Hepatites A, B e C e métodos imunológicos para diagnóstico
Teste elisa
1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
MESTRADO EM ODONTOLOGIA
Técnicas em Biologia Molecular
2. Técnicas em Biologia Molecular
No final da década de 50 os cientistas aprenderam a
caracterizar, manipular e isolar os componentes moleculares
(DNA, RNA, proteínas) de células e microorganismos.
3. Técnicas em Biologia Molecular
•Clonagem
•ELISA
•PCR
•Probind and Blotting (Western blotting)
•Arrays
•Oligonucleotídeos específicos
5. ELISA
Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
ELISA é um teste imunoenzimático que permite a detecção de
anticorpos/antígenos específicos no plasma sanguíneo. Este teste é
usado no diagnóstico de várias doenças que induzem a produção
de imunoglobulinas.
6. APLICAÇÕ
ES
• Doenç as infecciosas (HIV...)
• Detectar alergia a alimentos (leite, ovo...)
•Identificaç ão de antígenos (hormô nio da gravides, alergia a
drogas...)
• Doenç as auto-imunes
•Concentraç ão sé rica de anticorpos
7. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
1Teste utilizado para detectar a presença de antígenos (Ag) ou
anticorpos (Ac) específicos em fluidos corporais ou sobrenadantes
de cultura.
2Une a especificidade de uma ligação Ag-Ac com a sensibilidade de
uma reação enzimática, permitindo assim a detecção de
quantidades mínimas de uma substância em particular e com
grande confiabilidade.
3Uma enzima, covalentemente ligada a um Ag ou Ac, reage com um
substrato, dessa forma levando a oxidação de um cromógeno
incolor, o qual então desenvolverá coloração dependente da
concentração de Ag/Ac pesquisados.
8. Componentes
•Anticorpo ou Ag ligado
•Enzima ativa
•Substrato
•Produtos solúveis
2 Enzyme-linked Ab
Serum Ab
Antigen
9. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
1Utiliza-se uma base sólida (placa de poliestireno com 96 poços
dispostos em 12 fileiras verticais, cada uma com 8 poços) na qual
Ag/Ac irão se ligar através de interações hidrofóbicas.
2É um método tanto qualitativo quanto quantitativo.
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10.
11. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
1Elementos necessários para a realização:
2Ag purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ac)
3Ac purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ag)
4Controles (Positivo, Negativo, Ponto de Corte) – nos ensaios qualitativos
5Padrões (soluções com concentração conhecida do analito a ser dosado)
– nos ensaios quantitativos
6Amostras a serem testadas
7Placa de poliestireno
8Tampão de lavagem: utilizado para remover o Ag ou Ac livres na placa, Ag
ou Ac ligados com pouca avidez e outras moléculas interferentes
9Conjugado: Ac ou Ag ligados covalentemente a uma enzima
10 Cromógeno: substância incolor que, ao ser oxidada pela reação
enzimática, produz cor
11 Leitora de ELISA (espectrofotômetro): converte as diferentes intensidade
de cor resultantes ao final do ensaio em valores numéricos (valores de
densidade óptica - DO)
14. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
•Vantagens
•Teste com alta sensibilidade (habilidade de detectar quantidades
mínimas do Ag ou Ac pesquisados (O ELISA detecta moléculas na
ordem de nanogramas) – menor risco de falsos-negativos.
•Teste com alta especificidade (característica que indica que o teste
em questão identificará somente o Ag ou Ac desejado) – menor
risco de falsos-positivos.
•Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo.
•Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo a médio
em comparação com outras técnicas de imunodiagnóstico.
15. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
•Desvantagens
•Necessidade de mão de obra especializada.
•Alguns reagentes podem degradar-se com facilidade, com
exposição à luz do sol ou a elevadas temperaturas.
•Por ser uma técnica altamente sensível e específica, é muito
susceptível a erros de pipetagem, variações nos tempos de
incubação e lavagens, e alterações nos reagentes.
16. PRINCIPAIS TIPOS
•INDIRETO: detecta principalmente Ac
•DIRETO: detecta principalmente Ag
•COMPETIÇÃO: detecta Ag com baixo peso molecular
(monovalentes)
•CAPTURA: detecção de Acs (principalmente IgM, evitando a
ação do fator reumatóide)
17. 1. ELISA INDIRETO
1) Inicialmente, o Ag é adicionado à placa e se adere à superfície dos poços
2) Em seguida, são realizadas lavagens para a retirada do Ag livre nos poços
3) A solução a ser pesquisada é adicionada. Caso contenha Acs específicos contra os
Ags presentes na placa, estes se ligarão aos Ags
4) Uma nova série de lavagens é realizada para retirar os Acs que não se ligaram aos
Ags
5) É então adicionado o conjugado, que se liga aos Acs
6) Uma nova lavagem retira o conjugado livre
7) O cromógeno e o substrato são adicionados, e se o cromógeno for oxidado pela
ação da reação enzimática, haverá desenvolvimento de cor
18. ELISA INDIRETO
1Interpretação dos resultados:
2A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de Ac da
amostra pesquisada.
3Para determinar quais indivíduos são positivos ou negativos para a doença
pesquisada, deve-se calcular um ponto de corte (“cut-off”) para aquele ensaio.
Acima dos limites do cut-off, encontram-se os indivíduos positivos e abaixo os
negativos.
O ELISA Indireto não determina se o indivíduo ESTÁ ou não doente naquele
momento. Ele apenas afirma se aquele animal/paciente já teve ou não contato
com o agente causador da enfermidade em algum momento de sua vida.
www.labimuno.org.br
19. ELISA INDIRETO
1Aplicações na medicina humana e veterinária:
2Diagnóstico sorológico de doenças infecto-contagiosas, onde a
detecção de AcIgG, IgA ou IgE seja significativa.
