Penelitian ini mengevaluasi pengaruh HbE dan HbD trait terhadap 23 metode pengukuran HbA1c. Ditemukan bahwa beberapa metode ion-exchange HPLC dipengaruhi oleh HbE dan HbD trait, menghasilkan nilai HbA1c yang salah. Metode immunoassay, enzimatik, dan boronate affinity tidak dipengaruhi oleh Hb varian dan dapat digunakan untuk pasien dengan HbE atau HbD trait. Laboratorium harus mempertimbangkan kemampuan dan keter

1. Effects of Hemoglobin (Hb) E and Hb D Traits On Measurements of Glycated Hb (HbA1C) by 23 Methods Clinical Chemistry 54:8 1277-1282 (2008) Diah Puspita Rini/Fery Hudowo Soedewo

3. DCCT dan United Kingdom Prospective Diabetes Study menyimpulkan bahwa resiko terjadinya komplikasi berhubungan langsung dengan kontrol glukosa darah yang diukur sebagai HbA1c

4. The National Glycohemoglobin Standardization Program didirikan untuk menstandarisasi hasil HbA1c 2

6. The National Glycohemoglobin Standardization Program tidak memasukkan interferens ini sebagai bagian dari program sertifikasi

7. Varian Hb yang paling banyak adalah HbS, HbE, HbC dan HbD3

10. Varian Hb terbanyak ke-2 di dunia dan sering ditemukan di Asia Tenggara, prevalensinya 30-40 % Thailand, Laos dan Kamboja

11. Hb varian yang sering ditemukan di Amerika Serikat karena banyaknya imigran yang masuk 5 HbE

13. Substitusi glutamin pada asam glutamat pada posisi 121 rantai β

14. Paling sering ditemukan pada daerah Punjab,India (prevalensi 2-3% pada Sikh,Punjab)6 Hb D Punjab

15. BAHAN DAN METODE SAMPEL Whole Blood : - Hb A (n=49) - Hb E trait (n=42) - Hb D trait (n=42) IdentifikasiHb E/HbD : Bio-Rad βthalassemia HPLC system Sebiahydrasyselectrophoresis, pH asamdanbasa 7

16. METODE PEMERIKSAAN Primus ultra2 HPLC Enzim HbA1c Immunoassay Ion-exchange HPLC Capillary electrophoresis 8 Boronate affinity

17. METODE PEMERIKSAAN 9 IMMUNOASSAY A1C Now (Bayer/Metrika), Synchron DxC (Beckman Coulter), Dimension (Dade Behring) Au400 (Olympus Diagnostics), Vitros (Ortho-Clinical Diagnostics), HbA1C (Pointe Scientific) Integra Gen2 dan Tina Quant 917 (Roche Diagnostics), DCA 2000 (Siemen Medical Solutions)

19. Menarini Diagnostics : HA 8160 Diabetes (DM) Mode dan HA 8160 Thalassemia program (TP) mode

22. Regresi linier (SAS software) untuk menentukan apakah adanya Hb E atau Hb D trait menyebabkan perbedaan statistik yang signifikan (P<0.01) pada hasil HbA1c, dibandingkan dengan metode pembanding

24. HASIL 14

26. Gambar 1. Perbedaan absolut antara metode tes dan metode pembanding 16 Immunoassay Ion exchange HPLC CE BA ENZ

27. 17

29. Tidak ada interferens yang disebabkan HbE dan HbD pada metode immunoassay karena letak substitusi asam amino jauh dari N-terminal dari rantai β, dimana glikasi HbA1c dan antigen binding terjadi18

31. Jikaadapeak yang tidakdapatdiidentifikasisebelumAopeak, hasiltidakdapatdikeluarkan.HaliniterjadipadaHbEtrait, danpadapenelitianinijugahasilHbEtidakdapatdilaporkan19

33. HasilHbEtdkdapatdikeluarkankarenaadanyapeak ekstra yang munculantarapeak A1Cdan A020

35. Data menunjukkanbahwakromatogramHbE trait tidakdapatdibedakandenganHbAA, untungnyahasildaripenelitianinimenerangkanbahwahasildarikromatogramHbEinidapatditerima21

37. Walaupun tidak disebutkan dalam instruksi manual, sampel HbD trait akan memberikan gambaran kromatogram dengan peak yang tidak dapat dikenali, salah satunya memisahkan peak antara A1c dan A022

