Solubiologian tutkimusmenetelmiä.

1. 9. Solubiologian tutkimusmenetelmiä
Alle olen koonnut muutaman solubiologiassa yleisesti käytetyn tutkimusmenetelmän. Monet
menetelmistä on nykyisin automatisoitu, mutta on tärkeätä, että ymmärrät niiden taustalla olevat
ajatukselliset periaatteet.
Solubiologian tutkimusmenetelmät kehittyvät sellaisella nopeudella, että niiden kattava
kuvaaminen on mahdotonta. Olennaista kuitenkin on tietty solubiologisen tutkimuksen
perusmeininki, nimittäin se, että ala tarjoaa valtavasti ideointimahdollisuuksia luoville
persoonille.
Meininkiin kuuluu myös pieni annos eräänlaista noituutta. Tutkimuksissa ei juuri milloinkaan
tapahdu mitään ihmeellistä tai edes näkyvää. Koeputkissa ja pipeteissä käsitellään lähinnä
pisaroiksi luokiteltavia näytemääriä. Työvaiheiden päättyessä näytteet usein ulkoisesti näyttävät
aivan samalta kuin töiden alkaessakin. Noitamaisten rituaalien lopputuloksena kuitenkin
esimerkiksi siirtogeenisissä eliöissä ilmenee perin juurin kouriintuntuvia uusia ominaisuuksia.
Geenitutkimuksen kehitys on perustunut moninaisiin oivalluksiin, joita yksittäiset tutkijat tai
tutkimusryhmät ovat sattumoisin saaneet. Jännittävää on nähdä, millaisia neronleimauksia
tulevaisuus tuokaan tullessaan! Mieti siis, miltä on mahtanut tuntua tutkijoista, jotka ovat
keksiskelleet mm. tässä esittämiäni menetelmiä.
9.1. Yleisiä piirteitä geenitekniikan menetelmistä
Ennen varsinaisiin menetelmiin tutustumista käymme läpi merkittävimmät geenitekniikassa
käytetyt työkalut. Jotta ymmärrät, mitä työkaluasioista selitän, sinun tulee etukäteen selvittää
itsellesi käsite 3´→ 5´-suunta. Tämä käsite selviää kirjallisissa kurssimateriaaleissamme
olevasta tiedostosta, jonka otsikkona on ” DNA-replikaatio”.
Yhdistelmä-DNA-tekniikalla tarkoitetaan DNA-jaksojen siirtämistä solusta toiseen (ensimmäinen
onnistuminen vuonna 1972 tuloksena Nobel-palkinto). Bakteeri- ja hiivasoluihin siirretyillä
geeneillä tuotetaan esimerkiksi ihmisen insuliinia, kasvuhormonia ja interferonia sekä niitä
tuman sisäisiä entsyymejä (proteiineja), joita geenitekniikka yleisesti tarvitsee työkaluikseen.
Viimeksi mainittujen keksiminen on luonnollisesti ollut koko toiminnan edellytys.
Tärkeimpiä yhdistelmä-DNA-tekniikassa tarvittavia entsyymejä ja muita proteiineja ovat:
1) RNA- ja DNA-polymeraasi
- rakentavat asianomaisia nukleotidiketjuja
- geenien monistamisessa eli PCR:ssä käytetään nykyisin kuumissa lähteissä elävien
bakteerien polymeraaseja
2) Käänteiskopioijaentsyymi eli käänteistranskriptaasi
- rakentaa lähetti-RNA:sta asianomaisen DNA-jakson
- tekee siis transkription takaperin
- eristetty retroviiruksista (esim. HIV on retrovirus)
3) DNA- ja RNA-ligaasi
- liittää yhteen nukleotidijaksoja

2. 4) Restriktioentsyymit
- katkovat nukleiinihappoja kukin tietyn emäsjärjestyksen kohdalta, jättäen leikkauskohtiin
lyhyen yksijuosteisen jakson ”sticky end” (tahmea pää, muutama esimerkki alla kuvassa
55)
- samalla restriktioentsyymillä katkaistujen DNA-jaksojen sticky endeissä on toistensa
kanssa pariutumiskykyiset emäsjaksot, joten kohdatessaan ne kiinnittyvät itsestään
kiinni toisiinsa
- edellisen ominaisuuden vuoksi restriktioentsyymit ovat käteviä silloin, kun DNA-jaksoja
halutaan leikata irti ja siirtää solusta toiseen
- restriktioentsyymien avulla voidaan määrätä, millainen emäsjärjestys tulee irrotettavan
DNA-jakson kumpaankin päähän (tämä helpottaa esimerkiksi PCR-tekniikassa
tarvittavien alukkeiden eli praimereiden valintaa)
- restriktioentsyymejä tuottavia geenejä on eristetty bakteereista ja tunnetaan yli 100
erilaista
- seuraavassa on joitakin sticky end –esimerkkejä (DNA:n katketessa DNA muuttuu
yksijuosteiseksi lihavoinnilla merkittyjen emäsjärjestysten kohdalla, lihavoimattomat
emäkset tarvitaan lihavoitujen jaksojen naapureiksi, jotta restriktioentsyymi tunnistaisi
katkaisupaikan)
5. Monoklonaaliset vasta-aineet
Nämä ovat elimistömme puolustusjärjestelmään kuuluvien B-lymfosyyttien tuottamia vasta-
aineita. Ne tarttuvat hyvin erikoistuneesti kukin vain yhdenlaiseen kohdemolekyyliinsä. Siksi
vasta-aineiden avulla voidaan tunnistaa tai rikastaa liuoksista muita molekyylejä, etenkin
proteiineja.
6. GFP (Green Fluorecent Protein) valoa hohtava proteiini
G AATTC
C TTAA G
G GATC C
C CTAG G
A AGCT T
T TCGA A
G TCGA C
C AGCT G
GC GC
CG CG
Tämä katkaisupaikka jää tylpäksi, siis
ilman sticky end –päätettä.
Kuva 55. Esimerkkejä restriktioentsyymeille ominaisista
katkaisupaikoista.

3. Alkujaan kampamaneeteista löydetyn geenin tuottama proteiini. GFP:tä koodaava geeni
voidaan liittää muiden geenien osaksi. Kun geenit alkava toimia, tämä ilmenee valon
syttymisenä niissä solun osissa, missä GFP:tä tuotetaan. GFP-proteiinia voidaan sellaisenaan
käyttää myös muiden molekyylien, vaikkapa nukleotidiketjujen osana esimerkiksi
geenikoettimissa tai merkkiaineena yhdistämällä GFP monoklonaalisiin vasta-aineisiin.
7. CAS-proteiinit (CRISPR-CAS-menetelmät)
Bakteereille ominainen DNA:ta katkova proteiinikoneisto, jossa ns. crRNA määrää kohdan, josta
DNA-katkeaa. Tutkijat voivat muunnella crRNA:n emäsjärjestystä tutkimiaan DNA-jaksoja
vastaaviksi. Tuloksena on opas-RNA:ta (enkuksi single stranded guide-RNA eli sgRNA).
CRISPR-CAS-menetelmää käytetään geenien toiminnan estämiseen tai siirtogeenisten solujen
tuottamiseen.
Kaikki edellä luetellut ovat proteiineja ja niitä tuotetaan teollisesti mikrobien, lähinnä koli-
bakteerin (Eschericia coli) avulla.
Siirettäviä DNA-jaksoja voidaan ”viritellä” nykyisin lähes kaikin mahdollisin tavoin. Niihin voidaan
liittää halutunlaisia sticky end –jaksoja. Niiden säätelyosia voidaan vaihtaa toisenlaisiksi yli
lajirajojen. Sticky end –päitä voidaan leikata tylpiksi ja siirtogeeneihin voidaan liittää
halutunlaisia emäsjaksoja. DNA- tai RNA-molekyyleihin voidaan liittää sellaisia nukleotideja,
joissa roikkuu monoklonaaliseen vasta-aineeseen liitettyjä fluoresoivia eli valoa hohtavia
lisäosia jne.
Useimpien geenitekniikassa käytettyjen tutkimusmenetelmien käyttö alkaa siitä, että
tutkittavasta DNA-jaksosta tuotetaan PCR-menetelmällä riittävän paljon kopioita.
Toinen monissa menetelmissä toistuva työvaihe on nimeltään elektroforeesi.
9.2. Geenitekniikan perusmenetelmiä
9.2.1. Elektroforeesi
Elektroforeesi on menetelmä, jossa eri kokoisia molekyylejä sisältävästä liuoksesta voidaan
erotella molekyylejä kokoluokittain. Tässä läskiä muistuttavan elektroforeesihyytelölevyn toiseen
päähän (valmistettu etupäässä keittiöstä tutuista aineksista) tehtyyn viiltoon tipautetaan pisara
erikokoisia esimerkiksi DNA:ta, RNA:ta tai proteiinimolekyylejä sisältävää näytettä.
Kun levyn läpi tämän jälkeen johdetaan sähkövirta, tutkittavan näytteen sisältämät molekyylit
alkavat liikkua virran mukana. Mitä lyhyemmästä molekyylistä on kysymys sitä nopeammin (=
pitemmälle) se läskin sisällä liikkuu. Jokaisesta molekyylien kokoluokasta muodostuu näin oma
raitansa läskin sisälle (raidat näkyvät UV-valossa). Raitojen määrä kertoo, kuinka monta
molekyylien kokoluokkaa näytteessä on.
Tapahtumaa voitaisiin verrata repun kantamiseen. Kevyttä reppua (pieniä molekyylejä) jaksaa
kuljettaa nopeasti ja pitkälle, raskasta reppua (suuria molekyylejä) taas hitaasti ja vain lyhyen
matkan. Repun kantajaa elektroforeesissa vastaa sähkövirta (Kuva 56).

4. Alla olevasta menetelmien luettelosta puuttuvat monoklonaalisten vasta-aineiden käyttöön
liittyvät sovellutukset. Ne olen esitellyt immunologiaa käsittelevän tiedostoni yhteydessä.
9.2.2. PCR-menetelmä (kuva 57 alla)
PCR-menetelmä alkaa siitä, että koeputkeen lisätään kopioitavan DNA-näytteen ohella DNA-
polymeraasia, DNA-nukleotideja ja praimereita. Praimereiden emäsjärjestys tulee valita
sellaiseksi, että se vastaa DNA-näytteen 3´-päissä olevia emäsjärjestyksiä. Tämä emäsjärjestys
taas määräytyy DNA-jakson irtileikkaamisessa käytettävän restriktioentsyymin perusteella
(Helppoa tietää siis!). Erilaisia praimereita saa nykyisin ostaa pullossa.
Yhden kopiointikierroksen jälkeen tuloksena on kaksi alkuperäisen kaltaista DNA-molekyyliä.
Seuraavan kierroksen jälkeen kopioita on neljä, sitten kahdeksan, kuusitoista jne. Koska yksi
kierros kestää parisen minuuttia, saadaan vaikkapa kahden tunnin aikana kaksi potenssiin 60
kappaletta kopioita.
Menetelmässä käytetään nykyisin DNA-polymeraasia, joka on eristetty Thermus aquaticus –
nimisestä bakteerista. Tämä laji elää kuumissa lähteissä ja sen lämpötilaoptimi on 75 C astetta.
Elintavastaan johtuen lajin DNA-polymeraasi kestää lämmityksen myös 98 C asteeseen. Tämän
ominaisuuden vuoksi DNA-polymeraasia ei tarvitse lisätä PCR-putkeen enää reaktiokulun
aikana.
_
Kuva 56. Elektroforeesin toimintatapa. Kun sähköä johtavan
elektroforeesilevyn päihin kytketään elektrodit, alkavat näytteessä
(sininen viiva) olevat molekyylit liikkua levyn sisällä sähkövirran mukana.
Pienet molekyylit liikkuvat nopeammin kuin suuret. Lopulta molekyylien
kokoluokat erottuvat levyssä omina raitoinaan (harmaat juovat).
+
_
+

