O documento discute doenças causadas por riquétsias, incluindo febre maculosa. Ele resume pesquisas sobre detecção de anticorpos e isolamento de cultura para riquétsias do grupo da febre maculosa usando imunofluorescência indireta. O documento também descreve o uso de PCR em tempo real para diagnóstico de febre maculosa, avaliando sua sensibilidade e especificidade em casos fatais.

1. Elvira Maria Mendes do Nascimento
Pesquisador Científico

2. LACEN - SP

4. DOENÇAS RIQUETSIAIS HUMANAS:
 Febre Maculosa
 Tifo murino
 Febre Q / Endorcardite por Coxiela
 Erliquioses
 Bartoneloses
 Angiomatose Bacilar
 Doença da Arranhadura do Gato
 Endocardite por Bartonela (projeto INCOR)

6. Pesquisa de anticorpos específicos para o Grupo da Febre Maculosa
- Reação de Imunofluorescência Indireta em amostras de soro pareadas (intervalo ≥ 15 dias)
64
128
256
512
1024
C+
64
128
256
512
1024
128
C-
Antígeno – Cultura
Concentrada de Riquétsias do
Grupo Febre Maculosa
64
256
512
1024
C+
C-
Anti IgG/M Humano
Marcado com
Fluoresceína
Negativo
Positivo
• Cor e Forma

8. A
B
C
D
Figura 1: Reação de IFI para Grupo Febre Maculosa: A- controle negativo, IgG (10X); B- controle negativo (40X);
C- controle positivo,IgG (10X); D- controle positivo (40X)

10. Pérolas de vidro
Agitação no vortex
Centrifugação 2500 rpm 25°C 1 hora
Incubação 37°C 5 dias
BHI 1mL
Coágulo
5mL sangue
Positivo
focos
Incubar com soro IgG positivo
para FM
Negativo
Anti IgG Marcado com
Fluoresceína

12. A
B
C
D
E
F
Fig 2 – Isolamento em cultura celular (Vero) identificação por Imunofluorescência indireta para riquétsias do Grupo da Febre Maculosa:
A- controle negativo (10x); B- controle negativo (20x); C- controle negativo (40x); D- isolamento positivo (10x); E- isolamento positivo (20x); Fisolamento positivo (40x);
Fonte: Santos et al.
Fotomicroscópio Zeiss, modelo Axioskop 2 plus Fotografado por Dra Jussara Bianchi Castelli do Laboratório de Patologia do InCor-HCFMUSP.

14. Immunohistoquímica para Rickettsia spp
Immunohistochemical
assay
showing
granular
an3gen
staining
in
endothelium
(polyclonal
an3-­‐
Ricke:sia
an3body-­‐
X400)
Fonte: Dra. Roosecelis A. Brasil, Centro de Patologia - IAL

18. LightCycler® 480
Roche
Applied Biosystems 7500
Real-Time
Life Technologies

19.  PCR é uma reação baseada na replicação do DNA
 Extração do ácido nucléico através kit comercial (coluna de sílica)
 O DNA do agente infeccioso é amplificado e o sinal dessa amplificação é captado pelo aparelho
(composto fluorescente)

20. A FMPCR atualmente é constituído por 3 reações de qPCR:
 uma para Rickettsia spp
(gene gltA, com detecção por sonda TaqMan®)
 um para riquétsias Grupo Febre Maculosa
(gene OmpA, com detecção por SYBR Green)
 um controle interno endógeno
(RNAse P humana, com detecção por sonda TaqMan®)

21. Validação dos ensaios de PCR em tempo real
Curva de concentração decrescente para reação de qPCR para Rickettsia spp analisada no ABI7500

22. Curva padrão de eficiência para reação de qPCR para Rickettsia spp analisado no ABI7500
Template DNA de Rickettsia
rickettsii em co-cultivo de
células Vero
[ ] estimada: 10+7 cópias/mL

23. LightCycler® 480
Roche
Curva de concentração decrescente para o protocolo de qPCR para riquétsias GFM,
analisada no LC480-ROCHE

24. LightCycler® 480
Roche
Curva dissociação dos produtos amplificados
Curva padrão de eficiência para o protocolo riquétsia GFM,
analisado pelo LC480-Roche

26. Bacteremia
• Período (curto)
• Intensidade
-mais frequentemente
-Fácil processamento
vasculite aguda
compatível com casos de óbito
-podem ser utilizados
40 casos
Não fatais
10 positivos
soroconversão
1ª amostra IgG<64
Sensibilidade 25%
Em casos não fatais
30 negativos

27. AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DA PCR EM
TEMPO REAL PARA O DIAGNÓSTICO DA FEBRE MACULOSA
BRASILEIRA EM CASOS FATAIS
Nos anos de 2010 e 2012 - casos fatais suspeita clínica e/ou epidemiológica de FMB:

28. Concordância entre os
resultados foi de 100%
Concordância entre os
resultados foi baixa (kappa=0,096,
p-valor=0,435, intervalo de confiança 95% de
0,336 a –0,144).
RIFI positivo=título de anticorpos tipo IgG e/ou IgM≥128

29. 31,6% casos como
positivos para FMB
concordância entre os resultados
foi baixa
(kappa=0,186, p-valor=0,005, intervalo de
confiança 95% de 0,316 a –0,056).
FMPCR foi um avanço o diagnóstico laboratorial da
FMB

30. 156
152
38
42
(36 casos)
(41 casos)
-2011 a partir de maio
23%
-2012 até 26 de outubro
28%
Fonte: SIGH

32. Material de escara de inoculação/
sufusão hemorrágica

34. Elvira Maria Mendes do Nascimento
Pesquisador Científico
emmendes55@gmail.com
Fabiana Cristina Pereira dos Santos
Pesquisador Científico
Sílvia Colombo
Assistente Técnica de Apoio à Pesquisa Científica e Tecnológica
Nilcéia de Lourdes Ramos Arruda
Auxiliar de Laboratório