Recomendados
Recomendados
Más contenido relacionado
La actualidad más candente
La actualidad más candente (20)
Destacado
Similar a Jurnal ekstrasi dna ihwan
Similar a Jurnal ekstrasi dna ihwan (20)
Último
Último (20)
Jurnal ekstrasi dna ihwan
- 1. Ekstrasi Dna (Isolasi dan Elektroforesis DNA) Pada Buah Strowberry (Fragaria virginiana) Ihwan Fauzi Saputra Prodi Pendidikan Biologi, Fakultas Tarbiyah dan Keguruan, UIN Raden Fatah Palembang Jl. Prof. DR. Zainal Abidin Fikri Km 3,5 Palembang Email: Ihwanfauzi98@gmail.com Abstract The development of science and technology are very advanced in this time gave the big influence in the advancement of science one of which is the science of genetics, by using technology we can extract DNA by means of DNA isolation, DNA electrophoresis, and PCR. Penrcobaan this time aims to determine how or the process of DNA extraction with isolation of DNA, and using electrophoresis and PCR. On this DNA extraction experiment using fruit extracts strowberry and the results obtained clear solution and clot in the tube. The blob is the DNA of strawberries network. For the isolation of DNA from plant tissue, needed some specific chemical compounds. Such compounds include extraction buffer which serves to lyse the cell membrane, the SDS 20%. Whereas, in carrying out DNA electrophoresis, required TAE Buffer 10 x (400mm Tris acetate, 10 mM EDTA pH 8), Agarose, Loading Buffer, DNA Marker, and ethidium bromide which will color the DNA. Keywords: DNA extraction, DNA isolation, electrophoresis, fruit strowberry. Abstrak Perkembangan ilmu pengetahuan dan tekhnologi yang sangat maju pada saat ini telah meberikan andil yang cukup besar dalam kemajuan ilmu pengetahuan/ sains salah satunya adalah ilmu Genetika, dengan menggunakan tekhnologi kita dapat mengekstraksi DNA dengan cara isolasi DNA, Elektroforesis DNA, dan PCR. Penrcobaan kali ini bertujuan untukmengetahui bagaimana cara atau proses ektraksi DNA dengan car menisolasi, dan menggunakan cara elektroforesis dan PCR. Pada percoban ektraksi DNA ini mengunakan ektrak buah Strowberry dan didapatkan hasil larutan bening dan gumpalan di dalam tabung. Gumpalan tersebut merupakan DNA dari jaringan buah strawberry. Untuk melakukan isolasi DNA dari jaringan tumbuhan, diperlukan beberapa senyawa kimia tertentu.Senyawa-senyawa tersebut diantaranya bufferekstraksi yang berfungsi untuk melisiskan membran sel, SDS 20%. Sedangkan, dalam melaksanakan elektroforesis DNA, diperlukan Buffer TAE 10 x (400mM Tris asetat, 10 mM EDTA pH 8), Agarose, Loading Buffer, DNA Marker, dan Etidium Bromida yang akan mewarnai DNA. Kata Kunci : Ekstraksi DNA, Isolasi DNA, Elektroforesis, buah Strowberry. PENDAHULUAN Dewasa ini telah banyak dilakukan isolasi DNA yang bertujuan untuk mengembangkan ilmu pengetahuan terutama dalam ilmu Genetika. Isolasi DNA telah banyak dilakukan dan dikembangkan di dunia ilmiah karena teknologi- teknologi modern telah menjamah ilmu genetika. Isolasi DNA ini dapat dilakukan dengan cara dan bahan sederhana, hingga dengan teknologi modern. Mengenai hal ini, pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain organ manusia, darah, daun, daging buah, kalus, akar batang, daging dan sisik ikan. Namun, penggunaan tumbuhan sebagai sumber lebih banyak dilakukan dalam pengisolasian DNA dewasa ini. Pengisolasian DNA pada sumber dilakukan terutama untuk pengenalan DNA secara lebih jelas karena dari isolasi ini DNA dapat terpisah dari kumpulannya, yaitu kromosom. Setelah dilakukan isolasi, biasanya DNA akan dielektroforesis. Elektroforesis dilakukan untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengkarekterisasi dan purifikasi dari molekul DNA/RNA. Elektroforesis merupakan cara pengamatan DNA dengan bantuan sinar Ultra violet. Cara pemisahan dengan elektroforesis ini merupakan alat pendukung yang sangat pokok dalam teknologi DNA rekombinan, dengan aplikasi yang begitu luas baik untuk pemisahan untai tunggal atau untai ganda molekul DNA. Elektroforesis digunakan untuk pengamatan DNA dalam penampakan flouresensinya. Berdasarkan hal-hal tersebut diatas dan tak lepas dari tujuan peningkatan khazanah ilmu pengetahuan terutama dalam bidang ilmu Genetika, maka kami mengadakan praktikum isolasi hingga elektroforesis DNA. PROSEDUR KERJA Percobaan ekstraksi DNA ini dilaksanakan pada hari Selasa 27 Januari 2015, Pukul 08.00-12.00 WIB, di Laboratorium Genetika Fakultas Sains dan Tekhnologi, Universitas Islam Negeri (UIN) Maulana Malik Ibrahim Malang.
