Seguint aquest protocol, els joves participen en la investigació per desenvolupar una vacuna contra la malària que, en combinació amb les mesures actuals, podria contribuir de manera significativa a controlar millor aquesta important malaltia causada per un paràsit. Els estudiants provaran diverses possibles vacunes mitjançant la tècnica anomenada ELISA, i decidiran quina és la més eficaç. El protocol de l’experiment és una oportunitat perquè els centres de ciències, els museus i les escoles simulin un experiment real realitzat en un laboratori de veritat per investigar la vacuna de la malària.

1. Investiga la vacuna
de la malària
Taller d’experimentació
PROTOCOL

2. Introducció
La malària és considerada la malaltia més binació de diferents mesures que inclouen la
important del món causada per un paràsit i és utilització de mosquiteres impregnades d’insec-
responsable de la mort de prop de 800.000 per- ticida, d’esprais insecticides, de tractaments de
sones cada any, especialment infants menors prevenció, la implantació de programes educa-
de cinc anys i dones embarassades. Segons tius i intervencions ambientals, entre d’altres.
l’Organització Mundial de la Salut (OMS), uns
3.000 milions de persones corren el risc de ser La comunitat científica està treballant intensa-
infectades, i l’any 2010 hi va haver 225 milions ment per desenvolupar una vacuna que es creu
de casos de malària al món, un 90% dels quals que, en combinació amb les mesures actuals,
a l’Àfrica. podria contribuir significativament a un millor
control de la malària. Actualment ja hi ha una
Actualment la malària és endèmica a més de vacuna que es troba en fase d’estudi clínic i que
100 països localitzats a l’Àfrica Subsahariana i serà efectiva en un 50% dels casos.
a regions del sud de l’Àsia, de l’Amèrica Llatina
i d’Oceania. Els últims informes indiquen que
la meitat de la població mundial viu a àrees on
existeix risc de contraure aquesta malaltia i
on, a part de les conseqüències en la salut de
la població, la malària contribueix a debilitar
encara més la situació econòmica de la zona.
En aquest taller investigaràs amb
Per tal d’eradicar la malaltia, a les zones amb diferents candidats a vacuna per decidir
alt risc de transmissió s’estan duent a terme quin pot ser el més eficaç de tots
diferents intervencions que suposen una com-
Països o zones on es produeix la transmissió de malària Països o zones amb risc limitat de transmissió de malària
Font: Organització Mundial de la Salut (OMS). Dades de 2009
2

3. Com es transmet la malària? Per què és necessària una vacuna
contra la malària?
La malària és una malaltia infecciosa que
s’encomana amb la picada d’un mosquit del
gènere Anopheles que transmet paràsits del Històricament les vacunes han constituït un
gènere Plasmodium i que per tant actua com dels mitjans més eficaços per prevenir malal-
a vector. Dins l’organisme humà els paràsits ties i salvar vides, especialment en el cas de les
es multipliquen al fetge i després infecten els malalties infeccioses. L’obtenció d’una vacuna
glòbuls vermells. Entre els símptomes de la parcialment eficaç podria significar la possibili-
malària destaca la febre, el mal de cap i els tat de salvar centenars de milers de vides.
vòmits, que apareixen entre deu i quinze dies
després de la picada del mosquit. L’obtenció d’una vacuna suposarà un gran pas
endavant i es podrà afegir a l’arsenal actual
de mesures utilitzades per a la prevenció de
la malària, com per exemple les mosquiteres
impregnades amb insecticida i el tractament
oportú i adequat dels casos diagnosticats de
malària.
Com s’està intervenint per
controlar la malària? Com que la seva eficàcia a curt termini serà
Les intervencions fonamentals per controlar la parcial, no substituirà aquestes mesures sinó
malària es poden dividir en diferents grups: que les complementarà i conjuntament consti-
tuiran una resposta integral per a la prevenció
de la malària.
1 Estratègies contra el
mosquit o vector, com ara
la fumigació dels espais
tancats amb insecticides.
2 Estratègies per evitar el
contacte vector-hoste, com
ara l’ús de mosquiteres
impregnades amb
insecticida.
3 Estratègies contra el
paràsit. Dins d’aquest
grup d’estratègies trobem
el tractament amb
combinacions de fàrmacs
basats en una molècula
anomenada artemisinina, que és ràpid i eficaç.
Una vacuna també seria una estratègia de
control contra el paràsit que, en combinació
amb altres estratègies, podria contribuir
significativament a l’eradicació de la malària.
3

