte
fragmentation
secondaire forte
fragmentation
secondaire forte
2,32 +/- 0,04
fragmentation
secondaire forteglc 5,7 +/- 0,3
fru 20,8 +/- 0,2
L - Gln
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
gal R > 5 R > 10 R > 13 R > 10 R > 40 R > 8
> ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe
L - Thr
gal
perte de réf* uniquement
0,04(2) +/- 0,006
non répétable
Pas de distinction glc/fru
0,12 +/- 0,01
pas de distinction, perte
de réf* uniquement
0,25 +/- 0,03
glc 0,52 +/- 0,03 1,14 +/- 0,02 2,5 +/- 0,3
fru 0,33 +/- 0,02 1,72 +/- 0,08 2,4 +/- 0,2
L - Glu
gal 0,12 +/- 0,02
peu répétable (chélate
faiblement formé)
peu répétable (chélate
faiblement formé)
protonation de glu seule, pas de chélateglc 1,12 +/- 0,05
fru 0,35 +/- 0,01
L - Arg
protonation de L- Arg seule
pas de formation de chélate
D - fucose chélate non formé
9
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
10. r é f *
s u c r e
M I I
r é f *
- H
+
EVOLUTIONS
Trois problèmes :
Pas de formation du cluster trimérique
Pas de distinction isomérique, absolue ou partielle
Fragmentation secondaire forte (> ion fragment attendu)
Utilisation d’un ligand fixe
10
r é f *
s u c r e
M II
L f ix e - H |+
u n it é f ix e
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
11. LIGAND FIXE
11
[Fe – Asn2 – glc – H]+[Fe – Asn2 – gal – H]+
[Fe – Asn2 – fru – H]+
– gal– fru– glc
– Asn
Pour le déterminer
Par exemple : Asn pour Fe
Perte nulle ou faible de réf* Lfixe
Perte nulle de Lfixe avec une autre réf*
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
12. métal (II)
Ca Mn Fe Co Cu Zn
référence
L - Asp
gal 0,07 +/- 0,02 0,39 +/- 0,03 0,43 +/- 0,03
trimère quasi non formé
trimère peu formé 0,68 +/- 0,06
glc 0,66 +/- 0,06 2,3 +/- 0,5 2,6 +/- 0,2 fragmentation
secondaire forte
3,0 +/- 0,2
fru 0,16 +/- 0,02 0,88 +/- 0,05 2,0 +/- 0,2 3,3 +/- 0,3
L - Phe
gal perte de Phe unique,
fragmentation secondaire
forte
fragmentation secondaire
forte
fragmentation
secondaire forte
fragmentation
secondaire forte
perte de sucre quasi
unique --> ligand fixe
0,21 +/- 0,03
glc 5,9 +/- 0,9
fru 5,7 +/- 0,5
L - Asn
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
gal 1,7 +/- 0,1 R > 6 R > 10 R > 10 R > 30 R > 10
glc 11,3 +/- 0,9
fru 4,5 +/- 0,3 > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe
L - Ser
gal
fragmentation secondaire
forte
fragmentation secondaire
forte
fragmentation
secondaire forte
fragmentation
secondaire forte
2,32 +/- 0,04
fragmentation
secondaire forteglc 5,7 +/- 0,3
fru 20,8 +/- 0,2
L - Gln
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
gal R > 5 R > 10 R > 13 R > 10 R > 40 R > 8
> ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe
L - Thr
gal
perte de réf* uniquement
0,04(2) +/- 0,006
non répétable
Pas de distinction glc/fru
0,12 +/- 0,01
pas de distinction, perte
de réf* uniquement
0,25 +/- 0,03
glc 0,52 +/- 0,03 1,14 +/- 0,02 2,5 +/- 0,3
fru 0,33 +/- 0,02 1,72 +/- 0,08 2,4 +/- 0,2
L - Glu
gal 0,12 +/- 0,02
peu répétable (chélate
faiblement formé)
peu répétable (chélate
faiblement formé)
protonation de glu seule, pas de chélateglc 1,12 +/- 0,05
fru 0,35 +/- 0,01
L - Arg
protonation de L- Arg seule
pas de formation de chélate
D - fucose chélate non formé
métal (II)
Ca Mn Fe Co Cu Zn
référence
L - Asp
gal 0,07 +/- 0,02 0,39 +/- 0,03 0,43 +/- 0,03
trimère quasi non formé
trimère peu formé 0,68 +/- 0,06
glc 0,66 +/- 0,06 2,3 +/- 0,5 2,6 +/- 0,2 fragmentation
secondaire forte
3,0 +/- 0,2
fru 0,16 +/- 0,02 0,88 +/- 0,05 2,0 +/- 0,2 3,3 +/- 0,3
L - Phe
gal perte de Phe unique,
fragmentation secondaire
forte
fragmentation secondaire
forte
fragmentation
secondaire forte
fragmentation
secondaire forte
perte de sucre quasi
unique --> ligand fixe
0,21 +/- 0,03
glc 5,9 +/- 0,9
fru 5,7 +/- 0,5
L - Asn
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
gal 1,7 +/- 0,1 R > 6 R > 10 R > 10 R > 30 R > 10
glc 11,3 +/- 0,9
fru 4,5 +/- 0,3 > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe
L - Ser
gal
fragmentation secondaire
forte
fragmentation secondaire
forte
fragmentation
secondaire forte