5. Kuva 57. PCR-menetelmä eli geenien kopioiminen koeputkessa
3´AATCGTAGCTAAGGTTCTTCGATT5´
3´AATCGTAGCTAAGGTTCTTCGATT5´
5´TTAGCATCGATTCCAAGAAGCTAA3´
5´TTAGCATCGATTCCAAGAAGCTAA3´ 3´AATCGTAGCTAAGGTTCTTCGATT5´
Kuumennus + 98 C, jolloin
DNA avautuu kahdeksi
yksijuosteiseksi molekyyliksi
GATT5´
5´TTAGCATCGATTCCAAGAAGCTAA3´
5´TTAG
3´AATCGTAGCTAAGGTTCTTCGATT5´
Lämmitys 75 C:een, jolloin
DNA polymeraasi alkaa
toimia
Monistettava DNA-näyte
Jäähdytys 45 C:een, jolloin praimerit
(merkitty harmaalla) kiinnittyvät
paikoilleen ihan itsestään..
Yhden kierroksen jälkeen tuloksena on
kaksi alkuperäisen DNA-jakson
kaltaista kopiota.
5´TTAGCATCGATTCCAAGAAGCTAA3´3´AATCGTAGCTAAGGTTCTTCGATT5´
5´TTAGCATCGATTCCAAGAAGCTAA3´

6. 9.2.3. Vektorit eli geenikuljettimet (siis vähän niin kuin traktorit)
Yhdistelmä-DNA-tekniikassa tarvitaan DNA-jakson kohdesoluun kuljettavia apulaisia, niin
sanottuja vektoreita.
Bakteerien perimää muutettaessa tärkein vektorityyppi ovat plasmidit eli rengasmaiset DNA-
jaksot. Siirrosgeeni on siirrettävissä näihin. Bakteerit ahmivat plasmideja sisälleen
kasvatusmaljalta.
Eläin- ja kasvisoluihin siirrosgeenit viedään usein viruksen avulla ja sen genomiin kytkettynä.
Tekniikkaa sovelletaan usein myös bakteereihin. Suora mikroinjektio eli ruiskutus tumaan on
myös joskus mahdollista.
Kasveihin geenit saadaan siirrettyä käyttämällä vektorina Agrobacterium-suvun
maaperäbakteereita (=agrobakteereita). Nämä siirtävät omia plasmidejaan kasvisoluihin siten,
että ne kiinnittyvät saumattomasti kasvikromosomien osiksi. Solun jakautuessa kromosomien
mukana kulkevat siirtogeenit siirtyvät kaikkiin tytärsoluihin. Tämä on valtava etu, sillä ellei
siirtogeenejä saada liittymään kromosomeihin, siirretyt DNA-jaksot usein hukkuvat soluista
niiden jakautuessa.
Ilmeisesti katoaminen johtuu siitä, että mitoosin metafaasissa muodostuva tumasukkula
sukkularihmoineen kiinnittyy vain kromosomaalisessa DNA:ssa oleviin sentromeerikohtiin.
Solussa irrallaan olevat muut DNA-jaksot jätetään tumasukkulavaiheessa oman onnensa
nojaan. Tutkijapiireissä on tämän murhenäytelmän estämiseksi kehitetty jopa keinotekoisia
pienoiskromosomeja sentromeereineen. Toiveena on, että keinokromosomin saanut solu
kohtelisi sitä tavanomaisten kromosomiensa tapaan.
Bakteereihin siirrettävä geeni liitetään ennen siirtoa usein johonkin toiseen ns. merkkigeeniin,
kuten antibioottiresistenssitekijöihin (= lääkeainevastustuskykytekijöihin). Lopullisen istutuksen
jälkeen merkkigeenin avulla voidaan tunnistaa onnistuneet istutukset altistamalla
kasvatusmaljan bakteerit kyseiselle antibiootille. Vain ne bakteerit, joissa on resistenssitekijä
(siis myös siirretty geeni) säilyvät hengissä lääkekäsittelystä.
Siirtogeeneihin on liitettävä sellainen geenin säätelyosa, joka toimii siirron kohteena olevassa
solutyypissä. Bakteereihin siirrettäessä käytetään bakteereille ominaisia säätelyosia,
aitotumallisiin soluihin tarvitaan näille ominaiset säätelyosat. Säätelyosat voidaan valita
sellaisiksi, että ne esimerkiksi tietyn lääkeaineen vaikutuksesta käynnistävät tai sulkevat
siirtogeenin. Tietyillä säätelyosilla siirtogeenit saadaan käynnistymään tai sulkeutumaan
lämpötilaa vaihtamalla. jne. Luovuudelle on tilaa! On myös hyvä muistaa, että geenit, joissa on
intronijaksoja mukana (tsekkaa käsite introni tiedostosta ”karmea totuus proteiinisynteesistä”),
eivät toimi bakteerisoluissa.
9.2.4. Genomisen geenikirjaston perustaminen (Kuva 58)

7. Bakteeri
1. Genominen (= kaikki
solun sisältämä) DNA
eristetään.
2. DNA pilkotaan jollakin
restriktioentsyymillä.
Syntyvää silppua
monistetaan PCR-
menetelmällä.
3. Liitetään DNA-jaksot
plasmideihin, jotka on
avattu samalla
restriktioentsyymillä.
Tällöin plasmidien ”sticky
endit” sopivat DNA-
pilkkeiden päihin.
4. Plasmidit istutetaan
bakteereihin. Bakteerit
ottavat plasmideja sisäänsä
ihan itsestään.
5. Bakteereita viljellään
maljoilla niin laihana
seoksena, että kukin
bakteeripesäke syntyy
yhden bakteerin
jälkeläisistä. Tällöin kukin
pesäke on samaa
bakteerikloonia.
Bakteerin oma
DNA
Bakteeripesäke
Siirretty DNA
6. Kun kasvatusmaljoja on paljon, on todennäköistä, että jokainen DNA-
jakso on päässyt ainakin yhden bakteerin sisään. Jos jokin tietty DNA-
jakso alkaa myöhemmin tuntua kiinnostavalta, kyseistä DNA-jaksoa
sisältävät pesäkkeet voidaan myöhemmin tunnistaa maljoilta
geenikoettimien avulla.
Kasvatusmalja
Kuva 58. Genomisen geenikirjaston perustaminen

8. Geenikoettimille komplementaarista DNA:ta sisältävien bakteeripesäkkeiden etsiminen
geenikirjastoista
Jos bakteeriviljelmään on kerralla istutettu suuri määrä erilaisia DNA-jaksoja, voidaan
viljelmästä tunnistaa vaikkapa jonkin tietyn geenin saaneet bakteerit geenikoettimien avulla.
Ehtona on, että tiedetään jokin lyhyt, kyseiselle geenille luonteenomainen emäsjärjestys.
Tällöin voidaan PCR:llä valmistaa tälle emäsjärjestykselle komplementaarisia geenikoettimia.
Geenikoettimet valmistetaan yleensä radioaktiivisista nukleotideista, jolloin ne on helppoa
myöhemmin havaita radioaktiivisuudelle herkällä filmillä.
Mainitun geenin sisältävien pesäkkeiden etsimistä varten kasvustosta otetaan kopio
esimerkiksi nailonkelmulle yksinkertaisesti painamalla se kasvatusalustaa vasten. Kustakin
pesäkkeestä jää tällöin kelmulle pieni bakteereita sisältävä tahra.
Kelmulle kiinnittyneistä bakteereista liuotetaan pois kaikki muut solujen rakenteet paitsi DNA-
molekyylit. DNA-molekyylit avataan yksijuosteisiksi emäskäsittelyllä ja kestävöidään kiinni
muovikelmuun.
Seuraavaksi kelmua huljutetaan valmistamiamme geenikoettimia sisältävässä liemessä.
Tällöin kelmulla tapahtuu in situ –hybridisaatio sellaisten DNA-molekyylien kohdalla, joissa
esiintyy geenikoettimellemme komplementaarisia emäsjärjestyksiä.
Nailonkelmua ja kasvatusmaljalla olevia bakteeripesäkkeitä toisiinsa vertailemalla
komplementaarisia emäsjärjestyksiä sisältävät pesäkkeet voidaan jäljittää. Niissä olevat
bakteerit otetaan nyt lähempään jatkokäsittelyyn.
Siirtogeeninen DNA-jakso voidaan tarvittaessa leikata uudelleen irti. Tämä käy näppärästi, sillä
siirtogeenien istuttamisessa käytetyn plasmidin sticky end -päät ovat siirtäjän tiedossa. Jos
plasmidit avataan samalla restriktioentsyymillä, jolla ne ennen siirtogeenin istuttamista avattiin,
irtautuvat siirtogeenijaksot ulos plasmideista sellaisinaan. Ne voidaan sitten monistaa PCR:n
avulla ja erottaa muista DNA-molekyyleistä elektroforeesilla.
Vertailussa genomiset ja cDNA-geenikirjastot
Genomisten eli bakteerikasvatukseen perustuvien geenikirjastojen etuna on, että niissä ovat
mukana myös geenien väliset nonsense-DNA-jaksot (nämä kattavat peräti 97 % DNA:sta),
geenien rakenneosissa lymyilevät intronit sekä geenien säätelyosat (promoottorit, enhanserit ja
silenserit). Vaikkapa homeobox-geenejä tutkittaessa kiinnostuksen kohteena saattavat olla juuri
säätelyosat.
Silloin, kun geenikirjasto tuotetaan käänteiskopioijaentsyymin avulla pelkistä lähetti-RNA-
molekyyleistä, tuloksena on kopioita vain geenien rakenneosista. Säätelyosien lisäksi näistä
puuttuvat geenien rakenneosan sisälle jäävät intronijaksot. cDNA-geenikirjastoissa ei siis
esiinny introneita eikä edellä mainittuja geenien säätelyyn osallistuvia DNA-jaksoja. Juu!

9. 9. 2. 5. Northern blotting eli solukkonäytteen sisältämien kaikkien lähetti-RNA-
molekyylien eristäminen
- aluksi tutkittava solukkonäyte murskataan puuroksi ja siitä liuotetaan pois muut
orgaaniset molekyylityypit (siis hiilihydraatit, rasva-aineet ja proteiinit) paitsi
nukleiinihapot (=DNA ja RNA)
- mRNA-molekyyleissä on Poly-A-häntä (asia tulee esille tiedostossa ”Karmea totuus
proteiinisynteesistä”) → käytetään eristämiseen suodatinta, jossa on paljon Poly-T-
häntiä
- uutetaan mRNA-molekyylit irti suodattimesta ja pannaan näyte
elektroforeesihyytelölle sähkökenttään → hyytelölle ilmestyy raidoitus molekyylien
kokoluokkien mukaan (pienet molekyylit siirtyvät kauas lähtöpaikastaan, suuret
jäävät sen lähelle)
- otetaan raidoista kopsut imupaperille
- myöhemmin raidoista voidaan valkata kulloinkin kiinnostavilta tuntuvien
geenikoettimien (esim. homeobox) avulla jatkotarkasteluun mielenkiintoisimmat
- käänteiskopioijaentsyymin avulla voidaan loihtia ao. geenit esim. istutettaviksi
pöpöihin (näin tuotettua DNA:ta kutsutaan cDNA:ksi)
- jos käänteiskopiointiin otetaan kaikki raidat, saadaan syntymään geenikirjasto
- näin tuotetussa geenikirjastoissa on mukana vain geenien rakenneosia koodaavat
DNA-jaksot (lähetti-RNA-molekyyleissähän ei ole introneita eikä geenien
säätelyosia)
- cDNA-kirjastot ovat siis hieman erilaisia kuin bakteerikantoihin kloonatut ns.
genomiset kirjastot (kirjassa s. 42), jotka puolestaan sisältävät kaiken tutkittavalle
eliölajille ominaisen DNA:n (intronit, eksonit, säätelyjaksot ja geenien ulkopuolelle
jäävän nonsense-DNA:n)
9.2.6. In Situ –hybridisaatio (Kuva 59) eli geenikoettimien toimintaperiaate