4. Què fem a l’ISGLOBAL, l’Institut de Salut Global de Barcelona?
L’Institut de Salut Global de Barcelona (ISGlobal) 1. Estudi de les bases moleculars de la malal-
és una organització sense ànim de lucre, l’ob- tia així com les diferents respostes immuni-
jectiu de la qual és millorar la salut i el desen- tàries.
volupament de les poblacions més vulnerables
mitjançant la generació, la gestió, la transmissió 2. Desenvolupament de nous fàrmacs i avalua-
i l’aplicació de coneixements. La seva visió és un ció de la seva seguretat, eficàcia i efectivitat.
món on tothom pugui gaudir de bona salut i, en-
tre d’altres institucions, compta amb el suport 3. Avaluació de les característiques epidemio-
de l’Obra Social “la Caixa”. lògiques de la malària en diferents entorns i
dels aspectes socioculturals que l’envolten.
Un dels pilars essencials de l’ISGlobal és la
recerca centrada en problemes de salut que 4. Anàlisi de l’efectivitat de diferents eines de
afecten les poblacions més vulnerables i es prevenció així com de la relació cost-efecti-
desenvolupa des del Centre de Recerca en vitat de les intervencions.
Salut Internacional de Barcelona (CRESIB). La
recerca en malària que es du a terme des del Dins de l’àmbit (4), el CRESIB du a terme
CRESIB se centra en: estudis clínics de seguretat, d’eficàcia i d’efec-
tivitat de vacunes. Actualment participa en el
desenvolupament de la vacuna RTS,S contra
la malària, que està resultant efectiva en més
del 50% dels infants infectats. En paral·lel, els
investigadors del CRESIB estan investigant per
identificar nous candidats a vacuna.
4

5. Objectius del taller 1
En aquest taller et convidem a analitzar di-
ferents candidats a vacuna contra la malària
amb què el CRESIB està investigant per tal que
identifiquis quin és el millor candidat. Els can-
didats a vacuna del CRESIB han estat obtinguts
de proteïnes del paràsit que prèviament s’han
purificat.
Per analitzar-los disposaràs de diferents
mostres de sang de persones residents a zones
afectades per malària, que ja han patit la malal-
tia en diverses ocasions, i que ja estan immu-
nitzades.
Per confirmar que els nostres candidats a
vacuna són efectius, ens cal comprovar que les
persones immunitzades han desenvolupat una
resposta contra aquests candidats. Si en les
persones s’observa una activació de la resposta 2
immunitària contra les proteïnes candidates,
voldrà dir que podrien ser bons candidats a
vacuna perquè també podrien desencadenar la
resposta necessària per protegir contra futures
infeccions.
3
5

