Viviane Acunha - AMPK, AKT, ENOS, EXERCÍCIO , INSUFICIÊNCIA CARDÍACA
objetivos
Avaliar se em quadro de IC ocorre redução da atividade da Akt e AMPK;
Avaliar se o exercício físico induz ativação da AKT e AMPK e se essas levam o aumento da atividade da eNOS em ratos com insuficiência cardíaca;
Avaliar os efeitos sobre a fosforização da AMPK e da eNOS em aorta de ratos com insuficiência cardíaca tratados com ARA – adenina arabinofuranosida;
Avaliar os efeitos sobre a fosforização da Akt e da eNOS em aorta de ratos com insuficiência cardíaca tratados com LY294002.
preparo quimico mecanico passo a passo instrumentação
EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE A VIA AKT/eNOS E AMPK/eNOS EM AORTA DE RATOS WISTAR COM INSUFICIÊNCIA CARDÍACA.
1. Doutoranda: Viviane Acunha Barbosa
Orientador: Prof.Dr.Cláudio T de Souza
Criciúma-SCCriciúma-SC
20092009
EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICOEFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO
SOBRE A VIA AKT/eNOS E AMPK/eNOSSOBRE A VIA AKT/eNOS E AMPK/eNOS
EM AORTA DE RATOS WISTAR COMEM AORTA DE RATOS WISTAR COM
INSUFICIÊNCIA CARDÍACA.INSUFICIÊNCIA CARDÍACA.
Projeto de doutorado apresentado ao Programa
de Pós Graduação em Ciências da Saúde – PPGCS –
UNESC para o exame de qualificação.
AKT AMPKeNOS
2. DEFINIÇÃODEFINIÇÃO
““ INSUFICIÊNCIA CARDÍACA (IC):INSUFICIÊNCIA CARDÍACA (IC):
Síndrome clínicaSíndrome clínica complexa ecomplexa e progressivaprogressiva,,
que pode resultar deque pode resultar de qualquerqualquer distúrbiodistúrbio
funcional ou estrutural do coração quefuncional ou estrutural do coração que
altere sua capacidade dealtere sua capacidade de enchimentoenchimento e/oue/ou
ejeçãoejeção. Caracterizada clinicamente por. Caracterizada clinicamente por
dispnéia, fadiga, edema e redução dadispnéia, fadiga, edema e redução da
sobrevidasobrevida.”.” (Jessup & Brozena, 2003; Neto Rossi, 2004).
8. Relação entre hospitalizações eRelação entre hospitalizações e
sobrevida anualsobrevida anual
World Health Statistics, World Health Organization, 1999.World Health Statistics, World Health Organization, 1999.
American Heart Association, 2002 Heart and Stroke Statistical UpdateAmerican Heart Association, 2002 Heart and Stroke Statistical Update..
SOBREVIDA
HOSPITALIZAÇÕES
13. Oxido nítrico (NO .):Oxido nítrico (NO .):
Anti-inflamatoria
Anti-apoptosis Pro-fibrinolítica
Anti-plaquetaria
Proliferação e
migração CML
NO.
• pesquisas? quais são
os fatores ? Disfunções
do IAM-IC
Dentre essas investigações
Um mediador na funcionabilidade vascularUm mediador na funcionabilidade vascular
+ potente vasodilatador endogeno+ potente vasodilatador endogeno
Atualmente ON: prevenção e na redução dos Sintomas clinicos e hemodinamicos IC
Porem a relevância do ON
no endotelio e na vasculatura do Musculo liso
Depende de uma enzima importante
eNOS
14. Ativação da eNOS por diversosAtivação da eNOS por diversos
fatores…fatores…
?
PI3K
PLC-γ
AC
PKC
CaM
Akt CaMK
PKA
oxigenasa CaM reductasa
β γ
αi
β γ
αs
InsP3
DAG
Ca 2+
ATP
AMPc
S1177S635
S617
T497
S116
VEGF-R
Estrógeno-R Esfingosina-1-P Bradicinina
shear stress
IGF-1 e insulina
eNOS
IL-8
integrinas
P
Comini et al., 1996, Viaro& Evora, 2000
15. NO NO
CÉLULA MUSCULAR VASCULAR LISA
CÉLULA ENDOTELIAL
αs
S-S RPK
ββ
TYR
S-S
αα
p85 p110P
P
P
P
IRS-
1IRS-
2IRS-
3IRS-
4
PI(4,5)-P2 PI(3,4,5)-P3
PI(4)-P
PI(3,4)-P2
P P P
AKT3
AKT2
AKT1
P
PDK
NO
eNOS P
Fosfoinositídeos
PI3K
VEGF,
IGF-1 , insulina
shear stress,
(Bertrand et al., 2008;Dimmeler et al., 1999; Fulton et al., 1999; Zecchin, 2007).
