1. Fundo científico
Células maduras podem ser reprogramadas para se tornar pluripotentes
O Prêmio Nobel de 2012 de Fisiologia e Medicina é atribuído ao Dr. John B.
Gurdon e ao Dr.ShinyaYamanaka por suas descobertas de que células adultas
diferenciadas, podem ser reprogramados para conter um estado celular
pluripotente. Isso representa uma mudança de paradigma na nossa
compreensão da diferenciação celular e da plasticidade do estado
diferenciado. Diferenciação celular aparece como um processo
unidirecional,onde as células indiferenciadas amadurecem para vários
destinos de células especializadas, tais como os neurónios, músculos e células
da pele. A opinião prevalente durante a primeira metade doséculo 20foi a de
que as células maduras forampermanentemente bloqueadas no estado
diferenciado, e se tornaram incapazes de voltar para um estado totalmente
imaturo,estado de células pluripotentes estaminais. Em 1962, John B. Gurdon
mudou radicalmente este ponto de vista, demonstrando queo núcleo de uma
célula epitelial intestinal diferenciada de rã foi capaz de gerar um girino
totalmentefuncional após o transplante para um óvulo sem núcleo. Esta
descoberta quebrou o dogma de que a diferenciação celular só podia ser um
processo unidirecional. A descoberta de Gurdon foi oponto de partida para o
esforço da clonagem em vários organismos. No entanto, a questão, seuma
célula intacta diferenciadapode ser totalmente reprogramada para se tornar
pluripotentepermaneceu. Em 2006, por umprocedimento surpreendentemente
simples, ShinyaYamanaka mostrou que a introdução de um pequeno conjunto
defatores de transcrição numa célula diferenciada era suficiente para
reverter a célula para um estado pluripotente.As células resultantes foram
chamadascélulas -troncopluripotentes induzidas (iPS). Juntos, Gurdon e
Yamanakatransformaram nossa compreensão da diferenciação celular. Eles
demonstraram que oestado diferenciado, geralmente muito estável , pode ser
desbloqueado, porque abriga um potencial de reversãoa pluripotência. Essa
descoberta introduziu fundamentalmente novas áreas de pesquisa, e oferece
novas oportunidades emocionantes para estudar mecanismos da doença.
Introdução
Durante o desenvolvimento normal, as células procedem a partir do estado
inicial indiferenciado do ovo e de célulasno embrião inicial para um estado
mais especializado. No organismo adulto uma gama de células diferenciadas
de vários tipos são necessárias para executar as funções específicas realizadas
no corpo adulto (Figura 1A). Oovo fertilizado e as células no zigoto são
totipotentes, em outras palavras, elas podem dar origem a todos os tipos
decélulas no embrião, bem como os tecidos, tais como placenta
1
2. extraembrionária. Como o desenvolvimentoprogride, as células na fase de
blastocisto começam a tornar-se distinguíveis: a massa celular interna dá
origem ao embrião propriamente dito, enquanto que as células circundantes
tornam-se a linhagem de trofoblasto e são a fonte dos tecidos extra-
embrionários. As células da massa celular interna são pluripotentes, isto é,
eles podem darorigem a todas as células somáticas, bem como à linhagem de
células germinativas: células destinadas a se tornarem gametas(Óvulos e
espermatozóides).