6. L’objectiu d’aquest taller és que us familiaritzeu indicarà que ha estat capaç d’activar una bona
amb una de les tècniques més utilitzades als resposta immunitària i que, per tant, es podria
laboratoris de biomedicina, la tècnica ELISA tractar d’un bon candidat.
(Enzim Linked Immuno Sorbent Assay).
Gràcies a aquesta tècnica descobrirem concre-
Es tracta d’una anàlisi per detectar si a les tament quin dels antígens de què disposem al
mostres de sang hi ha anticossos. La presència laboratori és un bon candidat a vacuna contra la
d’anticossos específics contra els candidats malària.
Principis bàsics de la tècnica ELISA
El principi bàsic d’aquesta tècnica es basa en la Per dur a terme la identificació s’utilitzen uns
interacció del candidat a vacuna, o antigen (1), anticossos que tenen associada una molècula
amb l’anticòs (2). Un anticòs específic s’unirà anomenada enzim (3), que té la capacitat de
a un antigen específic per donar un complex reaccionar amb una substància que hi afegirem,
antigen-anticòs exclusiu. anomenada substrat (4), i donar lloc a un color.
La tècnica ELISA ens permet identificar si hi Així doncs, si la mostra tenia l’anticòs que
havia anticossos, i per tant, si s’han format els volíem detectar, aquest s’unirà al que afegirem
complexos antigen-anticòs en posar en con- unit a un enzim, que alhora farà canviar de
tacte les mostres de sang amb els candidats a color el substrat i així ens indicarà el resultat
vacuna. positiu.
Substrat
Enzim
Anticòs
Antigen
1. Antigen: qualsevol material estrany que s’uneix de manera específica als anticossos o limfòcits específics i activen una
resposta immunitària. En general els antígens tenen un pes molecular elevat i normalment són proteïnes o polisacàrids.
2. Anticòs: proteïnes (immunoglobulines - Ig) del sèrum que es formen en resposta a la invasió de molècules foranes en el
cos, bé per exposició natural a un antigen o per immunització mitjançant vacunes. Tenen forma de Y i estan formats per
quatre cadenes polipeptídiques que es mantenen unides mitjançant enllaços disulfur intercatenaris. El anticossos tenen
una regió constant i una regió variable.
3. Enzim: proteïna que facilita reaccions específiques del metabolisme.
4. Substrat: solució que conté un compost sobre el qual actuarà un enzim.
6

7. Organització del taller
Per tal d’analitzar quin dels candidats a vacuna contra malària tenen anticossos contra aquests.
o antígens és el més efectiu, analitzarem si les Per fer-ho dividirem l’experiment en 3 etapes
mostres de sang de persones immunitzades principals.
1. UNIÓ DE LES PROTEÏNES CANDIDATES (O ANTÍGENS) A LA SUPERFÍCIE DELS POUETS
El primer pas serà fixar les proteïnes candidates objecte d’estudi a un suport sòlid
2. FORMACIÓ DE COMPLEXOS ANTIGEN-ANTICOSSOS
Després hi afegirem les mostres de sang, concretament el sèrum (que correspon a les mostres de
sang un cop extretes les cèl·lules i els factors de coagulació), i un anticòs marcat amb un enzim,
que anomenarem anticòs secundari. A les mostres de sang on hi havia l’anticòs d’estudi es forma-
ran complexos antigen-anticòs, que alhora s’uniran a l’anticòs marcat amb l’enzim.
Sèrum Anticòs 2ari
dels pacients marcat
amb enzim
3. LECTURA DE LA REACCIÓ
Per últim, hi afegirem el substrat de l’enzim, que si hi ha presència del complex antigen-anticòs
canviarà de color. D’aquesta manera podrem saber si les mostres de sang tenien l’anticòs d’estudi i
en quines quantitats.
Substrat
de l’enzim
Resultats i conclusions
Amb els resultats obtinguts podrem decidir immunitària més intensa i per tant pot ser el
quin candidat a vacuna activa una resposta millor candidat.
7

8. Equipament i material
necessari
Instruments i estris de laboratori
Agitador magnètic (1) (per Nucli magnètic i Micropipeta
preparar PBS-Tween) “pescanuclis” de 20 a 200 µl (2)
Proveta Ampolla de vidre
Cronòmetre Embut
de 100 ml de 250 ml
Material fungible
Tires de 12 pouets Pipetes Pasteur de Puntes per a micropipeta
d’ELISA i suports plàstic graduades
Paper absorbent Retolador permanent Guants, ulleres i bata
1. En cas que no tinguis agitadors magnètics pots comprar el PBS líquid
2. En cas que no tinguis micropipetes pots utilitzar pipetes Pasteur de poc volum
8

