1. 20/03/2011
Applicazioni terapeutiche dei cheratinociti staminali
Applicazioni terapeutiche delle cellule a) rigenerazione dell’epidermide
staminali epiteliali: stato dell’arte e
epiteliali:
prospettive future
Enzo Calautti
ecalautti@dti.telethon.it b) rigenerazione dell’epitelio corneale
Centro Biotecnologie Molecolari
Universita’ di Torino
Torino, 22 gennaio 2011
L’epidermide: L’epidermide e’ un tessuto autorinnovante composto da:
•E’ l’epitelio stratificato della pelle •cheratinociti proliferanti, nello strato basale, separati da una lamina basale
dal derma sottostante.
•Ha la fondamentale funzione di barriera fisico-chimica del corpo umano
fisico- •cheratinociti differenzianti negli strati suprabasali
Desquamation
Keratinocye
desquamation
Keratinocye
differentiation
I cheratinociti rappresentano circa il 90% delle cellule che
compongono l’epidermide
I fibroblasti sono il tipo cellulare predominante nel derma Keratinocyte
Scambi di segnali tra epidermide e derma sono importanti proliferation
(keratinocyte stem cells)
per l’omeostasi del tessuto
Il follicolo pilifero, di derivazione epiteliale, contiene cheratinociti staminali
nella zona del “bulge”, capaci di rigenerare anche l’epidermide interfollicolare
e le ghiandole sebacee in seguito a danni
Stem Cell TA Progeny
Self-renewal - Differentiation
I cheratinociti staminali presenti nello strato basale dell’epidermide
costituisco circa 1-5% delle cellule proliferanti e permettono
l’autorinnovamento di questo tessuto le cui cellule vengono rinnovate
ogni 4 settimane per tutta la vita dell’individuo
I cheratinociti staminali hanno la capacita’ di dividersi in seguito a certi
stimoli generando sia un pool di cellule uguali a se stesse (preservando il
compartimento staminale) sia una progenie di cheratinociti indirizzati al
differenziamento
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2. 20/03/2011
Epidermal stem cells properties Le proprieta’ delle cellule staminali
- Poorly differentiated
Cellule Transit Amplifying (TA)
- High capacity for self renewal with an increased potential for error- Staminali
proliferanti
- Sono indifferenziate e
free proliferation and cell division proliferanti
- Long life span - Danno origine a cellule
- Long cell cycle under homeostatic conditions (quiescence) figlie con destini
- High telomerase activity differenti
- Stem Cell division can be asymmetric or symmetric • Una mantiene la
caratteristica
- Molecular markers poorly defined (integrins α6, β1, p63 transcription Cellule
destinate
proliferanti staminale
factor). Differences in SC markers between humans and rodents
• L’altra differenzia
perdendo la capacità
Cellule
Stem cell transient amplyfing cell post-mitotic cell terminally differentiated differenziate di proliferare.
non-proliferanti
cell
Il microambiente (nicchia) regola la biologia Come sono nate le procedure cliniche basate
delle cellule staminali sull’espansione di cheratinociti staminali in coltura?
- Anni ’70: la prima coltura di cellule epiteliali, ottenute da teratoma murino,
Sicuramente i fattori ambientali hanno peso nel determinare la
su un supporto di cellule “feeder” che producono fattori di crescita tali da
divisione asimmetrica;
prevenire la senescenza cellulare e il differenziamento in coltura
Il numero di cellule staminali e’ regolato in modo da favorire
Anni ’70 (H. Green): cellule epiteliali, derivate
l’omeostasi del tessuto (la progenie di una staminale non e’ da teratoma murino, potevano essere espanse
sempre 1 stem e 1 TA cell). in coltura se coltivate su un supporto di
fibroblasti murini embrionali immortalizzati e
In casi particolari (danno tessutale) vi puo’ essere irradiati letalmente (feeder layer)
amplificazione del numero delle cellule staminali
Si ritiene infatti che l’ambiente in cui risiede una cellula
staminale (nicchia staminale) giochi un ruolo chiave nel
regolare l’autorinnovamento e il differenziamento di queste Da questa osservazione si e’ ipotizzato che
anche cellule epiteliali umane normali come i
cellule cheratinociti potessero crescere su feeder
layer
- 1977 (Rheinwald & Green): mezzi addizionati di EGF favoriscono la
capacita’ replicativa a lungo termine dei cheratinociti umani in coltura
Saggio funzionale di staminalita’: “Colony Forming Efficiency”
Holoclones: large with smooth circular perimeter. Are the stem cells of virtually all human
squamous epithelia and are required to restore massive epithelial defects.