Durante esta viagem de desenvolvimento, as células tornam-se
progressivamente mais restritas em seu potencial de diferenciação e como
consequência, elas não retêm pluripotência. A maioria das células maduras
são células totalmente diferenciadas, as células-tronco, embora com potência
limitada para permanecer em determinados locais no corpo servem como uma
fonte de reposição de células na medula óssea, intestino epele, por
exemplo. As células diferenciadas são notavelmente estáveis e, como regra,
não mudam o seu destino em outros tipos decélulas diferenciadas ou revertem
para o tipo de células indiferenciadas que podem ser encontradas no início do
desenvolvimento doembrião. Por esta razão, o ponto de vista predominantefoi
o de que as células da linhagem somáticaestavam permanentemente em um
estado bloqueado,de tal forma que o caminho de retorno a um estado
altamente indiferenciado foi impossível. A percepção de que vários tipos de
células diferenciadas foram dotadas de um padrão específico deproteínas
sugere que células diferenciadas podem transportar irreversíveis modificações
epigenéticas ou alterações genéticas que tornam impossível a indução de
pluripotência. Conrad Hal Waddington propôs umapaisagem epigenética de
montanhas e vales como uma metáfora para o desenvolvimento. Dentro desse
panorama,células indiferenciadas, representadas como mármores, residem no
topo de uma montanha. Durante a diferenciação elasescorrem em vales
energeticamente mais estáveis, de onde vêm para descansar como células
diferenciadas.A expectativa era de que seria difícil reverter as células
diferenciadas de voltaaoestado indiferenciado, movendo-as de volta para o
topo da montanha (Waddington, 1957) (Figura 1B).Apesar do dogma, a noção
de que células especializadas poderiamde alguma forma ser desbloqueadas a
partir de seuestado diferenciado e desdiferenciar-senão foi completamente
descartada. Várias estratégias foram consideradaspara resolver o problema
experimentalmente . Por exemplo, Hans Spemann (Prêmio Nobel deFisiologia
ou Medicina 1935) alimentaram a idéia de transferência de núcleos de células
diferenciadas paraum meio imaturo citoplasmático para testar seu potencial de
desenvolvimento. Ele se referiu a esta abordagem como uma"Experiência
fantástica".
2
3. Figura 1 O desenvolvimento normal de um ser humano a partir de um ovo fertilizado
que ilustra o processo unidirecional da maturação através do ovo e embrião para um
ser humano adulto. B, Waddington ilustraa diferenciação celular como uma paisagem
epigenética no qual as células são vistas como bolinhas rolando em vales para chegar
ao seu destino final como células diferenciadas. A metáfora visualiza bem o
desenvolvimento unidirecional do processo de desenvolvimento normal. As células
normalmente não voltam para o topo da montanha para chegar ao estado
indiferenciado, e também normalmente não atravessam outros vales para se
desenvolver em linhagens independentes.
Reprogramação de um núcleo de células somáticas diferenciadas
A tentativa direta para testar se as células diferenciadas na linhagem de células
somáticas foram dotadas de umapotencial desdiferenciação latente foi
realizada por Robert Briggs e King Thomas, quedesenvolveram uma
tecnologia para a transferência de núcleos de células somáticas
indiferenciadase diferenciadaspara um ovo fertilizado enucleado nos
anfíbios Ranapipiens (Briggs e King, 1952).Anfíbios são particularmente
sensíveis a este tipo de experiência devido ao grande tamanho do ovoe o
desenvolvimento de embriões extra-uterinos. Briggs e King mostraram que
um núcleo embrionário,quando transferido para um óvulo sem núcleo, poderia
de fato apoiar o desenvolvimento até a fase de girino.Em contraste, quando se
repetiu o procedimento, com núcleos de células mais diferenciadas, falhou-se
na obtenção de embriões em desenvolvimento. Assim, eles concluíram que os
núcleos diferenciados sofreram irreversíveismudanças durante a diferenciação
de tal forma que a capacidade de promover o desenvolvimento foi perdida
(King eBriggs, 1955).
John B. Gurdon, que tinha treinado em embriologia com Michael Fischberg,
em Oxford, usou um diferenteanfíbio, Xenopuslaevis em vez
de Ranapipiens, para abordar o tema. Em Xenopus, Gurdon podetirar
vantagem de um sistema de rastreio de células, desenvolvido porFischberg e
colegas (Elsdaleet al., 1958)que lhe permitiu diferenciar inequivocamente as
3
4. células derivadas de núcleos transplantados de células do embrião
hospedeiro. Num estudo chave, por irradiação ultravioleta ovos enucleados
Gurdon descobriu que quando os ovos foram transplantados com núcleos de
epitélio intestinal diferenciado do girino, umpequeno número de girinos
nadantes foram realmente gerados (Gurdon, 1962) (Figura 2). Ele pode
mostrar também que a eficiência da reprogramação nuclear pode ser
melhorada grandemente através da realização de transplantes seriados. Por
essa estratégia, ele mostrou que uma proporção considerável de todos os
núcleos celulares de epitélio intestinal puderam ser reprogramados (Gurdon,
1962). Gurdon concluiu que núcleos de células somáticas diferenciadas tem o
potencial de reverter a pluripotência. No entanto,ganhou ampla aceitação na
comunidade científica somente depois de passado um tempo considerável
depois de suadescoberta. Nas experiências subsequentes, Gurdon usou núcleos
de rãs adultas para gerar girinos e, inversamente, núcleos embrionários
diferenciados com desenvolvimento sustentado por sapos adultos (Gurdon e
Uehlinger, 1966; Laskey e Gurdon, 1970).