9. Reactius i mostres
Solució tampó PBS (3) Detergent Tween-20 (4) Aigua destil·lada
Anticòs 2ari
A B C+ C-
Candidats a vacuna Controls positius Anticòs secundari
(antígens) i negatius (5) amb enzim
(peroxidasa)
Substrat
1 2 3 4
Substrat o solució de Mostres de sèrum de 4 persones residents a zones
revelatge endèmiques de la malària que han esdevingut immunes
a la malaltia
3. Ajuda a mantenir el pH de la solució gràcies a fosfats de sodi i de potassi.
4. Ajuda a prevenir unions d’anticossos inespecífiques
5. C+: conté una barreja de sèrums de persones residents a zones endèmiques de la
malària i que són immunes a la malaltia.
C-: barreja de sèrums de persones que mai no han estat exposades a la malària
9

10. Procediments
Per determinar la presència o l’absència d’an- de diferents pacients que resideixen a zones en-
ticossos específics contra els 2 antígens can- dèmiques de malària amb aquests antígens, per
didats a vacuna de què disposem al laboratori, tal de veure si en aquests sèrums trobem anti-
confrontarem la sang (concretament el sèrum) cossos específics contra els nostres antígens.
1 Unió dels antígens a la superfície del pouets
Les tires de micropouets es recobreixen amb La unió d’aquests antígens a la superfície dels
els candidats a vacuna (antígens) que volem pouets es produeix amb facilitat perquè estan
provar per veure si serien bons candidats a una fets amb un plàstic tractat que té una gran
vacuna contra la malària. afinitat per unir proteïnes.
PROTOCOL PER A LA UNIÓ DELS ANTÍGENS A LA SUPERFÍCIE DELS POUETS
1
A continuació anota què posaràs a cada pouet (controls, mostres de sang i nom dels
antígens que analitzaràs).
2
Retola els pouets marcant
on posaràs cada mostra.
10

11. 3
Prepara una solució de rentatge (PBS-Tween 0,05%).
A B
Mesura 200 ml d’aigua destil·lada utilitzant
la proveta i enrasant amb la pipeta Pasteur. Diposita el nucli magnètic dins l’ampolla
Afegeix els 200 ml d’aigua destil·lada dins i dilueix amb l’aigua 1 pastilla de PBS
l’ampolla amb l’embut. utilitzant l’agitador magnètic.
C D
Un cop la pastilla s’ha dissolt, extreu el nucli
magnètic i afegeix-hi 100 µl de Tween-20 Remena-ho bé invertint l’ampolla unes
amb una pipeta Pasteur de plàstic. quantes vegades.
Nota: La solució de rentatge conté PBS (phosphate buffer saline), que permet que els anticossos es mantinguin en un
ambient estable que ajuda a conservar-ne l’estructura. El Tween-20 és un detergent que ajudarà a eliminar les proteïnes
que s’hagin pogut unir de manera no específica i s’uneix a les parts del pouet que no estan cobertes per antigen i d’aquesta
manera es redueix el soroll de fons.
11

12. 4 5
Afegeix els dos
antígens problema
als pouets
corresponents
utilitzant la
micropipeta
(50 µl per pouet). És
important que facis
servir una punta
neta per dispensar
els antígens,
així evitarem
contaminacions.
Deixa-ho incubar durant 5 minuts a
temperatura ambient.
6 7
Renta-ho per eliminar l’excés d’antigen
Elimina les restes d’antigen mitjançant no unit a la tira. Per fer-ho, omple
inversió de la tira sobre un paper els pouets amb la solució de rentatge
absorbent. mitjançant una pipeta Pasteur de plàstic.
8 9
Descarta la solució de rentatge mitjançant
inversió de la tira sobre un paper absorbent. Repeteix els passos 7 i 8 un cop més.
12