Meroclones: wrinked perimeter. They have intermediate proliferative and clonegenic
potential; they give rise to and are a reservoir for paraclones.
Paraclones: small and highly irregular perimeter. They have the properties of transient
Concetto importante emerso da questi studi: amplyfing progenitor cells: grow rapidily at first, but their total lifetime is no more than 15 cell
la capacita’ replicativa a lungo termine dei cheratinociti in generations, after which their growth is arrested (involucrin).
coltura e’ direttamente proporzionale alla loro capacita’ di -Anni 80 (Barrandon and Green): Classificazione dei tipi di cloni generati da
formare un numero elevato di colonie grandi e regolari singoli cheratinociti e aventi una diversa capacita replicativa in coltura.
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3. 20/03/2011
I chertatinociti staminali epidermici umani sono utilizzati in
protocolli terapeutici di medicina rigenerativa Trattamento di pazienti con ustioni estese
Trapianto autologo di epidermide coltivata in vitro
Ustioni sul 45-50% della
superfice corporea
Escarectomia mediante
Preparazione del sito di Escissione tangenziale
innesto del tessuto
Rigenerazione
Keratinocytes grow in epidermica
macroscopic
colonies when seeded on
completa e stabile
a feeder layer
( lethally irradiated
mouse fibroblasts)
Transplantation, 1999, 68(6):868-879
L’uso di fibrina: L’uso di fibrina:
• non altera le funzioni di staminalita’ • migliora la manipolazione del foglietto epiteliale
• evita il trattamento enzimatico per il distacco
del foglietto epiteliale
- fibrina + fibrina
L’aspetto critico per il successo di questa procedure e’ che
nei foglietti epiteliali generati in vitro sia presente
un numero adeguato di cellule staminali
(holoclone forming cells)
Un foglietto di epidermide umana coltivata in vitro e trapiantata in un topo
immunodepresso, dopo 108 giorni, all’analisi istologica rivela:
1) la capacita di generare un epidermide umana, le cui cellule sono positive ad anticorpi
involucrina uomo-specifici e uno spesso strato corneo, tipico del tesuto umano La deteminazione degli olocloni nella pratica clinica e’ ancora
2) caratteristiche di autorinnovamento conferitogli dalla presenza di cheratinociti staminali il miglior indicatore della presenza di keratinocyte stem cells
nel foglietto trapiantato. Tali cellule sono state in grado di generare cheratinociti
differenzianti e costituire cosi’ tutti gli strati dell’epidermide e di garantire un ricambio dei
diversi strati cellulari ogni 30 giorni circa. La determinazione del numero di olocloni in una
coltura e’ difficile e laboriosa.