A descoberta de Gurdon foi uma mudança fundamental de paradigma,
mostrando pela primeira vez que o núcleo da célulaa partir de uma célula
somática diferenciada foi dotado com a capacidade de impulsionar o
desenvolvimento completo em uma gama de tipos de células somáticas e
tecidos após serem colocados no meio citoplasmático de uma célula de ovo.
Figura 2 John Gurdonutilizou luz UV (1) para destruir o núcleo da célula num ovo de
rã. Ele em seguida, substituiu o núcleo do ovopelo núcleo de célula a partir de uma
célula epitelial intestinal diferenciada a partir de um girino (2) Muitos ovos
manipulados não se desenvolveram, mas em vários casos os girinos de natação normal
foram gerados(3). Isto mostrou que a informação genética necessária para gerar as
células diferenciadas em um girino permaneceram intactas na célula doadora do
núcleo. Estudos posteriores demonstraram que os mamíferos também podem ser
clonados por esta técnica (4).
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5. Desenvolvimento de reprogramação por transferência nuclear
A descoberta de Gurdonintroduziu um novo campo de pesquisa centrado na
transferência nuclear somática(SCNT) como um método para compreender
reprogramação e como alterar as células quando se tornam especializadas.Em
1997, o primeiro mamífero clonado, a ovelha Dolly, nasceu depois de uma
SCNT de células mamárias epiteliais adultas para um ovo enucleado de
ovelhas (Wilmutet al., Nature, 1997). A estratégia experimental desenvolvida
por Ian Wilmut e Keith Campbell foi baseada no trabalho Gurdon
em Xenopus, mas com adicionaladaptação técnica. Por exemplo, uma
modificação importante foi que os núcleos usados para transplantação em
mamíferos vieram a partir de células epiteliais da glândula mamaria induzidas
a entrar quiescência, o que tornou as mesmas mais adequadas para se
sincronizar com o embrião em desenvolvimento. Desde a clonagem de
ovelhas, em 1997, até agora SCNT foi usada para clonar uma infinidade de
espécies de mamíferos, incluindo rato, vaca, porco, lobo e onças
africanas. Através da transferência nuclear de núcleos de células a partir
decélulas B - e T –do sistema imunitário, apresentou provas conclusivas de
que um núcleo de célula diferenciada com rearranjo deimunoglobulina
ougenes de receptores celulares T, poderia ser reprogramado para apoiar
odesenvolvimento de um rato (Hochedlinger e Jaenisch, 2002).
Reprogramação de uma célula somática diferenciada intacta para se
tornar pluripotente
Gurdon revelou que um núcleo de célula diferenciada tem a capacidade de se
reverter com êxito a umestado indiferenciado, com um potencial para reiniciar
o desenvolvimento. No entanto manteve-se uma questão em aberto, ou seja, se
seria possível induzir reversão de uma célula intacta diferenciada
aum estado altamente imaturo. Muitos cientistas consideraram esta questão
impossível, ou no mínimo, que a mesma requereria uma reorganização muito
complexa na célula para desbloquear o estado diferenciado. Essa foi a cena
quandoShinyaYamanaka decidiu abordar o problema da reprogramação de
pluripotência.Yamanaka, que havia treinado tanto em cirurgia ortopédica e
biologia molecular, tornou-se interessado pelo estado pluripotente, em parte,
pelo estudo das células-tronco embrionáriaspluripotentes (ES), caracterizadas
primeiramente por Martin Evans (Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de
2007).