10. Kiinnostuksen kohteena oleva
DNA-jakso, vaikkapa homeo-
sekvenssi
PCR:ään, jossa radiohiiltä
sisältäviä nukleotideja
PCR pysäytetään kuumaan
(siis yksijuosteiseen)
vaiheeseen ja DNA-
molekyylien pysyminen
yksijuosteisina varmistetaan
esim. emäskäsittelyllä
Kudosleike (esim alkion
pitkittäisleikkaus) upotetaan näin
tuotettuja geenikoettimia
sisältävään liuokseen (kuva
oikealla).
Huljutetaan pesuliuoksessa irto-
DNA pois.
Radio-DNA-juosteet (= geenikoettimet)
kiinnittyvät niihin kohtiin leikettä, joissa on
niiden emäsjärjestykselle vastakkaisia
mRNA-juosteita
Radioherkällä filmillä
geenikoettimien sijaintipaikat
näkyvät täplinä tai raitoina
alkiossa. Näissä kohdissa
kyseinen geeni toimii!
A
T
G
G
C
C
A
A
T
T
A
C
C
G
G
T
T
A
A
T
G
G
C
C
A
A
T
A
T
G
G
C
C
A
A
T
A
T
G
G
C
C
A
A
T
A
T
G
G
C
C
A
A
T
U
A
C
C
G
G
U
U
A
Tutkittava leike
(esim. ohutleike
alkiosta) RNA-
molekyyleineen
Yksijuos-
teista radio-
DNA:ta
Kuva 59. In Situ –hybridisaatio eli geenikoettimien toimintaperiaate
Kuvasarjan ymmärtääksesi tee ensin itsellesi selväksi PCR-menetelmä.

11. 9.2.7. Geneettinen sormenjälki
Tämän menetelmän ymmärtäminen edellyttää, että olet ensin perehtynyt
restriktioentsyymeihin, PCR-menetelmään ja elektroforeesin perusideaan.
1. Epäillyltä otettu
kudosnäyte
1. Rikospaikalta
kudosnäyte (verta,
hius, hilsettä tms.)
2. Eristetään esim. yksi
kromosomi
2. Eristetään se sama
kromosomi
3. DNA paloitellaan
restriktioentsyymillä
3. DNA paloitellaan
samalla restriktio-
entsyymillä
4. PCR:ään 4. PCR:ään
5. Näyte elektroforeesi-
hyytelölle
5. Näyte elektroforeesi-
hyytelölle
6. Jos raidat kummassakin hyytelössä
ilmestyvät samoille kohdille, epäilty on
syyllinen.
9.2.8. DNA:n sekvenssointi eli emäsjärjestyksen lukeminen (Sanger-menetelmä)
Kenties tärkein solubiologisen tutkimuksen saavutuksista on kyky lukea DNA:ssa olevia
emäsjärjestyksiä. Emäsjärjestyksien perusteella voidaan päätellä DNA:n koodaamien
proteiinien aminohappojärjestys (kolme rinnakkaista emästähän koodaa aina yhtä
aminohappoa). Näin voidaan paremmin ymmärtää esimerkiksi tiettyjen geenivirheiden

12. aiheuttamia molekyyli- ja solutason vaikutuksia. DNA:n emäsjärjestyksen selvittäminen antaa
myös mahdollisuuden vertailla eri eliölajien geenirakenteita. Vaikkapa Homeobox-geenien
toimintatapa ja niiden universaalius eläinkunnassa ymmärrettiin vain tällaisen puuhastelun
tuloksena.
Kuvaan tässä niin sanotun Sanger-menetelmän (Nobel-palkinto vuonna 1980), jota kutsutaan
myös dideoksynukleotidimenetelmäksi. Menetelmän kehitti tutkija nimeltään Frederick Sanger.
Samainen kaveri oli jo vuonna 1958 saanut ensimmäisen Nobel-palkintonsa selvitettyään
insuliini-hormonin aminohappojärjestyksen (1955).
Sanger-menetelmä
Sanger-menetelmä alkaa leikkaamalla haluttu DNA-jakso irti jostakin laajemmasta DNA-
näytteestä, esimerkiksi kromosomista. Leikkaamisessa käytetään restriktioentsyymejä. Koska
nämä entsyymit leikkaavat DNA:ta vain tiettyjen emäsjärjestysten kohdalta, voidaan
restriktioentsyymien avulla määrätä, millainen emäsjärjestys tulee irrotettavan DNA-jakson
kumpaankin päähän (kuva 60).
Tutkittavassa DNA-molekyylissä olevien sticky end -päiden emäsjärjestykset tunnetaan
leikkaamisessa käytetyn restriktioensyymin perusteella. Sen sijaan DNA-jakson muu
emäsjärjestys (alla olevissa esimerkeissä sinisellä) on tässä vaiheessa tuntematon. Tämä on
siis se osa DNA-molekyyliä, joka halutaan sekvenssoida.
Esimerkiksi, jos toinen yksöisjuosteista on 3´ATGAGGATGGTAA 5´, on tälle
kompelementaarinen yksöisjuoste emäsjärjestykseltään 5´CCTACCATTAGTA 3´.
Kaksoisjuosteena ne näyttäisivät seuraavalta:
G AATTC
C TTAA G
G GATC C
C CTAG G
A AGCT T
T TCGA A
G TCGA C
C AGCT G
GC GC
CG CG
Tämä katkaisupaikka jää tylpäksi,
siis ilman sticky end –päätettä.
Kuva 60. Esimerkkejä restriktioentsyymeille
ominaisista katkaisupaikoista.

13. ssDNA:n tuottaminen
Emäsjärjestyksen selvittäminen aloitetaan ns. epäsymmetrisellä PCR:llä. Siinä kopioitavan
DNA-kaksoisjuosteen päät muokataankin emäsjärjestykseltään erilaisiksi. Tällöin praimerit
voidaan valita sellaisiksi, että ne kiinnittyvät DNA-juosteessa vain jompaankumpaan 3´-päähän
(kuva 61).
Edellä kuvatun toimenpiteen vuoksi PCR:n tuottamat kopiot edustavatkin nyt vain toista
DNA:ssa alkujaan olevista yksöisjuostetyypeistä. Epäsymmetrisen PCR:n tuloksena syntyvää
DNA-näytettä kutsutaan tästä lähtien ssDNA:ksi (ss tulee sanoista ”single stranded” eli
yksijuosteinen).
ssDNA:ta ei siis ole mikä tahansa yksijuosteisia DNA-molekyylejä sisältävä näyte, vaan
sellainen, joka nimenomaan sisältää vain jompaa kumpaa komplementaarista juostetyyppiä.
Selostamani vaihe on erittäin tärkeä syystä, jonka perustelen lopussa menetelmän
yleiskuvauksen jälkeen.
3´ATGAGGATGGTAA 5´
5´CCTACCATTAGTA 3´.
5´CCTACCATTAGTA 3´
3´ATGAGGATGGTAA 5´
5´CCTACCATTAGTAGCCGC 3´
3´ATGAGGATGGTAATCATCGGCG 5´
Alkuperäinen restriktioentsyymillä
irroitettu kaksoisjuoste, jonka
molemmissa 3´-päissä on sama
peilikuvamainen emäsjärjestys.
Kaksoisjuosteen toisen pään
aloittava emäsjärjestys on
muutettu toisenlaiseksi (harmaat
emäkset). Nyt praimerit voivat
kiinnittyä vain koskemattomaksi
jätettyyn 3´-päähän.
Kuva 61. DNA:n muokkaaminen epäsymmetristä PCR:ää varten.

14. Eristetyt ssDNA-kopiot jaetaan nyt neljään eri koeputkeen. Jokaisessa koeputkessa PCR:ää
jatketaan tämän jälkeen yksi kierros, kuitenkin sillä erolla, että nyt tavallisten DNA-nukleotidien
lisäksi kuhunkin putkeen sujautetaan jonkin verran myös ns. dideoksynukleotideja. Tällaisia
nukleotideja DNA-polymeraasi voi kyllä liittää aikaisempien nukleotidien jatkoksi, mutta se ei
pysty liittämään uusia nukleotideja enää dideoksynukleotidien perään. Kopiointi siis pysähtyy
aina, kun polymeraasi pahaa aavistamatta liittää ketjun jatkoksi dideoksynukleotidin (ddDNA-
nukleotidin).
Tavallisten ja dideoksynukleotidien eroa havainnollistaa mojovasti seuraava vertaus: jos
tavalliset nukleotidit ovat normaaleita Lego-palikoita, niin dideoksynukleotidien yläpinnalta
puuttuisivat Legoille ominaiset nystermät.
T
T
C
T
G
G
A
T
G
T
T
A
G
A
G
T
A
A
G
G
A
A
C
T
T
A
A
A
A
C
DNA-polymeraasia
DNA:n ddA-nukleotideja (tämän
polymeraasi voi liittää
nukleotidiketjun jatkoksi, mutta
tähän kopiointi pysähtyy)
Tavallisia DNA-
nukleotideja
PCR:n tuloksena saatuja ssDNA-juosteita (3´-pään emäsjärjestys
mustalla).
Kuva 62.
ddA-nukleotideja sisältävä koeputki Sanger-
menetelmän lähtötilanteessa.
PCR-putkeen lisätään kuvassa näkyvät
lähtöaineet emäsjärjestyksen selvittämistä
varten. Siniset aakkoset kuvaavat
tutkittavassa DNA-näytteessä olevaa
emäsjärjestystä, jota tässä vaiheessa ei
vielä tunneta.
Dideoksy-A-nukleotidit on kuvaan merkitty
punaisella.
Kutakin neljää dideoksynukleotidityyppiä
varten tarvitaan oma koeputkensa.
T
C
A
T
T
C
A
T
Praimereita

15. Jos ensimmäiseen koeputkeen laitetaan vain sellaisia ddDNA-nukleotideja, joiden emäs on A eli
adeniini (kuva 62), keskeytyy kopiointi tässä putkessa aina kohtaan, missä viimeisenä
emäksenä on adeniini. Putkeen syntyy suuri määrä geenikopioita, jotka ovat täydellisen pitkiä
vain silloin, kun polymeraasin tielle ei ole osunut yhtään ddDNA-nukleotidia.
Loppuun asti kopioituneiden molekyylien seassa on nyt suuri joukko eri kohdilta kesken
jääneitä tynkiä. Näitä on monen kokoisia, mutta jokaisessa molekyylissä viimeisenä emäksenä
on adeniini. Sanger-menetelmän lopputilanne havainnollistuu kuvissa 63 ja 64.
Kuva 63. ssDNA:ta sisältävät koeputket dideoksy-nukleotidimenetelmällä toteutetun
PCR-kierroksen jälkeen. Kussakin putkessa on valtava populaatio eri kohdista
kesken jääneitä (siis vain lyhyeltä matkalta kaksijuosteisia) kopioita alkuperäisestä
DNA-juosteesta. Mustat viivat ovat mallijuosteita, värilliset viivat ovat uusia kopioita.
Kaikki uudet kopiot päättyvät dideoksy-nukleotidiin.
Seuraavassa vaiheessa jokaisesta koeputkesta tehdään ajo elektroforeesilevyllä
(kuva 65 ).
ddA-putki ddT-putki ddC-putki ddG-putki

16. Sama toistetaan muissakin koeputkissa. Jokaiseen koeputkeen lisätään tavanomaisten PCR-
ainesten lisäksi myös jonkin verran dideoksy-nukleotideja.
Neljästä putkestamme yhdessä on dideoksy-nukleotidien emäksenä tymiini. Yhdessä putkessa
on dideoksy-nukleotideja, joissa emäksenä on guaniini. Ja neljännessä putkessa dideoksy-
nukleotidien emäksenä on sytosiini. PCR:n jälkeen jokaisessa putkessa on valtaisia määrä eri
kokoisia DNA-kopioiden tynkiä hyvin lyhyistä jaksoista aina kokonaisiin kopioihin asti. Mutta
jokaisessa putkessa tyngät päättyvät aina emäkseen, jonka tyyppisiä dideoksynukleotideja
putkeen oli lisätty (kuvat 63 ja 64).
DNA:n emäsjärjestys saadaan nyt selville elektroforeesin avulla. Siinä läskiä muistuttavan
elektroforeesihyytelölevyn (valmistettu etupäässä keittiöstä tutuista aineksista) toiseen päähän
tehtyyn viiltoon tipautetaan näytteet edellä mainituista koeputkista. Jokaiselle putkelle tehdään
oma elektroforeesiajo. (kuva 65).
Kun levyn läpi tämän jälkeen johdetaan sähkövirta, DNA-kopiot alkavat liikkua virran mukana.
Mitä lyhyemmästä molekyylistä on kysymys sitä nopeammin (= pitemmälle) se ”läskin” sisällä
liikkuu.
Kuva 64.
Näyte dideoksy-A-tyyppisiä nukleotideja sisältävän koeputken sisällöstä
PCR-kierroksen jälkeen. Dideoksy-A-nukleotidit on kuvaan varjostettu
punaisella ja praimerit turkoosilla. Tosiasiassa koeputkessa on valtaisa
populaatio kaikkia kuvassa näkyviä A-emäksen kohdalle pysähtyneitä DNA-
kopioita. Tämä ilmenee parhaiten kuvasta 63.
T
T
C
T
G
G
A
T
G
T
T
A
G
A
G
T
A
A
A
A
A
T
C
A
T
T
C
T
T
C
T
G
G
A
T
G
T
T
A
G
A
G
T
A
T
T
C
T
G
G
A
T
G
T
T
A
G
A
G
T
A
T
T
C
T
G
G
A
T
G
T
T
A
G
A
G
T
A
T
C
A
T
T
C
A
T
T
C
A
T
A
T
C
C
A
A
T
C
C
C
T
A
C
A
A
T
C
JNE…

17. Jos esimerkiksi praimerit on valmistettu radiohiiltä sisältävistä nukleotideista, jokaisesta
molekyylien kokoluokasta muodostuu oma radioaktiivinen raitansa ”läskin” sisälle (raidat
näkyvät radioaktiivisuudelle herkällä filmillä). Kun neljän näytteemme jättämiä raitoja tutkitaan
rinnakkain, voidaan DNA-juosteen emäsjärjestys lukea suoraan levyiltä (kuva 65). Emästen
pariutumissäännön perusteella selviää saman tien tietenkin myös komplementaarisen juosteen
emäsjärjestys.
Vertaus pituusjuoksukilpailuun
+-
+
-
-
+
+
+
-
-
ddA-levy
ddT-levy
ddC-levy
ddG-levy
Kuva 65. Elektroforeesin käyttö DNA:n sekvenssoinnissa Sanger-
menetelmällä. Jokaisen dideoksynukleotideja sisältäneen koeputken (=
värit) sisältö ajetaan erikseen omalla elektroforeesilevyllään.
Sekvenssoitavan DNA-näytteen emäsjärjestys on luettavissa raidoista
helposti, kun levyt asetetaan rinnakkain. Kuvassa emäsjärjestys
vasemmalta oikealle olisi CGTATGCATCGATCGATCG (saat järjestyksen
selville kuljettamalla pystyssä olevaa viivotinta kuva-alueen poikki nuolien
kulkusuunnassa).

18. Elektroforeesivaihetta voitaisiin verrata joukkuemuotoisesti tapahtuvaan pituusjuoksukilpailuun.
Kilpailussa on neljä rinnakkaista rataa (= neljä eri ”läskiä”). Radat voidaan nimetä emästen
mukaan ddA-, ddT-, ddG- ja ddC-radaksi (kuva 65) .
Kunkin radan alkuun asettuu joukko eri tavoin raskas- / kevytrakenteisia juoksijoita (= eri
kokoisia DNA:n kopioita asianomaisia dideoksy-nukleotideja sisältäneestä koeputkesta). Kun
lähtölaukaus kajahtaa (sähkövirta kytketään), jokaisen joukkueen jokainen jäsen (=tutkittavat
molekyylit) singahtaa matkaan samanaikaisesti, mutta pysytellen tiukasti omalla radallaan.
Mitä pitempään kilpailun annetaan jatkua sitä suuremmaksi kevytrakenteisten juoksijoiden
etumatka kasvaa raskasrakenteisiin juoksijoihin nähden. Kilpailuajan päättyessä (= kun
sähkövirta katkaistaan) kukin juoksija pysähtyy radalleen. Rata-alueella (= neljä rinnakkaista
läskiä) nyt olevien juoksijoiden järjestys kertoo suoraan DNA-molekyylissä olevan
emäsjärjestyksen.
Miksi Sanger-menetelmässä tarvitaan nimen omaan ssDNA:ta?
Kuvitteellisessa DNA-näytteessämme toisilleen komplementaaristen juosteiden
emäsjärjestykset ovat esimerkiksi seuraavat: 3´ATGAGGATGGTAA5´ ja 5´CCTACCATTAGTA
3´.
Jos emäsjärjestystä olisi yritetty selvittää molempia juosteita sisältävästä näytteestä, olisi
jokaisen dideoksy-G-juovan kohdalle ”läskiin” muodostunut juova myös dideoksy-C-näytteestä.
Samoin jokaisen dideoksy-A-juovan kohdalle olisi muodostunut juova myös dideoksy-T-
näytteestä. Näin siksi, että komplementaariset emäkset A / T ja C / G sijaitsevat yhtä kaukana
molekyylien päistä.
Olisimme siis saaneet selville kylläkin peräkkäiset emäsparit, mutta emme sitä, mitkä
asianomaisista emäksistä olisivat kuuluneet samaan juosteeseen. Tässä on siis syy siihen, että
Sanger-menetelmän dideoksyvaiheessa käytetään vain ja nimen omaan ssDNA:ta.
Lukulaitteita
Emäsjärjestyksen selvittämisessä käytetään nykyisin myös automaattisia lukulaitteita. Niidenkin
toimintaperiaate on edellä kuvatun kaltainen (ei todennäköisesti kuitenkaan kauan, sillä DNA:n
suoraankin lukemiseen kykeneviä välineitä ollaan jo kovalla tohinalla kehittelemässä).
9.2.9. Geenisirut (= DNA-mikrosirutekniikka, DNA-siru tai DNA-lastu, englanniksi esim.
microarray tai DNA-array)
Jotta ymmärrät tähän kirjoittamani näkökulmat, sinun täytyy ensin selvittää itsellesi seuraavat
aikaisemmin opiskellut asiat:
- PCR-menetelmä
- Northern blotting eli solukkonäytteen sisältämien kaikkien lähetti-RNA-molekyylien eristäminen
poly-A-hännän avulla
- käänteistranskriptaasin toimintaperiaate ja käyttö geenitekniikassa
- in situ-hybridisaatio ja geenikoettimien toimintaperiaate

19. Geenisirut koostuvat mikroskooppilasille kestävöidyistä tuhansista geenikoettimista, joihin
hybridisoidaan tutkimusnäytteen RNA:sta valmistettua komplementaarista DNA:ta (cDNA).
Geenisiruja valmistetaan siten, että cDNA-kirjastoista poimitaan esimerkiksi tiettyjen
syöpägeenien kloonit. Klooneista valmistetaan geenikoettimet ja ne kestävöidään
pipetointirobotilla (»mikrosirukirjoitin») mikroskoopin aluslasille.
Kutakin geenikoetinta sijoitetaan aluslasille tietylle kohdalle, selvärajaiseksi täpläksi (kuva
oppikirjassa sivulla 44). Yhdelle aluslasille kirjoitetaan tavallisesti 10 000–20 000 erilaista DNA-
jaksoa. Tulevaisuudessa siirryttäneen koko genomin (= yksittäisen lajin kaikki geenit) kattaviin
noin 50 000 kloonin laseihin.
Potilaalta, esimerkiksi syöpäkasvaimesta otetusta näytteestä, eristetään lähetti-RNA-molekyylit,
jotka käännetään käänteistranskriptaasin avulla cDNA:ksi. Nämä cDNA-molekyylit leimataan
fluoresoivalla eli valoa hohtavalla väriaineella. Kasvaimesta peräisin olevat molekyylit voidaan
leimata vaikkapa keltaisiksi.
Potilaan leimattua cDNA-näytettä hybridisoidaan (= in situ –hybridisaatio) geenisirulla olevien
koettimien kanssa huljuttamalla sirua näytemolekyylejä sisältävässä liuoksessa. Jos
näytemolekyyleissä esiintyy geenikoettimiin nähden komplementaarisia emäsjärjestyksiä, nämä
kiinnittyvät asianomaista koetinta sisältävän täplän kohdalle.
Keltaisten valotäplien sijainti sirulla kertoo, mitkä syöpägeeniversiot näytteen sisältämissä
soluissa ovat toiminnassa. Siis sen, mitkä nimenomaiset geenivirheet kyseisen kasvaimen ovat
aiheuttaneet. Tarkka tieto kasvaimen genetiikasta auttaa löytämään parhaan mahdollisen
lääkityksen.
Standardoiduille siruille on olemassa valmiita tietokonepohjaisia lukuohjelmia, jotka antavat
tulosyhteenvetoja valmiina taulukkoina. Tulkinta on siis suurelta osin automatisoitua.
Geenisirutekniikalla kyetään keräämään aivan uudella tavalla tietoa geenien normaalista ja
patologisesta (=tauteihin liittyvästä) toiminnasta pian jopa koko genomin mittakaavassa.
Geenisirutekniikan sovellusmahdollisuudet koskettavat lähes kaikkea biologista ja
lääketieteellistä tutkimusta, lääkekehitystyötä ja diagnostiikkaa.
9.2.10. Haulikko- eli rinnakkaissekvenssointi eli Chromosome walking (Geeni s. 68)
Tässä selostetun menetelmän ymmärtämiseksi sinun tulee etukäteen osata seuraavat asiat:
- PCR-menetelmä
- restriktioentsyymien toimintaperiaate
- in situ-hybridisaatio ja geenikoettimien toimintaperiaate
- Sanger-menetelmä
- elektroforeesi
- mielellään myös genomisten geenikirjastojen tekeminen (kirjassa s.42), mutta näiden
tekeminen valkenee ehkä myös alla olevasta
- käsite plasmidi
- käsite ssDNA

20. Haulikkosekvensoinnin perusidea on, että pitkien DNA-jaksojen, esimerkiksi kokonaisten
kromosomien emäsjärjestyksen selvittämisessä joudutaan tyytymään lyhyiden askelten
taktiikkaan. Sanger-menetelmä (tässä tiedostossa kohta 9.8.) ei nimittäin sovellu kovinkaan
pitkien DNA-jaksojen sekvenssoimiseen.
Pitkät DNA-jaksot pilkotaan niin lyhyiksi, että Sanger-menetelmää voidaan käyttää. Syntyvien
DNA-pilkkeiden järjestys menee pilkkomisen seurauksena sekaisin. Jos kuitenkin pilkkominen
tehdään useammalla eri restriktioentsyymillä, kullakin erikseen, pilkkeiden järjestys voidaan
myöhemmin päätellä vertailemalla toisiinsa eri restriktioentsyymeillä pilkottujen DNA-jaksojen
emäsjärjestysten päällekkäisyyksiä (Kuva 66). Geneettisen koodin päällekkäisyyksien
perusteella sekvenssoinnin hoitavat sitten tietokoneet.
Alkuperäinen, pilkkoutumaton DNA-molekyyli, jonka emäsjärjestys
halutaan selvittää. Molekyyli on liian pitkä kerralla sekvenssoitavaksi.
Restriktioentsyymi 1:llä pilkottu DNA
Restriktioentsyymi 2:lla pilkottu DNA
Restriktioentsyymi 3:lla pilkottu DNA
Kuva 66. Haulikkosekvenssoinnin perusperiaate. Alkuperäinen DNA-näyte on
liian pitkä kerralla sekvenssoitavaksi. Siksi sitä aluksi monistetaan PCR-
menetelmällä. Monistettua DNA:ta jaetaan useaan eri koeputkeen (= värit). Kun
kuhunkin putkista laitetaan erilaiselle emäsjärjestykselle herkkää
restriktioentsyymiä, DNA pilkkoutuu kussakin koeputkessa eri kohdista.
Tuloksena on sekvenssointiin sopivia, lyhyitä DNA-jaksoja, joissa kuitenkin on
niin paljon päällekkäisiä emäsjärjestyksiä, että alkuperäisen DNA-näytteen koko
emäsjärjestys voidaan lopulta päätellä.

21. 9.2.11. Green Fluorescent Protein eli GFP
Monia solubiologisia ilmiöitä voidaan nykyisin seurata reaaliaikaisesti uusien molekyylitasolle
yltävien värjäysmenetelmien avulla. Usein värjäysmenetelmissä hyödynnetään sinivihreää valoa
hohtavaa proteiinia, jota eräät meduusat ja kampamaneetit tuottavat. Proteiini tuntee nimen
Green Fluorescent Protein (=GFP).
GFP:tä koodaava geeni onnistuttiin eristämään. Tutkijat myös tarkoituksellisesti mutatoivat
geeniä niin, että geenituotteina saatiin lukuisia erilaisia värimuunnoksia. Nykyisin tuotetaan
esimerkiksi punaista, keltaista, vihreätä tai sinistä valoa hohtavia GFP-proteiineja.
GFP-geenin eri versioita voidaan yhdistää muiden geenien jatkoksi. Kun ”isäntänä” toimivan
geenin promoottoriosa päräyttää RNA-polymeraasin liikkeelle, syntyy lähetti-RNA-molekyylejä,
joiden alussa on ”isäntägeenin” koodaaman proteiinin rakenneohje, mutta sen mukana myös
GFP-proteiinia koodaava RNA-ketju (Kuva 68). Näin jokainen yhdistelmägeenin perusteella
rakennettu proteiini saa kylkeensä näkyvää valoa hohtavan ”lampun”.
Proteiinien avaruusrakenne, ja samalla proteiinin toimintatapa, häiriintyy helposti ylimääräisten
lisukkeiden vaikutuksesta. Jotta GFP-osa ei häiritsisi ”isäntäproteiinin” toimintaa, liitetään
”isäntägeenin” ja GFP-geenijakson väliin lyhyt ylimääräinen nukleotidiketju. Tarkoitukseen
valitaan sellainen emäsjärjestys, jonka vanhastaan tiedetään koodaavan suoraa, siimamaisen
muodon saavaa aminohappoketjua. Näin GFP kulkee proteiinin lisukkeena, mutta turvallisen
etäisyyden päässä, vähän niin kuin ilmapallo narussaan.
Tämä välike ”isäntäproteiinia” ja GFP-osaa koodaavan geenijakson välillä on suomeksi linkkeri
eli yhdistäjä (Kuva 68). Virallisesti sen nimi englanniksi on ”flexible polypeptide linker region”
(flexible = taipuisa, polypeptide = lyhyt aminohappoketju, linker = yhdistäjä, region = alue).

22. Itsevalaisevia reseptoreita
Esimerkiksi valkosoluihin kuuluvat dendrosyytit ja T-solut telakoituvat kiinni toisiinsa silloin, kun
dendrosyytit esittelevät T-soluille vierasantigeenejä.
Telakoituminen tapahtuu solukelmulla olevien reseptoriproteiinien avulla. Dendrosyytin pinnalla
on MHC-reseptoreita ja B7-apureseptoreita. T-solun pinnalla on CD28-apureseptoreita sekä
vierasantigeenien tunnistamiseen erikoistuneita T-solureseptoreita (kuva 69).
Kuva 68.
GFP-yhdistelmägeeni.
”Isäntägeenin” promoottoriosan (musta) ja rakenneosan (vihreä) jatkoksi on liitetty
linkkeriosa (punainen) ja GFP-osa (sininen). RNA-polymeraasi kopioi promoottorin
perässä olevan DNA-jakson yhdeksi pitkäksi mRNA-molekyyliksi.
”Isäntägeenin”
promoottoriosa GFP-osa
”Isäntägeenin”
rakenneosa Linkkeriosa
GFP-yhdistelmägeeni

23. Esittelyn alkaessa solut asettavat solukelmunsa vastakkain, ne ikään kuin antavat toisilleen
muiskauksen. Paikkaan, missä solukelmut koskettavat toisiaan, kertyy tuolloin runsaasti
kummankin solutyypin apureseptoreita B7 ja CD28. Apureseptoreillaan solut ”paiskaavat kättä”
telakoituen kiinni toisiinsa.
Kun telakoituminen on tapahtunut, apureseptorit alkavat siirtyä ”muiskauskohdan” reunamille.
Nyt ”muiskauksen” keskiosaan alkaa vuorostaan kerääntyä MHC- ja T-solureseptoreita. Kun ne
nyt kohtaavat toisensa, on vuorossa varsinainen antigeenien esittely. Tätäkin siis tapahtuu
laajalla alueella dendrosyytin ja T-solun solukelmulla lukuisien MHC- / T-solureseptoriparien
kesken (kuva 70).
Jos yhdistelmä-DNA-tekniikalla (kuva 68) liitetään esimerkiksi Dendrosyytin B7-reseptoreihin
punainen GFP-proteiini ja MHC-reseptoreihin vihreä, voidaan reseptorien sijaintia ja liikehdintää
solukelmulla seurata värien leikkinä reaaliaikaisesti valomikroskoopilla (kuva 70).
Kuva 69. Dendrosyytti ja T-solu telakoituvat toisiinsa
solukelmulla olevien reseptorien avulla. Ensin yhtyvät
toisiinsa B7- ja CD28-, vasta tämän jälkeen MHC- ja T-
solureseptorit.
T-solu
Dendro-
syytti
MHC
T-solu-
reseptori
B7 CD28

24. Itsevalaisevia transkriptiofaktoreita
Samanlaisella yhdistelmä-DNA-tekniikalla voidaan tuottaa valoa hohtavia transkriptiofaktoreita.
Jos tutkimuksen kohteena ovat vaikkapa alkionkehitystä ohjaavat transkriptiofaktorit, valon
syttyminen solulimassa paljastaa, missä alkionkehityksen vaiheessa solut kyseisiä TF:iä
tuottavat. Kun valotäplät siirtyvät solulimasta tumaan, on se merkki transkriptiofaktoreiden
aktivoitumisesta ja siitä, että ne kiinnittyvät omien kohdegeeniensä säätelyosiin.
Tilaa luovuudelle!
a) GFP-geenikoettimia
GFP:n rakennetta koodaavassa geenissä on kaksi peräkkäin sijaitsevaa osaa. Toinen osa
koodaa aminohappoketjua, joka muodostaa lampunvarjostinta muistuttavan lieriömäisen
rakenteen. Toinen osa koodaa pienempää sauvamaista rakennetta, jota kutsutaan kromoforiksi.
Valmiissa GFP:ssä kromoforiosa työntyy ”varjostinosan” sisään. GFP tuottaa luminenssia
(valoa) vain, kun mainitut osat ovat sisäkkäin (Kuvan 71 yläosa).
Eräs tutkijaryhmä sai ajatuksen katkaista GFP-geeni kahtia juuri ”varjostin-” ja kromoforiosan
välistä. Näin voitiin valmistaa kahdenlaisia GFP-geenejä: sellaisia, joissa oli pelkän
”varjostimen” rakenneohje sekä sellaisia, joissa oli pelkän kromoforin rakenneohje. Näitä
Lopputilanne: B7-
apureseptorit
laidoilla (vihreä),
MHC-reseptorit
keskellä (punainen).
Lähtötilanne: B7-
apureseptorit
keskellä (vihreä),
MHC-reseptorit
laidoilla (punainen).
Kuva 70. B7- ja MHC-reseptorien liikkuminen dendrosyytin solukelmulla
(vertaa kuvaan 69). Kuvassa on se alue solukelmusta, jonka kohdalta
dendrosyytti telakoituu T-solun kanssa.
Välivaihe: B7- ja
MHC-reseptorit
vaihtavat paikkaa.

25. kumpaakin geeniä sitten kloonattiin (=monistettiin) erikseen. Kun geenit istutettiin bakteereihin,
kumpaakin osaproteiinia voitiin tuottaa suuria määriä (Kuvan 71 keskiosa).
Kun epäsymmetrisellä PCR-menetelmällä monistetaan jotakin DNA-juostetta, voidaan PCR
pysäyttää yksijuosteiseen vaiheeseen ja kemiallisesti kiinnittää jokaisen juosteen 5´-päähän
GFP:n varjostinproteiini. Kiinnittämisessä yleisimmin käytetty kemiallinen ”välike” on eräs B-
ryhmän vitamiini biotiini (englanniksi välikkeen lisääminen onkin nimeltään biotinylation). Näin
saadaan ”GFP-hatutettuja” geenikoettimia, joita voidaan kestävöidä geenisiruihin.
Jos halutaan selvittää, täsmääkö jonkin DNA-näytteen emäsjärjestys edellä mainittuihin
geenikoettimiin, voidaan näytejuosteiden 3´-päät puolestaan leimata GFP:n kromoforiosilla. Jos
emäsjärjestykset täsmäävät, näytejuosteet pariutuvat geenisirulla olevien koettimien kanssa.
Tällöin DNA-juosteiden 3´ja 5´-päät asettuvat sirulla kohdakkain, kromoforit löytävät
”varjostimensa” ja GFP:t alkavat tuottaa valoa, näppärää (kuvan 71 alaosa)!

26. b) GFP-transkriptiofaktoreita
”Varjostinosa” KromoforiosaGFP
GFP-geeni
3´ 5´
5´
3´
3´ 5´5´ 3´
Kuva 71. GFP:n geeni koodaa kromoforiosaa ja ”varjostinosaa”. Geeni voidaan katkaista,
jolloin saadaan erillinen geeni kummallekin osalle. Geenejä voidaan kloonata (=monistaa) ja
tuottaa niiden avulla asianomaisia proteiineja. Proteiineilla voidaan leimata esimerkiksi
DNA:n yksöisjuosteita. Kun juosteet pariutuvat, GFP alkaa tuottaa valoa.
”Varjostin”geeni Kromoforigeeni
Leimataan mikrosirulla
olevien
geenikoettimien ja
tutkittavassa
näytteessä olevien
DNA-juosteiden
vastakkaiset päät
GFP:n eri osilla.
Luminesenssi
Tutkittava
DNA-näyte
Mikrosirulla oleva
geenikoetin

27. Monet transkriptiofaktorit ovat dimeerejä. Tämä tarkoittaa sitä, että ne kiinnittyvät geenien
säätelyosiin aina parina, vähän niin kuin vasemman- ja oikeankäden hansikas, kun pannaan
kädet ristiin.
Jos nyt valmistetaan GFP-yhdistelmägeenejä, jotka koodaavat tällaisia transkriptiofaktoreita,
voidaan vasemmanpuoleista osaa koodaavan geenin jatkoksi liittää pelkän ”varjostinosan”
rakenneohje ja oikeanpuoleista osaa koodaavan geenin jatkoksi pelkän kromoforiosan
rakenneohje.
Kun nämä geenit toimivat, syntyy kahdenlaisia GFP-transkriptiofaktoreita: osassa on mukana
”varjostin-” ja osassa kromoforiosa. Kyseiset transkriptiofaktorit sytyttävät ja sammuttavat
valonsa sitä mukaa, kuin ne aktivoituvat eli kiinnittyvät pareina kohdegeeniensä säätelyosiin tai
irtautuvat niistä.
GFP ja reaaliaikainen PCR (= real time PCR / rtPCR = quantitative PCR / qPCR)
Valon tuottoa hyödynnetään usein myös menetelmässä nimeltä reaaliaikainen PCR (= real time
PCR / rtPCR = quantitative PCR / qPCR).
Tähän liittyvä kuva on BIOS5-kirjan sivulla 81, mutta siitä puuttuu pari olennaista asiaa.
1) Kirjan kuvassa näkyvän geenikoettimen toisessa päässä on fotoneja emittoiva ja
vastakkaisessa päässä absorboiva pigmenttimolekyyli. Kun nämä ovat lähellä toisiaan samassa
geenikoettimessa, absorptio on yhtä suurta kuin emissio eikä valosignaalia synny.
2) Menetelmässä käytetään DNA-polymeraasin muotoa, jota tutkijat ovat "tuunanneet"
kiinnittämällä siihen nukleaasiosan.
Nukleaasi irrottaa ja katkaisee kohtaamansa geenikoettimet aina, kun polymeraasi viilettää
DNA-juostetta pitkin (geenikoettimen katkeamista ei näy kirjan kuvassa). Silloin emittoiva ja
absorboiva molekyyli irtautuvat toisistaan ja fotonit pääsevät emittoitumaan vapaasti valona.
Samaan tapaan voidaan käyttää myös GFP-proteiinin kromofori- ja varjostinosaa. Kun
kromofori- ja varjostinosa ovat geenikoettimen vastakkaisissa päissä, ei GFP tuota valoa. Kun
geenikoettimet katkeavat ja niiden pilkkoutuneet osat vapautuvat liuokseen, myös GFP:n
kromofori- ja varjostinosa pääsevät yhdistymään loistaen GFP:lle ominaista valoa.
Jos koettimessa on esim. perinnölliselle sairaudelle, syöpäsairauksille tai eri mikrobeille
ominainen emässekvenssi, valon syttyminen paljastaa, että monistetussa näytteessä esiintyy
tämä sekvenssi. Tieto sekvenssin olemassaolosta saadaan ilman, että tarvitsee tehdä työlästä
ja aikaa vievää elektroforeesiajoa.
Jos taas kyseistä emässekvenssiä ei ole, eivät koettimet löydä niille komplementaarista
kiinnittymispaikkaa. Ne jäävät vapaiksi PCR-liuokseen, pysyvät ehjinä eikä valoa tuottavia
tapahtumia esiinny.
Näin sairauksien diagnostiikkaa voidaan sekä tarkentaa, automatisoida että nopeuttaa.
GFP:stä Nobel-palkinto
GFP-rekombinanttigeenit ovat rajusti helpottaneet solubiologisten ilmiöiden tutkimusta.
Merkittävyydessä menetelmää on verrattu jopa mikroskoopin keksimiseen. GFP-väreillä on

28. tutkittu synapsien syntyä hermosoluissa, aivosolujen vaurioitumista rappeuttavissa
aivosairauksissa, haiman insuliinia tuottavien beta-solujen toimintaa ja syöpäsolujen leviämistä
elimistössä. GFP paljastaa milloin ja missä jokin geeni alkaa toimia sekä sen, minne geenin
koodaamat proteiinit siirtyvät valmistumisensa jälkeen. GFP-rekombinanttitekniikan kehittäjät
(Osamu Shimomura, Martin Chalfie ja Roger Tsien) saivat työstään kemian Nobel-palkinnon
vuonna 2008.
9.2.12. RNA-interferenssi eli RNAi (interfere = puuttua asioiden kulkuun)
On olemassa viruksia, joiden genomi muodostuu kaksijuosteisesta RNA:sta (dsRNA-virukset).
Yksi kuuluisimmista dsRNA-viruksista on mahatautia aiheuttava rotavirus.
Kun virus tunkeutuu isäntäsoluunsa, viruksen proteiinikotelo hajoaa. Sen jälkeen viruksen oma
RNA-polymeraasi alkaa valmistaa kopioita alkuperäisestä virusgenomista. Genomin perusteella
valmistuu lähetti-RNA-molekyylejä. Isäntäsolun ribosomit alkavat näiden avulla valmistaa
virukselle ominaisia proteiineja.
Evoluution kuluessa kehittyi soluihin jo varhain kyky havaita virusinfektiot juuri kaksijuosteisten
RNA-molekyylien perusteella. Solulimassa olevat Dicer-nimiset proteiinit tarttuvat dsRNA-
molekyyleihin ja katkovat ne 22 nukleotidin mittaisiksi jaksoiksi. Sen jälkeen RISC-proteiini
(=RNA Induced Silencing) hajottaa pilkkeet yksijuosteiseksi RNA:ksi. RISC rakentuu
useammasta pienemmästä proteiinista modulaarisesti samaan tapaan kuin vaikkapa B-
valkosolujen tuottamat vasta-aineet.
RISC-proteiinin kuljettaa mukanaan viruksen yksijuosteisia RNA-jaksoja. Tällöin sellaiset
solussa olevat mRNA-molekyylit, joissa on virus-RNA-jaksolle vastakkainen emäsjärjestys,
pariutuvat sen kanssa ja niiden translaatio proteiineiksi pysähtyy. Näin virusproteiinien tuotanto
loppuu, eikä virus pysty lisääntymään (kuva 72).

29. 2b. Dicer alkaa katkoa
viruksen dsRNA:ta
lyhyemmiksi pilkkeiksi.
1. Viruksen dsRNA-genomi
saapuu soluun.
Dicer
2a. dsRNA:n perusteella
alkaa valmistua viruksen
lähetti-RNA-molekyylejä.
3. RISC halkaisee pilkkeet
yksijuosteisiksi RNA-
molekyyleiksi ja alkaa
kuljettaa niitä mukanaan.
4. RISC tarttuu viruksen lähetti-RNA-
juosteisiin, koska nimenomaan niissä on
RISCiin kiinnittyneelle RNA-juosteelle
vastakkainen emäsjakso.
5. Isäntäsolun ribosomit
eivät voi lukea viruksesta
peräisin olevia lähetti-RNA-
molekyylejä, jolloin viruksen
toiminta estyy.
Virusgenomin tuottamia
lähetti-RNA-molekyylejä
RISC
Kuva 72. RNA-interferenssin toimintaperiaate. Dicer ja
RISC ovat proteiineja, jotka vaimentavat virusgenomin
toiminnan.

30. RNAi:hin perustuvat hoitomuodot
Kaksijuosteisia RNA-molekyylejä voidaan valmistaa myös tarkoituksellisesti. Tällaisen RNA-
molekyylin mallina voidaan käyttää vaikkapa syöpägeeniksi mutatoitunutta DNA-jaksoa. Kun
kyseinen kaksijuosteinen RNA-molekyyli viedään potilaan soluihin viruksen mukana, RISC
estää kyseisen syöpägeenin proteiinituotannon. Siksi, vaikka itse syöpägeeni säilyykin solun
genomissa, solu kuitenkin lakkaa toimimasta syöpäsolun tapaan.
RNAi:tä voidaan käyttää myös retrovirusten vaimentamiseen. Esimerkiksi HIV on retrovirus.
Retroviruksien genomi on yksijuosteinen RNA-molekyyli, jonka virus muuttaa
käänteistranskriptaasin avulla kaksijuosteiseksi DNA:ksi. Kaksijuosteinen DNA asettuu sitten
isäntäsolun geenien joukkoon.
Jos valmistetaan kaksijuosteisia RNA-molekyylejä, joissa on virusgenomille ominaisia 22
nukleotidin mittaisia emäsjärjestyksiä, Dicer ja RISC estävät viruksen lisääntymisen.
RNAi tuotti löytäjilleen (Andrew Fire ja Craig C. Mello) lääketieteen Nobel-palkinnon vuonna
2006.
9.2.13. CRISPR-CAS (CRISPR = Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats)
Ymmärtääksesi tässä esille tulevat asiat sinun tulisi valmiiksi osata restriktioentsyymien,
geenikoettimien, käänteistranskriptaasin ja RNA-interferenssin (RNAi) käyttötapa.
RNA-interferenssi on syytä osata siksi, että CRISPR-CAS on ikään kuin bakteereiden näkemys
RNA-interferenssistä.
CRISPR-CAS on bakteereille ja arkeille ominainen puolustusjärjestelmä viruksia vastaan. Aluksi
käymme läpi joukon aiheeseen liittyviä alakäsitteitä. Sitten katsomme yksityiskohtaisemmin,
miten -järjestelmä toimii bakteereissa. Näiden jälkeen luomme yhteenvedon siitä, miten
CRISPR-CAS-puolustusjärjestelmää hyödynnetään geenitekniikan tutkimusvälineenä.
CRISPR
CRISPR on geenisekvenssi bakteerin DNA:ssa. Se sisältää toisaalta tasaisin välimatkoin
sijaitsevia palindromisia toistojaksoja (repeats), mutta myös niiden välisiä monimuotoisempia
välikejaksoja (spacers). Seuraavaksi esittelen kummatkin näistä erikseen.
Palindromiset toistojaksot (repeats)
SAIPPUAKAUPPIAS on palindromi, sillä se tuottaa saman sanan myös takaperin luettuna.
Genetiikassa palindromisia eivät ole samat, vaan toistensa kanssa pariutumiskykyiset
emäsjaksot, jotka sijaitsevat samassa DNA-juosteessa, joskus kaukanakin toisistaan. Jakson

31. alussa olevan emäsjärjestyksen on oltava ”peilikuva” jakson peräpäässä olevasta
emäsjärjestyksestä. Esimerkiksi emäsjärjestys ACAATGTTGCGGTCCATTGT on
palindrominen (sinisellä merkityt emäsjärjestykset ovat toistensa kanssa pariutumiskykyisiä
emäsjärjestyksiä).
Palindromiset geenisekvenssit tulevat genetiikassa vastaan muuallakin. Esimerkiksi kolmiapilan
muotoon taipuvissa siirtäjä-RNA-molekyyleissä on palindromisia jaksoja silmukoiden alku- ja
loppukohdassa. Samoin aitotumallisten solujen geeneissä esiintyvien introni-jaksojen alussa ja
lopussa on toisiinsa sopivat palindromiset emäsjärjestykset. Näiden kohdalta snörpit (snRNA)
osaavat katkaista ja poistaa intronit.
Välikkeet (spacers)
Välikkeet (spacers) ovat CAS-proteiinin pilkkomia muutaman kymmenen nukleotidin mittaisia
DNA-jaksoja, jotka bakteeri on alunperin irrottanut viruksista ja liittänyt ne sitten oman
genominsa osiksi. Geenisekvenssistä, johon välikkeet liitetään, käytetään nimitystä CRISPR
(kuva 73). CRISPR-sekvenssi on bakteerin genomissa jakso, jossa välikkeet ja palindromiset
toistojaksot vuorottelevat.
CAS on proteiini, joka toimii endonukleaasina
CAS on proteiinirakenteinen endonukleaasi, joka katkoo nukleiinihappoja (DNA ja RNA) solun
sisällä (siitä sanan alku: endo-). Tässä mielessä se muistuttaa restriktioentsyymejä, jotka nekin
ovat bakteereissa esiintyviä endonukleaaseja. Yhteistä on myös se, että sekä CAS että
restriktioentsyymit ovat bakteereiden puolustautumiskeinoja bakteeriofageiksi kutsuttuja viruksia
vastaan.
CAS-proteiineja tunnetaan useita erilaisia: esim. CAS9-pilkkoo kaksijuosteista DNA:ta, CAS13
yksijuosteista RNA:ta, CAS14 puolestaan yksijuosteista DNA:ta. Eri bakteerilajeissa esiintyy
hieman toisistaan poikkeavia CAS-proteiineja.
Uuden virusperäisen DNA:n liittäminen CRISPR-sekvenssiin (kuva 73)
Kuva 73 esittää virusinfektion etenemistä bakteerisolussa, johon kyseinen virustyyppi on
asettumassa ensimmäistä kertaa. Kyseinen virus on siis bakteerille tuntematon. Tässä
tapahtumat etenemisjärjestyksessä.
a. Bakteeri tuottaa CAS2-nimistä endonukleaasia (kuvassa kohta 3). Tämä proteiini
katkoo nukleiinihappoja, siis DNA:ta tai RNA:ta.
b. Kun bakteeriin tulee viruksen DNA:ta, CAS2 pilkkoo sen lyhyiksi pätkiksi (kuvassa
kohdat 1, 2 ja 4). CAS2 tunnistaa nämä, sillä virus-DNA:ssa esiintyy tiettyjä, juuri
viruksille ominaisia emäsjärjestyksiä ns. PAM-sekvenssejä.
c. Pilkkoutumistuotteet liitetään bakteerin CRISPR-sekvenssiin pysyvästi. Tällöin
bakteeri "muistaa" infektion ja voi myöhemmin puolustautua sitä vastaan.