A AKT será o mecanismo principal de ativação de eNOS?
P
AKT
Captação
de glicose
Anti-lipólise
Síntese de
glicogênio
Síntese de
PTN
Antiapoptose
16. Dano oxidativo
Choque osmótico
Hipoxia
Privação de glicose
Estímulos patológicos
Estímulos
fisiológicos
Exercício
Contração do músculo
hormônios
leptina
(Hardie et al. 2003).
AMPK é um kinase e ativada por...
adiponectina
Proteina Kinase ativada por AMP
17. ATP
ADP
AMP
ExercícioAMPKsensor energético
P172
AMPK β
γ
CBS
CBS
CBS
CBS
AMPK
αGLUT4
(Glucose transporter 4)
PFK
(Phosphofructokinase}
IRS1
(Insulin Receptor
substrate 1)
eNOS mTOR
ACC2
(Acetyl-CoA
carboxylase)
GPAT
(Glicero-3-phosphate
acyltransferase)
PPARγ
Leptin
Adipo-
nectin
MCD
(Malonyl-CoA
carboxylase)
Triglicerideos e
Malonil CoA
Captação
de glicose e
metabolica
GS
(Glycogen synthase)
PKC
CaMKKβ
TSC1/2
PGC-1α
(PPARγ coactivator)
Gene
expressão
Rheb
AMPKK
(LKB1)
Ativada pela redução do
conteúdo energético celular
(aumento da relação AMP/ATP)
Inibe as vias
metabólicas que
consuma
ATP
estimula as vias metabólicas
que produzam ATP
exercício
19. Exercício físico regular
↑ fluxo sanguíneo
↑Akt
↑
eNOS
(Ser 1177)
NO.
NO.
↑Força de frição tangencial
célula endotelial
NO CML
AMPK
NO.
Exercício Fisico
Tambem ativa
eNOS via ?
NO
IC
Problemática do estudoProblemática do estudo
P
20. OBJETIVO Geral:OBJETIVO Geral:
• Avaliar os efeitos do exercícioAvaliar os efeitos do exercício
sobre a via AKT/eNOS esobre a via AKT/eNOS e
AMPK/eNOS na aorta deAMPK/eNOS na aorta de
ratos wistar com IC.ratos wistar com IC.
21. Objetivos EspecíficosObjetivos Específicos ::
• Avaliar se em quadro de IC ocorre redução daAvaliar se em quadro de IC ocorre redução da
atividade da Akt e AMPK;atividade da Akt e AMPK;
• Avaliar se o exercício físico induz ativação da AKT eAvaliar se o exercício físico induz ativação da AKT e
AMPK e se essas levam o aumento da atividade daAMPK e se essas levam o aumento da atividade da
eNOS em ratos com insuficiência cardíaca;eNOS em ratos com insuficiência cardíaca;
• Avaliar os efeitos sobre a fosforização da AMPK e daAvaliar os efeitos sobre a fosforização da AMPK e da
eNOS em aorta de ratos com insuficiência cardíacaeNOS em aorta de ratos com insuficiência cardíaca
tratados comtratados com ARA – adenina arabinofuranosida;
• Avaliar os efeitos sobre a fosforização da Akt e daAvaliar os efeitos sobre a fosforização da Akt e da
eNOS em aorta de ratos com insuficiência cardíacaeNOS em aorta de ratos com insuficiência cardíaca
tratados com LY294002.tratados com LY294002.
22. METODOLOGIAMETODOLOGIA
(Tipo de estudo e ética)(Tipo de estudo e ética)
• Estudo experimental.Estudo experimental.
• Abordagem quantitativa,Abordagem quantitativa,
• Comitê de Ética; UNESC e HCPAComitê de Ética; UNESC e HCPA
• Princípios éticos na experimentaçãoPrincípios éticos na experimentação
animal e pratica didático-científica; lei nºanimal e pratica didático-científica; lei nº
6.638/ 08/05/ 1979 -COBEA6.638/ 08/05/ 1979 -COBEA
• Após os experimentos procedimentos:Após os experimentos procedimentos:
conforme RDC nº 306/2004 da ANVISA .conforme RDC nº 306/2004 da ANVISA .