O Laboratório de Yamanaka foca-se em fatores importantes para a
manutenção de pluripotência em células-tronco embrionárias, comoERas
(Takahashi et al., 2003) e identificação, em paralelo com o laboratório de
Austin Smith, a pluripotênciado gene Nanog (Mitsui et al, 2003;.. Chambers
et al, 2003). Yamanaka então embarcou na busca de induzir pluripotência em
células somáticas. Em seu trabalho e outros, que ele conheceu um grande
5
6. número de fatores de transcrição que foram expressos nas células ES com
confirmação ou suspeita de funções na manutenção do estado
pluripotente. Além disso, as células ES foram conhecidas por
induzirpluripotência em núcleos de células somáticas depois de fusões de
células induzidas por entre ES e células somáticas (Tada etal.,
2001). Equipado com esta informação, Yamanaka selecionou um conjunto de
24 fatores de transcrição celularde ES que ele considerou como candidatos
para restabelecer pluripotência em células somáticas.
Em uma experiência surpreendente, todos os 24 genes que codificam estes
fatores de transcrição foram introduzidos emum passo em fibroblastos da pele
e alguns deles realmente geraram colônias que mostraram umanotável
semelhança com células-tronco embrionárias. O número de genes capazes de
induzir tais colônias foram reduzidas, uma - a - uma, para identificar uma
combinação de apenas quatro fatores de transcrição (Myc, Oct3 / 4, Sox2e
Klf4) que foi suficiente para converter os fibroblastos embrionários de ratinho
para as células estaminais pluripotentes(Takahashi e Yamanaka, 2006) (Figura
3). As células-tronco pluripotentes, que Yamanaka chamou de células-tronco
pluripotentes induzidas (células iPS), apareceram com uma freqüência muito
baixa, mas poderiam ser selecionadas pela expressão de uma neomicina / lacZ
gene de fusão (βgeo) inseridos no locus no genoma Fbx15do rato a partir do
qual os fibroblastos foram obtidos. O promotor Fbx15 é ativo em células-
troncopluripotentes e a ativação da expressão de βgeo nas células estaminais
pluripotentes resulta em resistência a G418. As células iPS geraram vários
tipos celulares em ensaios de teratoma e contribuiram para a formação dos
tecidosquiméricos de ratos após a injeção em blastocistosde ratos. No entanto,
a linha de células iPS de transmissão de germes não foi alcançada no primeiro
estudo (Takahashi e Yamanaka, 2006). Porém, um ano depois, o grupo de
Yamanaka, emparalelo com Rudolph Jaenisch e grupos Konrad Hochedlinger,
desenvolveram um refinado sistema de seleção(Agora selecionando para
ativação, quer do Oct4 ou loci Nanog de genes), e os resultantes células iPS
mostraramna linha a transmissão de germes (Okita et al, 2007;. Wernig et al,
2007;.. Maherali et al, 2007). Em 2007, os laboratórios de Yamanaka e James
Thomson foram os primeiros a produzir células iPS humanas (Takahashiet al,
2007;. Yu et al, 2007). Nas experiências com células humanas iPS, Yamanaka
usou o fator quatro de combinação do papel 2006 (Myc, Oct4, Sox2 e Klf4),
enquanto Thomson usou um pouco da combinação de fatores de transcrição
diferentes (Lin28, Nanog, 04 de outubro e Sox2).
A descoberta de Yamanaka de células iPS representa uma descoberta
verdadeiramente fundamental, pois foi a primeira vez que uma célula
somática diferenciada intacta pode ser reprogramado para se tornar
pluripotente. A descoberta de Yamanakaabriu um campo de pesquisa
totalmente novo, e as iPS surpreendentemente simples são agora tecnologia
utilizada em um grande número de laboratórios de todo o mundo.
6
7. Figura 3 A partir de uma coleção de 24 diferentes fatores de transcrição (simbolizados
por tubos de ensaio), (1),Takahashi e Yamanaka (2006) demonstraram que um
conjunto de apenas quatro fatores de transcrição (Myc, Oct3 / 4, Sox2e Klf4) foi
suficiente para converter as culturas emembriões de rato ou fibroblastos adultos (2)
para se tornarem células pluripotentes capazes de produzir in vivo teratomas e
contribuirpara formar os ratos quiméricos (3). As células pluripotentes foramchamadas
células-tronco pluripotentes induzidas (células iPS).