fragmentation
secondaire forte
2,32 +/- 0,04
fragmentation
secondaire forteglc 5,7 +/- 0,3
fru 20,8 +/- 0,2
L - Gln
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
gal R > 5 R > 10 R > 13 R > 10 R > 40 R > 8
> ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe
L - Thr
gal
perte de réf* uniquement
0,04(2) +/- 0,006
non répétable
Pas de distinction glc/fru
0,12 +/- 0,01
pas de distinction, perte
de réf* uniquement
0,25 +/- 0,03
glc 0,52 +/- 0,03 1,14 +/- 0,02 2,5 +/- 0,3
fru 0,33 +/- 0,02 1,72 +/- 0,08 2,4 +/- 0,2
L - Glu
gal 0,12 +/- 0,02
peu répétable (chélate
faiblement formé)
peu répétable (chélate
faiblement formé)
protonation de glu seule, pas de chélateglc 1,12 +/- 0,05
fru 0,35 +/- 0,01
L - Arg
protonation de L- Arg seule
pas de formation de chélate
D - fucose chélate non formé
100 200 300 400 500
0.0
5.0e+5
1.0e+6
1.5e+6
2.0e+6
2.5e+6
Formation du chélate
Réf* = D – fucose (déoxy – galactose)
Cu(Asn)fucose–sucre et Cu(Phe)fucose-sucre OK
Diminution des fragmentations secondaires
Renforcement des discriminations
Fe – Thr : pas de distinction fru / glc
Rgal = 0,06
Rfru = 1,2 / Rglc = 1
Fe(Asn)Thr : OK !
Rgal = 0,17
Rglc = 1,2
Rfru = 4,0
Inconvénient : faible abondance du cluster
100 200 300 400 500
0
1e+5
2e+5
3e+5
4e+5
5e+5
6e+5
[FeII
+ L-Thr2 + D-gal – H]+
[FeII
+ L-Asn + L-Thr + D-gal – H]+
LIGAND FIXE
12
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
13. QUANTIFICATION EN MÉLANGE
D’après Cooks :
Méthode « intrinsèquement » linéaire
(si l’on respecte les limitations :
Proximité structurale des composés
Pas de barrière énergétique)
X et Y deux composés en mélange
Rx et Ry facteurs de reconnaissance
Possibilité de quantifier N composés en mélange
si N – 1 systèmes discriminants
13
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
14. QUANTIFICATION – QUELQUES
PROBLÈMES
Déviations
Positives
Négatives
Inflexion ?
Variable avec les sucres et les systèmes
14
Cu – Ser – gal/fru
Cu – Ser – gal/glc
Co – Thr – gal/fru
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
15. QUANTIFICATION ?
Trois conditions nécessaires et suffisantes
Système discriminant
Trimère « suffisamment » formé
erreur absolue
Facteurs « suffisamment » différents
Erreur relative, ou incidence de l’erreur absolue
15
Co – Thr – glc/fru
Rglc = 1,34
Rfru = 1,80
Rfru = 23,3
Rgal = 2,38
Cu – Ser – gal/fru
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
16. NON LINÉARITÉ DE LA MÉTHODE
Trois causes possibles (pour le moment)
Entropie négligée
Interactions intramoléculaires (liaison H)
Dissemblance réf* / analyte
Pb : impossibilité de correction « formelle » sans références
(interaction « métallique » et « moléculaire »)
Modification ou différence de rendement de
formation du trimère en mélange selon l’analyte
Exaltation ou diminution « artificielle » du ratio
Modification de R en présence d’un autre sucre
Utilisation de sucres marqués 13
C
16
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
17. VARIATION DE RSUCRE ?
17
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
Ln(Rfru marqué)
Ln(Rgal)
xgal
xgal
Utilisation d’un sucre marqué : 13
C – fructose
Mélange gal – 13
C-fru
Clusters en m/Z et m/Z + 1
Fragmentation m/Z Rgal
Fragmentation m/Z + 1 R13C-fru et R13C, 15N, 2D-gal
Corrections :
Isotopes naturels de gal
R13C – fru / Rfru
Exemple (le seul ) : Cu – L-Ser
18. VARIATION DE RSUCRE (2)
18
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
ln Rmélange – Cu-Ser
xgal
Modélisation grossière
par une parabole
Correction R13C – fru / Rfru
Abondance naturelle
a = -0.04
b = 0.908
a’ = -1.93
b’ = 3.14
~ 1.9 ~ -4.2 ~ 3.1
19. A PRÉCISER RIGOUREUSEMENT
Contrairement à ce qui a été fait ici…
R13C – sucre / Rsucre ?
Simple rapport dans le cas précédent…
Abondance naturelle des isotopes de réf*, Lfixe et sucre
non marqué
(Soit les deux corrections apportées !)
Et travailler avec d’autres systèmes et d’autres
sucres…
19
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
20. MERCI DE VOTRE ATTENTION !
20
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique