Pourquoi un diagnostic du paludisme ? - Conférence de la 1ère édition du Cours international « Atelier Paludisme » - FANDEUR Thierry

1. Pourquoi un diagnostic
du paludisme ?
Bénéfice pour le malade
Bénéfice pour la communauté
Adaptation du traitement
Maîtrise des résistances

2. Comment ?
Diagnostic de présomption
Diagnostic direct
Microscopie
QBC
Test rapide ou «dipstick»
PCR
Diagnostic indirect ou sérologique

3. 1 . Diagnostic présomptif
Circonstances
Eléments d’orientation
Epidémiologiques
Cliniques
Biologiques
Avantages
Inconvénients

4. 2. Diagnostic direct
Se fait à partir du sang
Quand effectuer le prélèvement ?
Combien de prélèvements ?
Procédure et précautions
Au moment du prélèvement : gants,
matériel jetable, etc.
Transport des prélèvements
Traitement au laboratoire

5. 2. Diagnostic direct
1 Mise en évidence du parasite :
Microscopie
Quantitative Buffy Coat (QBC)
Cytométrie de flux
2 Mise en évidence d’ag parasitaire
Test rapide sur bandelette (dipstick)
ELISA, RIA
3 Mise en évidence d’ADN parasitaire
PCR
Sondes nucléiques

6. 2.1.a Microscopie
La goutte épaisse et le frottis
Réalisation pratique
La coloration
Giemsa
Autres colorations
Points techniques importants

7. 2.1.a Microscopie
La lecture au microscope
Sensibilité de la méthode et
expression de la densité parasitaire
Pour 100 champs de microscope soit 10 min. de lecture
nb de GR nb de GB volume examiné sensibilité
Frottis 5x 10 4 60 0,01 µl 100-200 para /µl
Goutte épaisse 1x 10 6 1200 0,2 µl 10-20 para /µl
1 µl de sang il y a environ 5 000 000 de GR et 6000 GB

8. 2.1.a Microscopie
La lecture au microscope
Les formes parasitaires

9. 2.1.a Microscopie
La lecture au microscope
Les espèces parasitaires Pf, Pv, Po, Pm
Distribution hétérogène
Diagnostic d’espèce sur la base de
critères morphologiques

12. 2.1.a Microscopie
Avantages
Faible coût
Morphologie (stades, espèces)
Bonne sensibilité
Quantitatif
Lecture rétrospective

13. 2.1.a Microscopie
Inconvénients
Délai
Personnel expérimenté
Equipement
Problème des infections mixtes

14. 2.1.b QBC
Principe
Sang au bout du doigt
Tube capillaire+Acridine O
Centrifugation
Lecture microscope UV
FLUORESCENCE
Sensibilité
Volume examiné : 60 µl vs 0.2 µl GE
Sensibilité 1 para/µl

15. 2.1.b QBC
P vivax P falciparum
P falciparum P vivax+ granulocytes Pf gametocyte

16. 2.1.b QBC
Avantages
Rapidité
Bonne sensibilité
Inconvénients
Toxicité de l’acridine, coût élevé
Equipements
Personnel expérimenté
Pas approprié au terrain
Pas quantitatif, espèces ?

17. 2.1.c Cytométrie
Marquage des cellules avec un colorant
fluorescent : Hoechst ou thiazole orange
Tri des cellules en fonction de la
fluorescence et de la taille
Evaluation de la parasitémie. Très bonne
sensibilité mais bruit de fond important dû
aux réticulocytes
Utilisée couplée avec immunofluorescence
de surface pour analyse phénotypique GRP

18. 2.2.a Test Rapid «Dipstick»
Principe : Détection d’antigènes
parasitaires par immunochromatographie
Récolte du sang au bout du doigt
Lyse du sang
Migration des antigènes libérés
Détection avec un ou plusieurs Acmx
marqués

19. 2.2.a Test Rapid «Dipstick»

20. 2.2.a Test Rapid «Dipstick»
Quels antigènes ?
HRPII
P.falciparum (ICT, ParaSight, ParaCheck)
Trophozoites et jeunes gamétocytes
Fonction de détoxification de l’hème ?
pLDH
Antigène non spécifique (OptiMal)
Tous les stades
Autres utilisations
Alternative aux méthodes isotopiques

21. 2.2.a Test Rapid «Dipstick»
Sensibilité
>95% (comparé à la microscopie
100%)
100 % pour Pf pour des densités >300
p/µl
Sensibilité moindre pour Pv (autres
espèces ?)

22. 2.2.a Test Rapid «Dipstick»
Spécificité
Autour de 90%
Faux positifs (HRPII essentiellement)

23. 2.2.a Test Rapid «Dipstick»
Avantages
Rapide : 5 min.
Peut être réalisé sans expérience
Bonne sensibilité et bonne spécificité
Ne nécessite pas d’équipements
spécifiques
Adapté au terrain

24. 2.2.a Test Rapid «Dipstick»
Inconvénients
Coût : 1-2 USD.
Pas quantitatif
Ne distingue pas Pv des autres espèces
Stabilité des réactifs sur le terrain ?
Nombre important de faux positifs
Ne donne pas d’indication sur la
viabilité des parasites

25. 2.2.a Test Rapid«Dipstick»

26. 2.2.b RIA et ELISA
Principe : Détection d’antigènes para-
sitaires
Utilisation d’anticorps monoclonaux
Technique en « sandwich »
Pas d’intérêt réel pour le diagnostic
Utilisables pour la détection de
sporozoites chez les vecteurs