Desenvolvimentos de reprogramação celular e seu uso na pesquisa
médica
Desde a descoberta inicial, a tecnologia tem sido melhorada de várias
formas. Por exemplo, os fatores de pluripotência podem agora ser entregues à
célula, sem a utilização de vectores retrovirais, os quais se integram
aleatoriamente no genoma e causam desregulação dos genes endógenos nas
proximidades que podem contribuir para a formação de tumores. A não
integração de vírus estabilizados,RNAs ou proteínas, bem como plasmídeos
epissomais, agora é usada para a integração - entrega gratuita dos genes
pluripotência. Em certostipos celulares menos de quatro fatores são
necessários para induzir pluripotência, no rato adulto, por exemplo, células-
tronco neurais requerem apenas Oct4 para indução de células iPS (Kim et al.,
2009). Do mesmo modo, em moléculas pequenas foi demonstrado certos
contextos celulares para substituir alguns dos fatores de pluripotência (Li et
ai., 2009). É importante notar que as células iPS satisfazem os critérios mais
rigorosos para pluripotência, pois elas são capazes de gerar todas as células
iPS de ratos em ensaios de complementação tetraplóides, isto é, quando as
células são introduzidastetraplóidemente com 8 células na fase de mórula
(Zhao et al, 2009.). Todas estas melhorias, com base na origemda descoberta
deYamanaka, foram passos importantes para tornar a tecnologia mais eficiente
e iPS ‘úteis.
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8. A descoberta de Yamanaka, demonstrou que mudanças dramáticas no estado
diferenciado, que é geralmente muito estável, podem ser conseguidas, também
tem inspirado os esforços de investigação para alterar o destino das células
semtramitava a um estado pluripotente. Experimentos de transdiferenciação
têm uma longa história quevolta para experiências de discos imaginais
de Drosophila, em 1960, seguindo-se a utilização de alguns únicos genes,
como Antennapedia, MyoD, GATA1 ou PAX5 para induzir interruptores de
destino celular. Em particular, oMyoD descoberta que pode transdiferenciar
10T1 / 2 fibroblastos de mioblastos (Davis et al., 1987) mostrou que os genes
que realizaram transdiferenciação poderia ser sistematicamente identificados.
Yamanaka tomou uma abordagem sistemática para definir um pequeno
conjunto de fatores de transcrição, em vez de um único fator, inspirou uma
recente onda de experimentos usando combinações de transdiferenciação e
fatores de transcrição. Por exemplo, as células exócrinas para converter
células endócrinas no pâncreas através da introdução de três fatores de
transcrição (Zhouet al., 2008). Do mesmo modo, pode ser cardiomiócitos
gerados a partir de fibroblastos in vitro através da introdução de três fatores de
transcrição diferentes (Ieda et al.,2010), e um comutador de destino
correspondente na célula foi recentemente realizado in vivo usando os mesmos
fatores (Song et al, 2012;.. Qian et al, 2012). Estes exemplos fornecem
evidência paratransdiferenciação dentro de uma camada germinativa, mas
eficientementetransdiferenciação entre camadas germinativas pode também
ser alcançada. A transdiferenciação de fibroblastos (mesoderma) para os
neurônios (ectoderme) (assimchamado em células) foi realizada por expressão
de fatores de transcrição em três (Panget al., 2011).
As células-tronco, incluindo as células iPS, pode, potencialmente, ser usadas
para substituir células doentes ou perdidas em desordem degenerativa ,
incluindo por exemplo, doença de Parkinson e na diabetes de tipo 1. Na
terapia celular com substituição poriPS as células podem permitir que o
enxerto autólogo de células que seria menos propenso a rejeição imunitária. O
melhor método para a geração de células iPS será importante para esses
esforços. No entanto, existe a possibilidadede que os procedimentos utilizados
atualmente para a reprogramação possam introduzir mutações genômicas ou
outras anomalias, que podem torná-los impróprios para a terapia celular. A
possibilidade de utilizar as células-troncopluripotentes, incluindo as células
ES, no transplante de células permanece um desafio para um número de
razões adicionais. Assim, embora esta seja uma área de pesquisa muito
interessante e promissora, o trabalho adicional é necessário para assegurar que
a utilização de células com origem em células estaminais pluripotentesseja
uma terapia segura para os pacientes.