(Schnaider & Souza, 2003).(Schnaider & Souza, 2003).
23. METODOLOGIAMETODOLOGIA
• 51 ratos machos da linhagem wistar51 ratos machos da linhagem wistar
(HCPA) cIAM-30 dias(HCPA) cIAM-30 dias
Barbetta (2007).Barbetta (2007).
Avaliação / Ecocardiograma
•diâmetros do VE ao final da diástole (DDVE) / sístole (DSVE).
A extensão do infarto (%IM),
porcentagem do perímetro total do contorno endocárdico (PE)
24. Modelos deModelos de
indução de infartoindução de infarto
agudo do Miocárdioagudo do Miocárdio
AC descente anterior esquerda
cateter periférico intravenoso (Gelko-16G)
reg torácica (4º espaço intercostal esquerdo)O pericárdio será rompido e o AE afastado
Johns & Olson, 1954; Pfeffer et
25. METODOLOGIAMETODOLOGIA
• Critérios de inclusão:Critérios de inclusão:
- homogeneidade na proporção do peso (em media de 200g ahomogeneidade na proporção do peso (em media de 200g a
350 g),350 g),
- idade (60 dias- adultos jovens),idade (60 dias- adultos jovens),
- gênero (machos), raça (wistar),gênero (machos), raça (wistar),
- Todos/ protocolo de adaptação ao exercício de uma semana,Todos/ protocolo de adaptação ao exercício de uma semana,
sendo randomizados os com maior aptidão física,sendo randomizados os com maior aptidão física,
- chegar ao final do experimento com bom estado de saúde.- chegar ao final do experimento com bom estado de saúde.
Barbetta (2007).Barbetta (2007).
26. METODOLOGIAMETODOLOGIA
Critérios de exclusão:Critérios de exclusão:
- complicações como infecções,complicações como infecções,
- necroses,necroses,
- debilitação do estado geral;debilitação do estado geral;
- problemas ou desconforto ao animal durante o- problemas ou desconforto ao animal durante o
período do experimentoperíodo do experimento
- morte dos mesmos,morte dos mesmos,
- não conseguirem realizar a semana denão conseguirem realizar a semana de
adaptação na esteira.adaptação na esteira.
27. 7 dias
ciclo 12 h claro/ciclo 12 h claro/
escuro, 22,5ºCescuro, 22,5ºC
Adaptação
biotério
30 dias
PO-IAM
HCPA
de Gava et al., 1995.Bertagnoli, 2004; Zanchi et al., 2006; Ferreira et al., 2007;
Protocolo exercício físico em esteira
28. 4m/min -10min
> gradativamente
por dia
5dias
Adaptação
Protocolo
(4º/5º+aptos)
1º semana
de Gava et al., 1995.Bertagnoli, 2004; Zanchi et al., 2006; Brum et al., 2007;
29. 5m/min - 10min
> A cada 3’ até exaustão
Pré-treinamento
5 semanas (Ajuste)
11 semanas (Aferição final)
Teste
Esforço
Máximo
2º semana
de Gava et al., 1995.Bertagnoli, 2004; Zanchi et al., 2006;Ferreira et al., 2007;
31. semanseman
aa
tempotempo
0202 1010
0303 1515
0404 2020
0505 2525
0606 3030
0707 3535
0808 4040
0909 4545
1010 5050
1111 5050
1212 5050
Protocolo
Treinamento
Físico
5m/min
5m/min
60%-TEM
5 min 5 min-10 min a 50 min-
2ª a 10ª
2º 12º semana
de Gava et al., 1995.Bertagnoli, 2004; Zanchi et al., 2006; Ferreira et al., 2007;
32. 7 dias
4m/min -10min
> gradativamente
por dia
5dias
Adaptação
Protocolo
Adaptação
biotério
30 dias
PO-IAM
HCPA
(4º/5º+aptos)
1º semana
5m/min - 10min
> A cada 3’ até exaustão
Pré-treinamento
5 semanas (Ajuste)
11 semanas (Aferição final)
Teste
Esforço
Máximo
2º semana
Protocolo
Treinamento
Físico
5m/min
5m/min
60%-TEM
5 min 5 min-10 min a 50 min-
2ª a 10ª
semanseman
aa
tempotempo
0202 1010
0303 1515
0404 2020
0505 2525
0606 3030
0707 3535
0808 4040
0909 4545
1010 5050
1111 5050
1212 5050