Involucrina
Umana +
Nella pratica clinica, abbiamo bisogno di saggi alternativi
(spesso quando e’ necessario procedere tempestivamente).
epidermide Un buon sostituto e’ la derminazione del numero di colonie
abortive (paracloni) che e’ inversamente proporzionale
al numero di olocloni (< di 10%)
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4. 20/03/2011
Epiteli stratificati della superficie oculare:
Congiuntiva, Cornea e Limbus
L
C: Cornea
L: Limbus
CJ: Congiuntiva
Cornea:
L’epitelio corneale e’ stratificato, non corneificato e trasparente. Human Corneal Epithelium
Ha la funzione di barriera ma soprattutto grazie alla sua trasparenza permette il
Passaggio della luce
E’ autorinnovante nonostante i cheratinociti che lo compongono siano gia “committed”
al differenziamento
cheratinociti
rappresentano circa il
90% delle cellule che
compongono l’epitelio
corneale
Ex vivo Corneal Cell Therapy Trapianto autologo di epitelio corneale coltivato in vitro
1) Limbal biopsy
2) Limbal keratinocyte
isolation
Ad admission Afetr limbal culture
Transplantation
(It must contain stem cells)
3) Limbal keratinocyte
in vitro expansion
on a feeder layer
4) Cultured limbal
epithelium on a fibrin After limbal culture+
gel Keratoplasty
5) GRAFTING
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5. 20/03/2011
Trapianto autologo di epitelio corneale coltivato in vitro
Dati clinici dimostrano che grafts che contengono
< 3% di cellule che esprimono alti livelli di
p63 hanno un alto rischio di insuccesso
1) Limbal biopsy
2) Limbal keratinocyte SAGGI FUNZIONALI IN VITRO:
isolation •Clonogenic assay LIMBUS CORNEA
•Stem cell marker:
p63+cells>3% Resting stem cells
3) Limbal keratinocyte
in vitro expansion
on a feeder layer Ad admission Afetr limbal culture
4) Cultured limbal
epithelium on a fibrin Self-renewal Proliferation+migration Wound healing and terminal differentiation
gel Proliferation potential
Afetr limbal culture+
5) GRAFTING Keratoplasty
More than 75% of success rate in a study on 112 patients treated The rate of success directly correlates with the presence of p63-bright,
with autologous limbal stem cells grafts containing >3% p63 bright cells holoclone-forming cells (stem cells) in the limbal grafts
Rama et al., 2010, the New England Journal of Medicine Rama et al., 2010, the New England Journal of Medicine
Opacita’ corneale: Trapianto o non trapianto? Le sfide attuali nelle terapie rigenerative della cornea
Trapianto di cornea:
• e’ indicato nei casi in cui l’epitelio
limbare sia integro e dunque in grado di colonizzare e
rinnovare a lungo termine l’epitelio corneale
E’ possibile mantenere ed espandere cellule staminali limbari
•non e’ indicato nei casi di deficit limbari per trauma In pazienti in cui il pool di cellule staminali endogene è
meccanico, chimico o reazioni immunologiche o seriamente compromesso?
cause genetiche Possiamo trovare fonti alternative di cellule staminali per
trattare I deficit completi bilaterali di cellule staminali limbari?
•viene associato al trapianto di cellule limbari coltivate nel
caso in cui lo stroma corneale sia molto compromesso :
(rimozione del panno congiuntivale, trapianto di foglietto
limbare coltivato, cheratoplastica (trapianto di cornea)
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6. 20/03/2011
Activated Akt and p63 are not found in the corneal epithelium,
E’ possibile disegnare strategie per l’espansione ex vivo depleted for keratinocyte stem cells
delle cellule staminali epiteliali?
Limbus Cornea
Possiamo manipolare farmacologicamente i segnali cellulari
responsabili dell’autorinnovamento e differenziamento dei
cheratinociti staminali limbari?
Ricerca di target moleculari per l’espansione ex vivo di cellule staminali
P63/p-Akt
P63/p-Akt
Terapia genica di malattie ereditarie mediante la
correzione genetica cellule staminali Gene Therapy ex vivo
Inserimento del gene terapeutico in cheratinociti
staminali tramite vettori virali,
seguita da amplificazione delle cellule
Generazione di un epitelio geneticamente corrette su feeder layer
geneticamente corretto
Nell’epidermolisi bollosa, le funzioni adesive delle cellule
epidermiche dello strato basale sono compromesse
Epidermolisi bollosa
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7. 20/03/2011
Mavilio et al., Nature Medicine, 2006
Mavilio et al., Nature Medicine, 2006
Prospettive terapeutiche: Cellule staminali embrionali (ES cells)
riprogrammazione
totipotenti pluripotenti
•Cellule staminali embrionali (spesso chiamate “pluripotenti”) capaci di
differenziare in tutti i tipi cellulari dell’organismo
•Cellule staminali adulte o tessuto specifiche (difficili da identificare,
isolare, e purificare.