Outra, mais iminente área, para uso médico é derivar células iPS de pacientes
com genética eoutras doenças e, em seguida, usar as células
8
9. iPSpara diferenciação in vitro para obter uma nova percepção noprocesso da
doença ou para a produção de células - para plataformas baseadas em testes de
toxicologia ou no desenvolvimento de drogas(Onder e Daley, 2012) (Figura
4). As células iPS foram produzidas a partir de um amplo espectro de doenças,
incluindo esclerose lateral amiotrófica (ELA), síndrome de Rett, atrofia
muscular espinhal (AME), α1 -antitripsina, hipercolesterolemia familiar e
armazenamento de glicogênio 1A. Paradoença cardiovascular, existem
atualmente modelos celulares para iPS Síndrome de Timothy, síndrome de
LEOPARD e a síndrome do QT longo, sendo do tipo 1 ou 2 (Onder e Daley,
2012). Em várias dessas células iPS - com base em modelos de doenças,
doenças com fenótipos relevantes são observadas. Por exemplo, a perda
progressiva de um neurônio automóvelé observado no modelo iPS para
SMA. Além disso, na síndrome de Rettcélulas específicas iPS mostraram
reduzida densidade da coluna após a diferenciação neuronal (Marchetto et al.,
2010). A hepatocíticadiferenciação de células iPS de α1 - antitripsinaem
pacientes com deficiência leva a acumulação elevada de lipídios e glicogênio
(Rashid et al., 2010). In vitro os modelos de células diferenciadas iPS também
pode imitar aspectos de doenças com manifestação tardia, tais como a doença
de Alzheimer (Israel et al., 2012), ataxia espinocerebelar (Kochet al., 2011) e
doença de Huntington (O HD iPSC Consortium, 2012). O progresso também
tem sido feito quando se trata de doenças de modelagem com a genética
complexa, tais como esquizofrenia (Brennand et al.,2011). No entanto,
existem também as doenças, para as quais pode ser difícil imitar com sucesso
a patologia nas células iPS advindas de células derivadas. Além disso, para
algumas doenças, na linhagem hematopoiética, estudos em protocolos de
diferenciação in vitro de células iPS são escassos, limitando o progresso nesta
área.
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10. Figura 4 As células diferenciadas podem ser obtidas a partir de um paciente com uma
doença específica e reprogramadas paratornar-se células iPS. As células resultantes iPS
podem então ser diferenciadas in vitro para vários destinos de células especializadas,
taiscomo neurônios, cardiomiócitos ou hepatócitos, e usadas para ganhar novas
percepções sobre o processo da doença ou como plataforma de uma célula para tentar
desenvolver terapias para novas doenças.
Células iPSutilizadas como base em células in vitro diferenciadas também são
cada vez mais utilizadas como plataformas de triagem para desenvolvimento e
validação de compostos terapêuticos. Em uma célula iPS - modelo baseado
em disautonomia familiar, um novo composto, cinetina, foi identificado, o que
poderia reverter parcialmente o aberrante splicing do gene IKBKAP que causa
a doença (Lee et al., 2009). Da mesma forma, a iPS pode ser usada em uma
Síndrome QT longa como modelo celular, beta-bloqueadores e bloqueadores
dos canais de íons mostraram-se eficazes na modulação do fenótipo (Itzhaki et
al., 2011). As células iPS são valiosas tornando-se assim novas ferramentas
para obter visões sobre os processos de doenças e são agora usadas para testar
e validar novas terapêuticas. Além disso, mesmo doenças com genética
complexa e de início tardio podem ser modeladascom sucesso por esta doença
" doença do prato ".
Em resumo, o conceito de que maduras, as células diferenciadas podem ser
reprogramadas a umestado de células-troncopluripotentes é um paradigma que
as descobertas estão mudando. Essa percepção tem influenciado
essencialmente todas as áreas de medicina ou fisiologia. As descobertas feitas
por John Gurdone YamanakaShinya claramente foramfundamentais e
introduziram um campo de pesquisa totalmente novo.
Jonas Frisen, UrbanLendahl e Thomas Perlmann
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