13. 2 Formació de complexos antigen-anticossos
En aquest pas, primer addicionarem el sèrum anomenat peroxidasa. Com que a cada anticòs
dels pacients per analitzar si contenen anti- primari se li pot unir més d’un anticòs secun-
cossos contra el candidat a vacuna. A aquests dari, la quantitat de color que s’obtindrà en el
anticossos que volem analitzar els anomena- pas tres serà amplificada. D’aquesta manera la
rem anticossos primaris. Després hi afegirem tècnica tindrà més sensibilitat.
un anticòs secundari marcat amb un enzim
Sèrum Anticòs 2ari
dels pacients marcat
amb enzim
PROTOCOL DE FORMACIÓ DE COMPLEXOS ANTIGEN-ANTICOSSOS
1 2
Afegeix els controls positius i negatius Afegeix les diferents mostres de
als pouets corresponents utilitzant la sèrums de 4 residents a zones
micropipeta (50 µl per pouet). endèmiques de malària als
El control positiu (C+) conté una barreja pouets corresponents utilitzant la
de sèrums de persones residents a micropipeta (50 µl per pouet).
zones endèmiques de malària i que
són immunes a la malaltia. El control
negatiu (C-) conté una barreja de
sèrums de persones que mai no han
estat exposades a la malària.
13

14. 3 4
Deixa-ho incubar durant 5 minuts a Elimina l’excés de mostra mitjançant
temperatura ambient. inversió de la tira sobre un paper absorbent.
5 6
Renta tots els pouets per eliminar
els anticossos que no han reaccionat
amb els antígens i que per tant no són
específics. Omple els pouets amb la Descarta la solució de rentatge
solució de rentatge mitjançant una mitjançant inversió de la tira sobre un
pipeta Pasteur de plàstic. paper absorbent.
7 8
Amb la micropipeta, afegeix l’anticòs
secundari que està unit a un enzim a
Repeteix el pas 5 i 6 dues vegades més. tots els pouets (50 µl per pouet).
14

15. 9 10
Elimina l’excés d’anticòs secundari
Deixa-ho incubar durant 5 minuts a mitjançant inversió de la tira sobre un
temperatura ambient. paper absorbent.
11 12
Renta els pouets omplint-los amb la Descarta la solució de rentatge
solució de rentatge mitjançant una mitjançant inversió de la tira sobre un
pipeta Pasteur de plàstic. paper absorbent.
13
Repeteix els dos passos anteriors 3 vegades més.
15

16. 3 Lectura de la reacció
Un cop ho hem rentat per eliminar totes les
molècules marcades no fixades en forma de
complexos antigen-anticossos s’hi afegeix el
substrat enzimàtic en solució, que facilitarà el
canvi de color.
Substrat
de l’enzim
PROTOCOL DE LA LECTURA DE LA REACCIÓ
1 2
Deixa-ho incubar durant 5 minuts. Durant
Afegeix el substrat de l’enzim a tots els aquest temps el substrat s’unirà a l’enzim
pouets amb la micropipeta i anirà apareixent el color a temperatura
(50 µl per pouet). ambient.
16

17. 3
Recull-ne els resultats en forma de gràfic de barres.
ANTIGEN 1
màxim
Intensitat
mínim Mostres
C+ C- M1 M2 M3 M4
ANTIGEN 2
màxim
Intensitat
mínim Mostres
C+ C- M1 M2 M3 M4
17

18. Resultats i conclusions
Interpreta i apunta els resultats
1. Quin dels antígens que has provat creus que és el millor candidat a vacuna?
Creus que els antígens que has provat són un bon candidat a vacuna? Per què?
2. Quan una reacció és positiva i quan és negativa? Per què?
3. Per què creus que s’utilitzen els controls?
18