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8. 20/03/2011
Le ES cells, in vitro (uomo e topo) e in vivo (topo) Le cellule adulte possono essere riprogrammate a
possono differenziare in tutti i tipi cellulari maturi uno stato di pluripotenza analogo a quello delle
cellule staminali embrionali (ES cells)
Induced pluripotent stem cells (IPs cells)
(cellule staminali pluripotenti indotte)
Sono state generate cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) a partire da
fibroblasti dermici umani (HDF) introducendo i retrovirus esprimenti i
fattori trascrizionali OCT 3/4, SOX 2, c-Myc e KLF4
Dopo 2 settimane compaiono colonie granulate(C) morfologicamente diverse alle cellule hES, ma dopo
altri 10 giorni si osservano colonie piatte(D) simili a quelle formate da cellule hES
Cheratinociti umani del follicolo pilifero
•Transdifferenziamento in senso limbo-corneale
•Riprogrammazione a cellule iPS
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9. 20/03/2011
ambientale divisionale
Ringraziamenti
Fondazione Telethon
Regione Piemonte
Molecular Biotechnology Center
Centro Regionale Trapianti del Piemonte
Fondazione Banca degli occhi del Veneto
Divisione cellulare asimmetrica
In vivo, activated Akt is found in cells expressing high levels of p63,
a putative stem cell marker of the limbal epithelium
Attualmente le applicazioni terapeutiche delle cellule
staminali (terapie cellulari e geniche) sono strettamente
regolamentate da norme di. Good Manufacturing Practice (GMP)
Le terapie cellulari seguono le stesse regole della
produzione di un farmaco (sono regolamentate dall’
agenzia AIFA in Italia) che approva le procedure B- DAMAGE
terapeutiche.
Devono essere eseguite in strutture dedicate approvate
dall’AIFA come conformi alle GMP
C- CORNEAL CONJUNCTIVALIZATION
pAkt/p63 Limbal Epithelium
-”Holoclones”:
cloni di cheratinociti con la piu’
elevata capacita’ replicativa e sono
originati da cheratinociti staminali.
Quando colture di cheratinociti
contenenti olocloni vengono Nello stroma corneale
trapiantati sono capaci di rigenerare
un epitelio autorinnovante per tutta
l’organizzazione del
la vita collagene in fasci
perpendicolari garantisce
-Merocloni e Paracloni :
danno origine a cloni di cheratinociti
la trasparenza del tessuto
gia indirizzati al differenziamento e alla luce
dunque incapaci di mantenere il
rinnovamento dell’epidermide
Lo stroma corneale e’
avascolare
Lo stroma corneale
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10. 20/03/2011
Limbus: epitelio stratificato posto tra congiuntiva e cornea riconosciuto come la Le cellule pluripotenti sono in grado di differenziare in
nicchia staminale dell’epitelio corneale: cellule derivate da tutti e tre i foglietti embrionali
I cheratinociti staminali sono interdispersi nello strato basale e proliferante
L
L
Limbus
Epithelium
Bowman Layer
Stroma
Bowman Layer
END
Cheratinociti Limbari primari generano cloni di keratinociti staminali e differenzianti
Ricostituzione del follicolo pilifero Oloclone: H1 Meroclone:M1
H1, H2: Olocloni, cloni di cheratinociti derivanti M1, M2: merocloni, cloni di cheratinociti derivanti da
da una singola cellula staminale in coltura una singola cellula transient amplifying in coltura
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