32. 1. Bakteriofagi
asettuu
isäntäsoluun
(bakteeri)
4. CAS2-nukleaasi
(proteiini) pilkkoo
virusgenomin
palasiksi
5. Virusgenomin palaset
liitetään bakteeri-DNA:n
CRISPR-sekvenssiin
Bakteerin plasmidimuotoinen
kromosomi
3. Bakteeri tuottaa CAS2-
nukleaasia
2. Viruksen genomi siirtyy
isäntäsoluun
Bakteriofagi
(virus)
Kuva 73. Uuden virusgenomin hajottaminen. CAS2-endonukleaasi
pilkkoo virus-DNA:ta ja pilkkeet liitetään bakteerigenomin osiksi
CRISPR-sekvenssiin. Sekvenssissä vuorottelevat palindromiset
toistojaksot ja virusperäiset välikkeet. CRISPR muodostaa bakteerin
immunologisen muistin.
Välike
(spacer)
Palindrominen
toistojakso
(repeat)

33. Mitä ovat tracr-RNA (trans-activating CRISPR-RNA), CAS9, pre-crRNA (pre-CRISPR-RNA),
crRNA (CRISPR-RNA) sekä sgRNA (single stranded guide-RNA) (kuva 74)?
Bakteereissa CRISPR-CAS-koneisto edellyttää kolmen eri geenin samanaikaista toimintaa.
Menetelmää käsittelevässä keskustelussa näiden geenien tuottamat molekyylit tulevat usein
esille. Siksi ne on tarpeen tässä yhteydessä selittää, vaikka solubiologisessa tutkimuksessa osa
bakteereissa toteutuvista geenitoiminnoista voidaankin ohittaa.
Tällaisia molekyylejä ja niitä koodaavia geenejä ovat tracr-RNA, pre-crRNA sekä CAS9. Lisäksi
kuvan 74 selitetekstissä esiintyvät käsitteet crRNA ja sgRNA.
Tracr-RNA ja pre-crRNA-geeni tuottavat pelkkiä RNA-molekyylejä. Näiden geenien koodaamat
RNA-molekyylit eivät siis etene translaatioon asti, joten ne eivät koodaa proteiinirakenteita.
CAS9-geeni sen sijaan tuottaa asianomaisen proteiinin CAS9. CAS9-proteiini ei pysty virusten
torjuntaan sellaisenaan, vaan sen aktivoimiseen tarvitaan samanaikaisesti kahta edellä
mainittua RNA-molekyylityyppiä: tracr- (=Trans-Activating-CRISPR-RNA) ja crRNA (=CRISPR-
RNA). crRNA syntyy pre-crRNA-molekyylin pilkkoutuessa lyhyemmiksi jaksoiksi.
Tutkijat pystyvät valmistamaan tracr- ja crRNA-molekyylien yhdistelmiä. Näitä kutsutaan nimellä
opas-RNA (sgRNA = single stranded guide-RNA). sgRNA aktivoi CAS9-proteiinin kiinnittymällä
siihen. SgRNA:ssa oleva geenikoetin voidaan muokata emäsjärjestykseltään sellaiseksi, että se
tunnistaa tutkijoiden haluamia DNA-jaksoja.
CRISPR-CAS-geenistön toiminta bakteerille jo ennestään tuttujen viruksien torjunnassa
(kuva 74)
Koska CRISPR-CAS-toimintoihin osallistuvat geenit toimivat bakteerissa samanaikaisesti, alla
olevassa kuvassa 74 esiintyvät numerot eivät suoranaisesti kuvaa toimintojen
tapahtumisjärjestystä. Siksi seuraavassa on tiivis, etenemisjärjestystä paremmin ilmentävä
yhteenveto kuvan 74 tapahtumista (selitykset myös kuvassa).
1. Aluksi bakteeri tuottaa CRISPR-sekvenssistään (kohta 10) koko sekvenssin mittaisia
pitkiä pre-crRNA-molekyylejä (kohdat 3 ja 4).
2. Samanaikaisesti CAS9-proteiinia (kohta 6) koodaava geeni (kohta 5) tuottaa CAS9-
proteiinia.
3. Myös tracr-RNA:ta (kohta 8) koodaava geeni (kohta 7) transkriptoituu hiuspinniä
muistuttavaksi RNA-molekyyliksi.
Se sisältää pre-crRNA-molekyylissä esiintyvien palindromisten (kohta 1) jaksojen
peilikuvia. Lisäksi tracr-RNA:ssa on jaksoja, joiden avulla se kiinnittyy CAS9-proteiinin
poimuihin toimien samalla CAS9-molekyylin aktivaattorina (kohta 9) (tracr-RNA on
lyhenne sanoista trans activating crRNA).
4. Toisiinsa liittyneinä tracr-RNA ja CAS9 katkovat pitkän pre-crRNA-molekyylin lyhyiksi
crRNA-molekyyleiksi (kohdat 2, 9 ja 11) palindromijaksojen osoittamista kohdista (crRNA
tulee sanoista CRISPR-RNA).

34. 5. Valmiit crRNA-molekyylit liittyvät CAS9-molekyyliin (kohta 11). Niiden sisältämä
emäsjärjestys toimii 20 nukleotidin mittaisena geenikoettimena (kohta 12). Tämä pystyy
tarvittaessa tunnistamaan virusgenomissa olevan komplementaarisen emäsjärjestyksen
ja kiinnittymään siihen (kohdat 11, 12 ja 13).
6. Jos tällaisia emäsjärjestyksiä sisältävä virus-DNA-jakso ilmestyy bakteerisoluun, CAS9
kiinnittyy tähän, pilkkoo viruksen DNA:n toimimattomaksi ja estää viruksen lisääntymisen.
7. Tutkijoiden valmistamia crRNA-molekyylejä kutsutaan nimellä opas-RNA (sgRNA =
single stranded guide-RNA). Opas-RNA-molekyylissä molemmat bakteereissa esiintyvät
RNA-jaksot (tracr- ja crRNA) ovat yhtenä yhtenäisenä RNA-molekyylinä. Tämä pystyy
sekä kiinnittymään CAS9-proteiiniin että toimimaan ohjelmoitavana geenikoettimena.
sgRNA:n emäsjärjestys voidaan nimittäin muokata tunnistamaan haluttuja DNA-jaksoja.

35. 7. Tracr-RNA:ta koodaava geeni transkriptoituu hiuspinniä
muistuttavaksi RNA-molekyyliksi. Se sisältää pre-crRNA-
molekyylissä esiintyvien palindromisten jaksojen peilikuvia. Lisäksi
tracr-RNA:ssa on jaksoja, joiden avulla se kiinnittyy CAS9-proteiinin
poimuihin.
5. CAS9-proteiinia
koodaava geeni
1. Palindromisia DNA-
jaksoja (= REPEATS eli
TOISTO-jaksot)
2. crRNA:ta
koodaavia DNA-
jaksoja (= SPACERS
eli VÄLIKE-jaksot)
3. crRNA:ta koodaavat geenit transkriptoituvat alkujaan
yhtenäiseksi pitkäksi RNA-molekyyliksi eli pre-crRNA:ksi.
10. CRISPR-lokus: pre-crRNA:ta
koodaava CRISPR-geenistö (peräisin
viruksista)
4. pre-crRNA-molekyyli
9. CAS9-proteiini (punainen pilvi) +
tracr-RNA yhdistyvät toisiinsa. Ne
katkovat pre-crRNA:n lyhyiksi crRNA-
molekyyleiksi. Jokainen valmis
crRNA sisältää vain yhden spacer-
sekvenssin (sininen, vihreä,
keltainen, punainen: pituus 20
nukleotidiä).
8.Tracr-RNA
11. Valmiit crRNA-molekyylit tarttuvat CAS9-proteiiniin tracr-
RNA:n välityksellä. crRNA toimii CAS9-proteiinissa
geenikoettimen tapaan. crRNA on 20 nukleotidin mittainen.
13. crRNA-CAS9-yhdistelmä pilkkoo viruksen DNA:n
palasiksi, jos viruksessa on DNA-jaksoja, jotka sopivat
crRNA:n emäsjärjestykseen DNA-RNA-pariutumissäännön
mukaisella tavalla. crRNA tomii näin virus-DNA:n
tunnistavana geenikoettimena.
Kuva 74. Aiemmin kohdatun viruksen tunnistaminen. Bakteerigenomissa sijaitsevan CRISPR-CAS-geenistön
toimintaperiaate.
Kuvan vasemmassa ylänurkassa näkyvä tracr-RNA (Trans-Activating-CRISPR-RNA, kohdat 7 ja 8) tarvitaan CAS9-
proteiinin (kohdat 5 ja 6) aktivoimiseen. crRNA:ta (CRISPR-RNA, kohdat 9 ja 11) koodaavat geenit transkriptoituvat
alkujaan yhtenäiseksi pitkäksi RNA-molekyyliksi eli pre-crRNA:ksi (kohdat 3, 4 ja 9).
Lopuksi pre-crRNA-molekyylit katkotaan 20 nukleotidin mittaisiksi crRNA-molekyyleiksi (kohdat 11 ja 12). Nämä
toimivat CAS9-proteiinin kanssa geenikoettimien tapaan (kohdat 12 ja 13).
Tutkijoiden valmistamia crRNA-molekyylejä kutsutaan nimellä opas-RNA (sgRNA = single stranded guide-RNA).
Opas-RNA-molekyylissä molemmat crRNA:n osat (tracr ja crRNA) ovat yhtenä yhtenäisenä RNA-molekyylinä.
Tämä sekä kiinnittyy CAS9-proteiiniin että toimii ohjelmoitavana geenikoettimena. sgRNA:n emäsjärjestys voidaan
muokata tunnistamaan haluttuja DNA-jaksoja.
12. crRNA on 20
nukleotidin mittainen
geenikoetin
kiinnittyneenä
CAS9-proteiiniin
6. CAS9-proteiini