de Gava et al., 1995.Bertagnoli, 2004; Zanchi et al., 2006; Ferreira et al., 2007;
2º 12º semana
Vel. treino (m.min) = Vel. max (m.min-1) . 60%
100%
33. HistologiaHistologia Tamanho do IAMTamanho do IAM
Hangen, 2006 (Hangen, 2006 (Mill el at., 1990)
Area de infarto= massa da região infartada x 100%
(massa do VE + massa do VD
Verificar a deposição
ou não de colageno
e análise da musculatura lisa
Area infartada
e não infartada:
•PESADAS
•DESENHADAS
(PAPEL MILIMETRADO)
•Recortado e pesado
•(VE/VD)
34. Y
I
Eppendorf
YYYI
Western BlotWestern Blot
Macerada
em nitrogenio
liquido
Homogeneizada em
tampão especifico
Adicionado
triton
Centrifugado
40 min
sobrenadante
Será processado e aplicado em gel SDS
(apósCorrida)
Transferidas
Memb de nitrocelulose
Incubadas com antocorpo primario
secundario
Tranf. Filme de raiox
35. Analises Moleculares via de
sinalização da insulina
Imunoblot:
PI 3-KPI 3-K
AKTAKT
P172
AMPK β
γ
CBS
CBS
CBS
CBS
AMPK
α
L-ARGL-ARG
eNOSeNOS
ON
Nagata et al., 2003; Reihill et al. 2007; Reihill, 2009
AVALIAR
A EXPRESSÃO
E A FOSFORILAÇÃO
DA
36. Analises Moleculares via de
sinalização da insulina
Imunoblot:
PI 3-KPI 3-K
AKTAKT
LY200940
ARA – adenina
arabinofuranosida
P172
AMPK β
γ
CBSCBS
CBS CBS
AMPK
α
L-ARGL-ARG
eNOSeNOS
ON
AVALIAR A FOSFORILAÇÃO
DA eNOS mediante o inibidor
A utilização dos inibidores e para mostrar a importância
da AKT e AMPK neste processo
37. Analise estatisticaAnalise estatistica
• A analise estatística será pelo teste deA analise estatística será pelo teste de
Student (não pareados) e ANOVA paraStudent (não pareados) e ANOVA para
comparar as múltiplas médias. Serácomparar as múltiplas médias. Será
adotado o nível de significância p<0,05.adotado o nível de significância p<0,05.
38. no: 2009 J F M A M J J A S O N D
Elaboração do projeto
x x x x x x x x x x x
Avaliação pelo Comitê de ética
x x
elaboração e apresentação
Qualificação x x
Qualificação
x
no: 2010 J F M A M J J A S O N D
Infarto dos animais-HCPA/
Deslocamento UNESC x x x
Protocolo de Exercício C/I aerobio
X X X
Eutanásia UNESC/coleta de tecidos
x
Analises molecularese histológicas
x x x x x x
Analise dos dados e elaboração de
artigo x x x
CRONOGRAMA
39. Ano: 2011 J F M A M J J A S O N D
Analises
moleculares/bioquímicas
e histológicas
x x x x x
Analise dos dados e
elaboração de artigo x x x x x x x x x x x x
Ano: 2012 J F M A M J J A S O N D
Defesa da tese
x x
CRONOGRAMA
40. Quantidade Material Valor (R$) Fonte
51 Ratos Wistar 1020,00 HCPA-UNESC
Diversos Reagentes para
Western blot
4.000,00 CNPq
Diversos Anticorpos 15.000,00 UNICAMP e
HCPA
Histologia 1.000,00 UNICAMP
Diversos Material de
Consumo/condução
para
animais/eventos
4.000,00 UNESC
TOTAL 25.020,00
ORÇAMENTO
41. O que busca-se :O que busca-se :
• ........que esses resultados demonstrem um novo........que esses resultados demonstrem um novo
mecanismo biológico pelo qual o exercício físicomecanismo biológico pelo qual o exercício físico
possa induz relaxamento vascular e proporcionepossa induz relaxamento vascular e proporcione
importantes informações acerca da modulaçãoimportantes informações acerca da modulação
vascular na insuficiência cardíaca.vascular na insuficiência cardíaca.
• OBs.: é importante ressaltar que existemOBs.: é importante ressaltar que existem
fármacos já comercializados que aumentam afármacos já comercializados que aumentam a
atividade da AKT e da AMPK porem.....atividade da AKT e da AMPK porem.....