ISMB読み会2016
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RNAiFold2T: Constraint Programming design of thermo-IRES switches
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ISMB読み会2016
- 2. • 温度に応じて二次構造が変化し、RNAの持つ機能を調節するRNA termometersの配 列をデザインするアルゴリズムを開発 • 枝刈り＆探索を繰り返す厳密解に加えてlarge neighbourhood search algorithmによる 貪欲解を得る • 42℃→30℃で50%活性が落ちるThermo-IRESスイッチを実験的にも確認
- 3. • 実験はスペインのグループと共同 • IRESの構造解析 • こちらの論文は温度依存性ではなく、二次構造を壊 す類似配列をデザイン • picornavirusのdomain 5においてヘアピンループとポ リピリミジントラクトの露出がIRESの活性に重要であ ることを調べた
- 4. Science, 2016 Jan. • RNA loop structure, m6A, IRES • 10%のmRNAがcap非依存の翻訳を受ける • 5’UTR and 3’UTRどちらにもエンリッチ
- 5. RNA folding • 配列→構造 • 相補的な塩基のpairingにより安定化 • A-U, G-C, G-U • ΔG of GC/CG stacking is • 3.4kcal/mol - ATP hydrolysis 7kcal/mol • 最安定（MFE）構造を予測 Hairpin Internal Multi A Exterior Bulge …((…))… Example
- 6. RNA “inverse” folding • 構造 → 配列 • 特定のMFE構造を取る配列をデザインする • RNA合成の分野で重要 • ターゲット：数十から数百nt 程度のアプタマー、リボスイッチ • ナイーブにやるとだいたい計算は激重 • 配列を作る → MFE構造予測 O(N^3) → 配列を作る…の繰り返し • シュードノット以上の複雑な構造のMFEはNP完全なので大体は無視
- 7. 既存ソフトウェア 温度依存で2構造を取る • Switch Design (Flamm 2001) - adaptive walk • Frnakenstein (Lyngso 2012) - genetic algorithm • どちらも該当する中で探索をしな がら最適配列を一つ出力する 初めて厳密解の列挙が可能なアルゴリ ズムを作った Inverse folding • RNAinverse • RNA-SSD • INFO-RNA • MODENA (made in Japan!) • NUPACK-DESIGN (Caltech) • Inv (China) • RNAifold
- 8. アルゴリズム概要 • RNAifoldをベースの制約付きのInverse folding • 複数構造に対して実行 • 二次構造を木構造に分解 • ノード間のoverlap・inclusion • 関連するノードは同時に最適化 • ノードの探索順序を確定 数字逆？ 実装：C++&OR-tools (CP search engine) ループ内はおそらくマルチスレッド
- 9. 1,2: bp and up 0: bp and bp 4,6: bp and paired i 5,6: bp and paired j 7: closing bp
- 11. ……((……))…………….((((…))).)…… ④各部分構造から得られた配列を組み合わせて最終的に目的の構造と合うか確認 RNAifoldの戦略 AAGAAAAAACUA ACGGGAAACCCAGA ……((……))…………….((((…))).)…… + Target MFE 不一致の場合 • 正解部分のBpを確率的に固定し再探索 (LNS) • 全パターン試す (CP)
- 13. • 完成したものからMFE構造を チェックする（30℃→10℃） 工夫（Heuristic） • 塩基対は安定的なGCから入れて みる • 片方では組まないものは逆に不安 定なものから • ループ領域はAUから入れてみる • ただしランダム変数で順序には揺ら ぎ 温度依存で目的構造が２つある場合
- 14. 結果 thermo-IRESのデザイン 42℃（活性高い） 30℃（活性低い） Experimentally validated! • RNAifold2Tで候補を挙げる • 以下の選択基準でD1,D2をセレクト • (a)(b)の構造をとる（P > 0.2） • 意図しない構造の確率の２倍以上 • 直近のドメイン4の構造を不安定化させない Activity42℃/30℃ WT D1 D2 NC Start codon Py tract • FMDV IRES domain 5 • IRESのCap非依存な翻訳は42℃の構 造の方がよく働く
- 15. IRES活性の実験的検証方法 • Luc/CAT • 35S labelled Luciferase polypeptide • chloramphenicol acetyl transferase polypeptide • SDS-PAGE → Densitometerで発現量の比を取る CAT 5’UTR Luciferase Cap
- 16. 結果 予測結果比較 λ phage thermoregulator RF01804 Relative frequency of the cost function of SD→低くある必要はない？ Black : RNAifoldの全解探索 を長時間行ったもの
- 17. Cost function Flamm, et al. RNA. 2001. G: partition function →-RTlnp(Ω1)-RTlnp(Ω2) →ただし結果1で使っていた選択 基準に類似😅
- 18. 短 (N<130nt) 30min Supplementary 全体的な列挙数はRNAiFold2T 解けた総数はあまり変わらず 結果 thermoregulatorの列挙
- 19. 長 (N>130nt) 60min Supplementary 結果 thermoregulatorの列挙 全体的な列挙数はRNAiFold2T 解けた総数はSDが若干上回る
- 20. • 24hr走らせて、出せるだけ候補を出す • オーダーで２桁以上違う→列挙に強い（配列は似てる可能性が高い） 短 24hr 結果 thermoregulatorの列挙
- 22. コメント • アルゴリズムとしては既存のものに新たな制約を追加したもの • ニッチだけど厳密解えらい→既存手法のコスト関数は実はイケてないのでは？ • 実用的には様々なheuristicが必要 • MFEにしか（有効に）使えない、構造計算の再利用は0 • 長いものに対してたくさんの候補を出せるところに優位性 • あとは頑張って実験という方向性 • 生物学的に面白いトピックに使える（た）点が評価されたという印象