36. Mihin bakteeri tarvitsee CRISPR-sekvenssin tuottamia geenikoettimia, jos kerran jo CAS-
proteiinitkin toimivat restriktioentsyymien tapaan?
Kun virus infektoi bakteerin, on torjunnan tapahduttava nopeasti. Usein käykin niin, että jotkin
virusyksilöt onnistuvat ohittamaan CAS-proteiinit ja ehtivät jo istuttamaan oman genominsa
bakteerigenomin osaksi.
Virusgenomin toimiessa solulimaan alkaa pursuta virukselle ominaisia lähetti-RNA-molekyylejä.
Mutta, jos CRISPR-lokus tuottaakin crRNA-molekyylejä, joissa on viruksen lähetti-RNA-
molekyyleihin nähden komplementaarinen emäsjärjestys, tuloksena on RNA-interferenssi.
crRNA vaientaa viruksen tuottamat lähetti-RNA-molekyylit tarttumalla emäksillään niihin ja
infektio pysähtyy tähän.
CRISPR-CAS-järjestelmässä on toinenkin olennainen etu restriktioentsyymeihin verrattuna.
Restriktioentsyymit ovat proteiineja. Niistä syntyy uusia muotoja vain, jos niiden rakennetta
koodaavissa geeneissä tapahtuu mutaatioita. Mutaatiopohjainen tuotekehittely on hidasta
onnenkauppaa.
CRISPR-CAS sen sijaan pysyy aina ajan tasalla alati muuttuvassa virusekosysteemissä.
Ratkaiseva toimija on crRNA:ssa oleva emässekvenssi, jolloin proteiinirakenteen muutoksia ei
tarvita.
Bakteerin jakautuessa CRISPR-CAS-geenistö siirtyy myös bakteerin jälkeläisille. Siksipä niillä jo
syntyessään on käytettävissään ”kaiken kokeneiden” esi-isiensä hankkima geneettinen
immunologinen muisti.
PAM-sekvenssi?
CRISPR-CAS-asioissa vastaasi tulee ennen pitkää kirjainyhdistelmä PAM.
PAM on lyhenne sanoista Proto-spacer Adjacent Motif (= spacerin esimuodon vieressä oleva
emäsjärjestys). Se on lyhyt, yleensä kolmen emäksen mittainen, sekvenssi, joka esiintyy
virusgenomissa, mutta sitä ei esiinny bakteerin omassa DNA:ssa.
CAS2 havaitsee virusgenomin nimenomaan PAM-sekvenssien perusteella. Lisäksi, CRISPR-
sekvenssiin istutettavat SPACER-jaksot leikataan irti tarkalleen PAM-sekvenssin edestä. Ennen
istuttamista niitä kutsutaan proto-spacereiksi. PAM-sekvenssiä niihin ei kelpuuteta mukaan.
PAM-sekvenssiä ei esiinny bakteerin omassa geneettisessä koodissa missään, eikä sen
CRISPR-lokuksessakaan. Jos esiintyisi, CAS-proteiinit pilkkoisivat virusten lisäksi myös
bakteerin omaa DNA:ta. PAM:in perusteella bakteeri tietää PAMauttaa nenuun juuri
virusgenomia, ei vahingossakaan omaansa.
CRISPR-CAS-menetelmät geenitekniikassa (Vertaa näitäkin kuvaan 74)
CRISPR-CAS on tämän hetken merkittävin geenitekniikan tutkimusmenetelmä. Menetelmässä
on paljon yhtäläisyyksiä restriktioentsyymien, geenikoettimien ja RNA-interferenssin kanssa.
Erilaisia CAS-proteiineja tuotetaan nykyisin teollisesti ja niitä voidaan mikroinjektiona lorauttaa
myös aitotumallisiin soluihin. crRNA:n tilalle voidaan tällöin tuottaa opas-RNA-jakso. Tällaista
ihmisen valmistamaa opas-RNA-sekvenssiä merkitään sgRNA (enkuksi single stranded guide
RNA).
Opas-RNA:n avulla CAS9 päätyy kohdesolun DNA:ssa sellaisen sekvenssin luo, jossa on opas-
RNA:han sopiva emäsjärjestys (RNA-DNA-pariutumissännön mukaan). CAS katkaisee
vastaanottavan DNA:n kyseiseltä kohdalta.

37. CAS tuottaa DNA:n katkaisukohtaan tylpän pään. Tylppä kohta syntyy, kun DNA-
kaksoisjuosteen molemmat puolikkaat katkeavat saman nukleotidiparin kohdalta.
Tylpät vauriot tarkoittavat sitä, että kromosomin jokin käsivarsi on kokonaan poikki. Tällöin solu
on vaarassa hukata kerralla suuren määrän geenejään. Tällainen mutaatio on solulle erityisen
vaarallinen.
Ligaasi 4 niminen DNA:ta korjaava proteiini on erikoistunut korjaamaan juuri tällaisia vaurioita.
Yleensä ligaasi 4 toiminnan tuloksena joitakin nukleotidejä kuitenkin katoaa. Koska geenin koko
lukukehys muuttuu silloin virheelliseksi, geeni ei enää tuota toimivaa proteiinirakennetta.
Tuloksena on knock out –geeni (vaiennettu geeni).
Knock out -geenien avulla voidaan tutkia, millainen merkitys jonkin geenin toiminnalla /
puuttumisella on solulle tai eliölajille.
Jos ligaasi 4 toiminta estetään ja soluun lisätään DNA-jaksoja, joiden molemmissa päissä on
katkaisukohdan molempiin puoliin sopivat lyhyetkin komplementaariset DNA-jaksot (kutsutaan
myös homologisiksi jaksoiksi), katkaisupaikkaan saadaan helposti ”napsahtamaan” siirtogeeni
tai muu haluttu DNA-jakso.
CRISPR-CAS-menetelmä on geenisiirtojen ja knock out -geenitekniikan yleisin työkalu.
Menetelmän kehittivät Jennifer Doudna Berkleyn yliopistosta ja Max Planck –instituutissa
työskentelevä Emmanuelle Charpentier.
CRISPR- CAS9-menetelmän muita käyttötapoja
CAS-proteiinista on kehitetty myös muunnoksia, joista on poistettu sen kyky katkaista DNA:ta.
Tällaisia CAS-proteiineja kutsutaan kuolleiksi ja merkitään dCAS (dead CAS).
dCAS-proteiiniin voidaan liittää transkriptiofaktoreita joko suoraan CAS:iin tai pienen linkkerin
(siis suorahkon aminohappoketjun) päähän roikkumaan. Näin opas-RNA johdattaa
transkriptiofaktorit haluttuihin geeneihin, jolloin niiden toimintaa voidaan säädellä halutulla
tavalla.
CAS:iin voidaan myös liittää valoa hohtavia proteiineja (Green Fluorescent Protein GFP), jolloin
nähdään, missä solun tai tuman osassa tietty geeni toimii.
Deaminaasi on entsyymi, joka vaihtaa DNA:n emäksiä toisiksi. Jos deaminaasi liitetään CAS:iin,
voidaan geenien emäsjärjestystä muuttaa sgRNA:han ohjelmoiduista kohdista. Geeneihin
voidaan myös lisätä kolmen emäksen mittaisia STOP-merkkejä kohtiin, joissa niitä ei
luonnostaan sijaitsisi.
CAS yhdistettynä käänteistranskriptaasiin = Prime editing (Prime-muokkaus)
Käänteistranskriptaasi on retroviruksille ominainen proteiini, joka tekee transkription väärin päin,
muodostaen RNA-molekyylistä sitä vastaavan DNA-molekyylin.
Kaupalliseen levitykseen on tuotettu yhdistelmägeeni, joka koodaa sekä CAS- että
käänteistranskriptaasiproteiinia. Yhdistelmäproteiini paitsi löytää halutun katkaisukohdan
muokattavasta DNA-jaksosta myös saman tien taikoo opas-RNA:n sisältämän emäsjärjestyksen
DNA-molekyyliksi katkaisupaikan kohdalle. Siksi soluun ei lainkaan tarvitse injektoida
siirtogeenisiä DNA-jaksoja. Melkoisen kätevää!

38. Tämä Prime editing niminen menetelmä mahdollistaa perinnöllisten sairauksien hoidon
yksinkertaisesti niin, että opas-RNA:han valitaan terveen geenin mukainen emäsjärjestys. Kovin
pitkien DNA-jaksojen muokkaamiseen tämä menetelmä ei sovellu, sillä opas-RNA on vain 20
nukleotidin mittainen. Onneksi useimmat perinnölliset sairaudet ovat yhden tai muutaman
nukleotidin mittaisia mutaatioita. Tyypillinen esimerkki yhden emäksen pistemutaatiosta on
sirppisoluanemia.
Prime-muokkauksen kehittivät Harvardin yliopistossa ja MIT:ssä David Liu ja Andrew Anzalone
tutkimusryhmineen.
Geeniajurit (=Gene drives)
Tavallisessa CRISPR-CAS9-tekniikassa siirtogeenisiä soluja tuotetaan mikroinjektoimalla
CAS9-proteiinia, sgRNA:ta sekä siirtogeenin kopioita kohdesoluun. Injektiossa siirretään siis
erikseen kolmenlaisia molekyylejä: proteiinia, RNA:ta ja DNA:ta.
Geenisiirron vaikutuksia seurataan usein vain yhdessä solussa. Tai, jos kyseessä on munasolu,
joka seuraavaksi hedelmöitetään, saattavat siinä esiintyvät siirtogeenit kopioitua alkion
muihinkin soluihin alkionkehityksen aikana.
Geeniajuriksi kutsutaan sellaista CRISPR-CAS9-mikroinjektiota, joka koostuu pelkästä
DNA:sta. Tässä DNA-jaksossa, ns. kasetissa, on CAS-proteiinia, sgRNA:ta ja siirtogeeniä
koodaava yhdistelmägeeni.
Näin soluun siirtyy kokonainen geneettinen järjestelmä, jolla on kyky ketjureaktion tavoin
istuttaa itsensä kohdekromosomiin, itsekopioitua tästä kromosomista uusiin
kohdekromosomeihin ja saada sama siirtymisen ja kopioitumisen kehä jatkumaan loputtomiin
myös siirtogeenisen yksilön jälkeläisissä.
Geeniajurissa voi olla esimerkiksi geeni, joka estää Anopheles-hyttysen hajuaistin kehittymisen.
Kun geeniajurilla varustettu yksilö parittelee luonnonvaraisen hyttysen kanssa, jälkeläinen saa
kyseisestä vastinkromosomista yhden kappaleen geenimuunnellulta emoltaan, toisen taas
luonnonvaraiselta hyttyseltä. Näin jälkeläisestä tulee heterotsygootti geeniajurin suhteen.
Kuitenkin, kun geeniajuri alkaa toimia, CAS9-proteiini ja luonnonvaraiseen geenimuotoon
sopiva opas-RNA löytävät toisensa. Opas-RNA johdattaa CAS9-proteiinin kyseiselle kohdalle
luonnonvaraiselta hyttyseltä peräisin olevassa luonnonvaraisessa vastinkromosomissa, jolloin
CAS9 katkaisee tämänkin kromosomin.
Geeniajurissa on mukana myös koodijakso, jolla solu saadaan korjaamaan katkaistu kromosomi
käyttäen mallina kasettia itseään. Näin muuntogeenin siirtokoneisto, mukanaan hajuaistin
kehittymisen estävä geeni, asettuvat toiseenkin vastinkromosomiin. Samalla heterotsygoottinen
genotyyppi muuttuu homotsygoottiseksi.
Aina, kun tällainen hyttynen tekee jälkeläisiä, niissä toteutuu sama kehityskulku. Siksi hajuaistin
tuhoava geeniversio leviää kaikkiin populaation jälkeläisiin nopeasti ja homotsygoottisesti
eivätkä hyttyset enää löydä ihmisiä veriateriansa lähteiksi. Malariatartunnat saadaan
vähenemään ilman, että kalojen, sammakkoeläinten, lintujen ja lepakoiden merkittävänä
ravinnonlähteenä toimivat hyttyset kuitenkaan katoavat luonnon ekosysteemeistä.