39. HasilpenelitianinimenunjukkanbahwahasilHbEdanHbDtraitpadaalatinidapatditerima23

41. SemuaHbEdanHbDtraitkromatogramnyamasukdalam peak “variant window” yang tampaksebagaisplitpada peak A0

42. Hasilpenelitianinimenunjukkanbahwahasil Varian II Turbo tidakdapatditerima24

44. HbEmunculterpisah HbA2 window, menyebabkannilai HbA2 yang sangattinggi (sampai 30%)

45. Secaraklinisdapatditerima, hasillebihbaikdenganshort program25

47. HbDtraitmenunjukkanpeakekstrapada “S/C Window”

48. Pada 75% kasus,peaktidakberlabel, hasil HbA1c tidakkeluardanpadakromatogrammengindikasikanadanya “separasi abnormal”26

50. Untuk sampel HbD trait yang hasil HbA1c-nya keluar, hasil diluar batas klinis yang diterima

51. HbE trait,peak ekstra yang kecil pada pinggir dari peak A0 yang tidak terpisah sepenuhnya atau teridentifikasi 27

56. Beberapa penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa beberapa metode HbA1c dipengaruhi oleh adanya Hb varian seperti HbS dan HbC trait, tetapi sedikit data tentang HbE dan HbD trait

57. HbD dan HbE trait urutan ke 2 dari 4 Hb varian paling sering di US dan dunia30

59. Pada penelitian ini,metode immunoassay, enzimatik dan boronate affinity tidak menunjukkan interferens yang signifikan secara klinis, sedangkan beberapa metode ion-exchange HPLC menunjukkan interferens terhadap HbE, HbD trait, atau keduanya31

61. Hasil HbA1c yang salah dapat menyebabkan:

62. Terapi yang kurang untuk hiperglikemia, menyebabkan peningkatan komplikasi

63. Terapi berlebihan menyebabkan resiko terjadinya hipoglikemia 32

65. Klinisi harus mempertimbangkan kemungkinan adanya Hb varian jika hasil HbA1c pasien tidak sesuai dengan glukosa darah, hasil diagnostik tes yang lain atau gejala klinis

66. Selain interferens dari Hb varian, faktor biologis lain juga harus dipertimbangkan, cnth: masa hidup eritrosit atau varian Hb yang kecepatan glikasinya berbeda dengan HbA menyebabkan hasil HbA1c rendah/tinggi palsu33

67. Thank You !

68. Kromatogram Variant 35

69. Kromatogram Variant II Turbo 36

70. Kromatogram Menarini DM Mode 37

71. Kromatogram Menarini TP Mode 38

72. 39

73. 3 ways cation-exchange gHb affected by variant Hbs 40

74. Efek HbS dan HbC pada HbA1c immunoassay 41

75. Faktor-faktor yang berpengaruh pada pengukuran HbA1c Hemoglobin Variants and Derivatives: Genetic variants (e.g. HbS trait, HbC trait) and chemically modified derivatives of hemoglobin (e.g. carbamylated Hb in patients with renal failure, acetylated Hb in patients taking large amounts of aspirin) can affect the accuracy of HbA1c measurements. The effects vary depending on the specific Hb variant or derivative and the specific HbA1c method. When selecting an assay method, laboratories should take into consideration characteristics of the patient population served, (e.g. high prevalence of hemoglobinopathies or renal failure).Shortened Erythrocyte Survival: Any condition that shortens erythrocyte survival or decreases mean erythrocyte age (e.g., recovery from acute blood loss, hemolytic anemia) will falsely lower HbA1c test results regardless of the assay method used HbA1c results from patients with HbSS, HbCC, and HbSC must be interpreted with caution given the pathological processes, including anemia, increased red cell turnover, transfusion requirements, that adversely impact HbA1c as a marker of long-term glycemic control. Alternative forms of testing such as glycated serum protein (fructosamine) should be considered for these patients.Other factors: Vitamins C and E are reported to falsely lower test results, possibly by inhibiting glycation of hemoglobin ; vitamin C may increase values with some assays . Iron-deficiency anemia is reported to increase test results . Hypertriglyceridemia, hyperbilirubinemia, uremia (see carbamylated Hb ), chronic alcoholism, chronic ingestion of salicylates, and opiate addiction are reported to interfere with some assay methods, falsely increasing results 42

76. 43

77. 44

78. Metode Immunoassay 45

79. 46

80. 47

81. 48