27. 2.3 Diagnostic Moléculaire
Principe
ADN du parasite
PCR et /ou hybridation
Choix de séquences cibles avec
régions polymorphes et conservées
Analyse

28. 2.3.a Diagnostic Moléculaire
DIAGNOSTIC PAR PCR
SSUrRNA genes
PRIMAIRE
SECONDAIRES Spécifiques
1 de genre
P. sp
P . falciparum
2 P. vivax Spécifiques
P. malariae d’espèces
P. ovale

29. 2.3.a Diagnostic Moléculaire
1. Amplification spécifique de genre
1 2 3 4 5 6
Pf Pv Po PM
Pri
Sec

30. 2.3.a Diagnostic Moléculaire
2. Amplifications spécifiques d’espèce
V M F O

31. 2.3.a Diagnostic Moléculaire
Avantages
Petit prélèvement : «blood spot»
ADN utilisable pour génotypage, clonage …
Caractérisation fine par séquençage
Bonne sensibilité : 1-3 parasites par µl
Bonne spécificité : proche de 100 %
Détection de formes parasitaires atypiques
Etudes rétrospectives
Partiellement automatisable
Semi-quantitatif

32. 2.3.a Diagnostic Moléculaire
Inconvénients
Temps nécessaire pour l’analyse
Coût
Equipement
Bonne technicité (contaminations)

33. 2.3.b Sondes Moléculaires
Principe
Extraction ADN
«Spotting »
Dénaturation / neutralisation
Hybridation avec des sondes
marquées
Lecture
Commentaires
Séquences répétées SSurRNA, rep 20
ou Tel
Quantités importantes d’ADN

34. Comparaison des méthodes
Parasites Ag parasitaires ADN
Méthodes Microscopie QBC HRPII pLDH PCR
Expertise +++ ++ - - ++++
Equipement + +++ - - ++++
Temps ++ + - - ++++
Diagnostic d'espèce +++ + Pf Pf /non Pf ++++
Adaptation terrain + - ++++ ++++ -
Enquêtes +++ - - - ++++
Quantification ++++ + - - ++
Sensibilité +++ +++ ++ ++ ++++
Spécificité +++ + + ++ ++++
Standardisation Meth +++ ++ ++ ++ +
Coût (USD) 0,05 2,0-4,0 2 2 2
Points forts Points faibles Intermédiaire

35. 3. Diagnostic sérologique
Principe :
Recherche d’anticorps spécifiques
Détection du complexe ag/ac par
1 . Immunofluorescence indirecte
2 . Elisa
3 . Radioimmunoanalyse
4 . Test sérologique sur bandelette

36. 3.1 IF indirecte
Parasites fixés à l’air
ou à l’acétone
Dilutions du sérum
Anti-anticorps
fluorescent
Mesure de l’extinction
de la fluorescence :
titre en Ac spécifiques

37. 3.2 ELISA
Ag parasitaire brut, ou fraction purifiée,
ou peptide synthétique
Dilutions du sérum
Anti-anticorps marqué par un enzyme
Révélation de l’activité enzymatique
Mesure des DO
Titre en anticorps spécifiques par
rapport à un seuil.

38. 3. 3 ELISA
Exemple d’inhibition
de la réactivité
d’anticorps
spécifiques
Anti-CSP par le
peptide
synthétique
homologue
Pf et par le peptide
hétérologue Pm
correspondant

39. 3. 3 RIA
Comparable aux autres tests dans la
conception :
Gamme de dilutions des sérums
Anti-anticorps marqué avec isotope *
Mesure des cpm
Titre en Ac spécifiques par rapport
à un seuil

40. 3.3 Dipsticks pour sérologie
Format « dipstick »
Détection qualitative des Ac spécifiques
dans le sang, plasma ou sérum.
Spécifique pour Pv et Pf
Sensibilisation du support avec les Ag
CSP et MSP1
Enquêtes épidémiologiques

41. 3.4 Utilité de la sérologie ?
Pas d’intérêt pour le diagnostic
sauf :
Criblage des donneurs de sang
Complément d’information chez un
patient suspecté de paludisme mais
avec gouttes épaisses négatives
Diagnostic d’espèce rétrospectif

42. PISTES DE RECHERCHE
Améliorations possibles
Tests rapides
Lecture quantitative
Caractérisation des espèces
Améliorer la sensibilité et la spécificité
Instaurer un contrôle qualité
Développer une banque de réactifs pour
tester la qualité des « dispticks »
Combiner sur la même bandelette un
diagnostic paludisme et Dengue

43. PISTES DE RECHERCHE
Améliorations possibles
PCR
Standardiser la méthode
Développer un kit PCR de diagnostic
Automatiser la méthode pour des
études à grande échelle

44. PISTES DE RECHERCHE
Recherche
Tests rapides
Etudier la persistances des antigènes
HRPII et pLDH après le traitement.
Etudier le polymorphisme HRPII et pLDH
chez des parasites sauvages.
Développer d’autres systèmes
antigéniques pour la détection spécifique
des stades asexués et sexués

45. PISTES DE RECHERCHE
Recherche
Tests rapides
Evaluer la possibilité de mise au point
d’un test rapide pour déterminer la
sensibilité d’un isolats à un médicament
Etudier la durée de validité des
« dipsticks » dans les conditions du
terrain