3Exemplos na Medicina Humana: diagnóstico sorológico da
Doença de Chagas e da SIDA/AIDS.
4Exemplos na Medicina Veterinária: diagnóstico da Linfadenite
Caseosa e da Leishmaniose.
5OBS: Não deve-se detectar IgM por esta técnica devido à ação
do fator reumatóide.
21. ELISA DIRETO OU SANDUÍCHE
1Interpretação dos resultados:
2A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração
de Ag da amostra pesquisada.
3Para este teste se tornar quantitativo, é necessária a construção
de uma curva com os valores de densidade ótica obtidos a partir
da reação de padrões com concentrações conhecidas do antígeno
a ser dosado. A curva serve como padrão de comparação para
deduzir as quantidades de antígenos nas soluções-teste.
22. ELISA DIRETO OU SANDUÍCHE
•Aplicações na medicina humana e veterinária:
•Muito usado para a dosagem de hormônios, marcadores
tumorais e outras proteínas séricas, bem como para a detecção
de antígenos virais e de outros patógenos nas fezes, na urina e
em secreções. Pode detectar 10-12 a 10-14g.
•Exemplos na Medicina Humana: Teste de Gravidez (teste de
detecção da gonadotropina coriônica humana (HCG) no soro).
•Exemplos na Medicina Veterinária: Triagem na indústria de
alimentos (pesquisa de patógenose contaminantes nos
alimentos).
24. Gerações do ELISA
HIV
Terceira geraç ão só detectavam a presenç a de anticorpos ( IgG e IgM) trê ou
s
quatro semanas apó s o contato.
Quarta geraç ão já detectam tanto anticorpos quanto um dos antígenos do HIV
(a proteína p24), fato esse que diminuiu sensivelmente o período de janela
imunoló gica, podendo chegar a apenas duas semanas.
Um resultado reagente num teste de HIV por ELISA é sempre confirmado por
outros testes específicos, como é o caso do Western blot, que detecta
proteínas deste vírus, e do PCR, que detecta os seus ácidos nucleicos virais.
25. Os exames de anticorpos sã relatados como positivos ou negativos.
o
O desempenho destes exames é descrito em termos de:
■sensibilidade — a percentagem dos resultados que serão
positivos quando o HIV estiver presente.
■especificidade — a percentagem dos resultados que serão
negativos quando o HIV nã estiver presente.
o
Todos os exames de diagnó stico tê limitaç õ e, algumas vezes, o
m es,
seu uso pode produzir resultados errô neos ou questioná
veis.
■falso positivo — os resultados indicam que o HIV está presente,
quando, na verdade, nã está
o .
■falso negativo — os resultados nã identificam o HIV, que está
o
presente.
O método utilizado para realizar o teste se baseia na interação anticorpo-antígeno . Normalmente é usada uma placa de superfície inerte com poços onde serão adsorvidos os antígenos de interesse, juntamente com um tampão de carbonato (processo conhecido como sensibilização). Depois é realizada uma lavagem com PBS . Posteriormente, é feito o bloqueio com PBS Tween com 10% de soro de cabra ou com BSA para que esta ocupe os poços livres (sítios inespecíficos que podem gerar resultados falso positivo ou negativo). Novamente é feita a lavagem. A superfície é então tratada com solução de anticorpo primário - sabendo-se que exista uma quantidade maior de anticorpo do que a proteína - específico para a proteína de interesse e este vai se ligar a ela. A superfície é lavada novamente para retirar os anticorpos primários que não foram incorporados em nenhuma proteína. Em seguida, o produto é tratado com anticorpos secundários que possuem uma enzima acoplada que irá produzir uma substância corada e que se constitui de um anticorpo para o anticorpo primário. A superfície é lavada novamente para a retirada do anticorpo O método utilizado para realizar o teste se baseia na interação anticorpo-antígeno . Normalmente é usada uma placa de superfície inerte com poços onde serão adsorvidos os antígenos de interesse, juntamente com um tampão de carbonato (processo conhecido como sensibilização). Depois é realizada uma lavagem com PBS . Posteriormente, é feito o bloqueio com PBS Tween com 10% de soro de cabra ou com BSA para que esta ocupe os poços livres (sítios inespecíficos que podem gerar resultados falso positivo ou negativo). Novamente é feita a lavagem. A superfície é então tratada com solução de anticorpo primário - sabendo-se que exista uma quantidade maior de anticorpo do que a proteína - específico para a proteína de interesse e este vai se ligar a ela. A superfície é lavada novamente para retirar os anticorpos primários que não foramEm seguida, o produto é tratado com anticorpos secundários que possuem uma enzima acoplada que irá produzir uma substância corada e que se constitui de um anticorpo para o anticorpo primário. A superfície é lavada novamente para a retirada do anticorpo secundário que não se ligou ao anticorpo primário. Adiciona-se o substrato de ligação para a enzima produzir a substância corada e, assim, medindo-se a intensidade da cor da superfície, pode-se quantificar e verificar a presença de alguma substância de interesse. secundário que não se ligou ao anticorpo primário. Adiciona-se o substrato de ligação para a enzima produzir a substância corada e, assim, medindo-se a intensidade da cor da superfície, pode-se quantificar e verificar a presença de alguma substância de interesse.
O fator reumatóide é um auto-anticorpo geralmente da classe IgM, específico para IgG. Este fator encontra-se elevado em algumas situações, particularmente nas doenças reumáticas. Tal anticorpo pode se ligar na IgG específica (contra o antígeno teste), presente no soro do paciente, gerando assim um resultado falso positivo caso se use um conjugado anti-IgM, como no ELISA indireto. Para mensuração de IgM, deve-se utilizar o ELISA de captura.