19. 4. Quina part de l’anticòs primari és reconeguda per l’anticòs secundari: la regió constant
o la variable? Raona la resposta.
5. Què passaria si no féssim els rentatges abans de posar el substrat de revelatge?
6. Podríem utilitzar sang de companys de la teva classe per determinar si els nostres antígens
de laboratori són bons candidats per a una vacuna contra la malària? Raona la resposta.
7. Creus que amb aquest experiment ha quedat demostrat que el candidat seleccionat
estimula la resposta immunitària? Caldria fer algun altre tipus d’experiment per avaluar si
també és capaç d’activar alguna altre tipus de resposta?
19

20. Annex I
ÚS OBLIGATORI ÚS OBLIGATORI ÚS OBLIGATORI
D’ULLERES DE BATA DE GUANTS
Precaucions de seguretat
INFORMA’T utilitzes productes tòxics o corrosius. No apro-
Localitza els elements de seguretat del labora- pis envasos de reactius a una flama. No escalfis
tori o l’espai habilitat per experimentar líquids inflamables. Transporta les ampolles
(extintors, dutxes o bany, sortides, etc.). Llegeix agafant-les pel fons, mai per la boca.
atentament les instruccions abans de fer un
experiment. No oblidis llegir les etiquetes de ELIMINACIÓ DE RESIDUS
seguretat de reactius i d’aparells. Diposita a contenidors especials i degudament
senyalitzats: el vidre trencat, els reactius tòxics,
UTILITZA VESTIMENTA ADEQUADA nocius o perjudicials per al medi ambient, i els
Guants, bata i ulleres de protecció. residus biològics. Mai no s’han de tirar residus
sòlids a la pica.
NORMES GENERALS
Està prohibit fumar, menjar o beure al labora- En cas d’accident, avisa immediatament l’edu-
tori o a l’espai habilitat per experimentar. cador. Recorda: Davant de qualsevol dubte,
Renta’t les mans abans de sortir del laboratori. consulta’l amb l’educador.
Treballa amb ordre, netedat i sense
presses. Si et cau un producte, recull-lo imme- PRECAUCIONS ESPECÍFIQUES
diatament. Deixa sempre el material PER A AQUEST TALLER
net i endreçat. No utilitzis mai un equip o apa- En aquesta pràctica manipularàs reactius que
rell sense conèixer-ne perfectament el hauràs de manipular seguint les precaucions
funcionament. usuals per a la manipulació de productes quí-
mics. A continuació s’enumeren només els que
MANIPULACIÓ DE VIDRE presenten els graus de perillositat següents:
Protegeix-te les mans quan manipulis material
de vidre. No utilitzis vidre esquerdat. • PBS:
tòxic per ingestió, inhalació i contacte amb la
PRODUCTES QUÍMICS pell.
No utilitzis cap flascó de reactius sense eti-
queta. No ensumis, inhalis, tastis o toquis els • Tween 20:
productes químics. No pipetegis mai amb la tòxic per ingestió, inhalació i contacte amb la
boca. Posa’t guants i renta’t les mans sovint si pell. Irritant.
Annex II
Referències dels reactius
NOM REFERÈNCIA CASA COMERCIAL
PBS P4417-50TAB Sigma
Tween-20 P1379-100ML Sigma
CHK IGY, bagged (=ANTIGEN) 1662406EDU BioRad
RB ANTI-CHK, bagged (=PLASMA) 1662407EDU BioRad
GAR-HRP, bagged (=ANTICÒS 2ari) 1662408EDU BioRad
SUBSTRAT REVELATGE 1662402EDU BioRad
20

21. Continua investigant a Xplore Health!
Investigadors que hi han contribuït amb continguts: Laura Puyol, investigadora del CRESIB, ISGlobal.
DESENVOLUPAT PER
Aquesta obra està inclosa amb una llicència Attribution-NonCommercial-
NoDerivs 3.0 Unported de Creative Commons. Per veure una còpia de la
llicència, visita http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/