- 2. Alat dan Bahan Pada praktikum ini alat yang digunakan adalah: Gelas ukur 25 m, Panci/ waterbath, Penyaring santan, sendok, Pipet tetes , Tube 2 ml, dan Sentrifuge. Sedangkan bahan yang digunakam adalah Metil Spiritus, Buah Sroberi dan Pisang, Handsoap atau Detergaen (yang mengandung SDS, NaCl (garam), Gelas bening/ Beaker Glass, Pisau, dan Timbangan. A. Isolasi DNA 1) Siapkan spiritus dalam es/ freezer sampai sangat dingin 2) Kupas buah dan potong kecil, kemudian dimasukan kedalam beaker glass 250 ml 3) Campurkan 2 gram garam, 5 ml cairan pencuci dan 50 ml air menjadi satu kedalam beaker glass 500 ml, aduk dengan sendok makan hingga menyatu/ homogen (15 menit) 4) Masukan larutan garam dan cairan pencuci piring tersebut kedalam beaker glass 250 ml yang berisi potongan buah, biarkan selama 15 menit 5) Letakan beaker glass 250 ml yang berisi larutan garam, pencuci piring dan buah tersebut ke waterbath selama 15 menit 6) Saring campuran larutan tersebut kedalam beaker glass 25 ml isi sepertiga saja 7) Lakukan dengan hati-hati, tuangkan spiritusyang telah didinginkan tadi melalui belakang sendok teh sehingga sepiritus membentuk lapisan berwarna ungu diatas lapisan hijau, hentikan pengisian ketika ketinggian mencapai 2/5 gelas, kemudin amati 8) Anda akan melihat lapisan putih yang terbentuk antara lapisan hijau dan ungu, itulah DNA, kumpulkan DNA dengan ujung pipet tetes dan hisaplah DNA dari gelas, atau bisa menggunakan mikroopipet 1 ml dengan menghisap pada lapisan putih itu, dan masukan tube 1,5 ml 9) Purifikasi dengan menambahkan alkohol 70 % sebnyak 1 ml, kemudian sentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit, buang supernatan dan ulangi sebnayak 2 kali. 10) Rehidrasi pelet DNA dengan 200 mikroolit rehydrasi slutin kit/ buffer TE, dan simpan pada suhu dingin. B. Elektroforesis 1) Pembuatan gel agarosa a) Tentukan konsentrasi atau prosentasi agarosa yang dibutuhkan dan hal ini tergantung dari ukuran fragmen DNA yang dianalisis. Presentasi gel agarosa yang direkomendasikan adalah sebagai berikut: 0,5 % agarosa untuk fragmen DNA Berukuran 1.000-30.000 pb 0,7 % agarosa untuk fragmen DNA Berukuran 800-12.000 pb 1,5 % agarosa untuk fragmen DNA Berukuran 200-3.000 pb 2,0 % agarosa untuk fragmen DNA Berukuran 50-2.000 pb b) Temptkan agarosa yang telah ditimbang kedalam erlenmeyer dan isi dengan sejumlah larutan 1x buffer TAE, kemudian kocok sampai merata c) Panaskan dalam microwave atau hotplate sampai mendidih dan larutkan agarosa kira- kira sampai 60o C d) Setelah itu larutan dituang kedalam cetakan dan pasang sisir,tunggu kurang lebih dai 30 menit atau sampai gel mengeras, lepaskan sisir secara perlahan-lahan dan gel agarosa siap digunakan untuk elektroforsis. 2) Proses Elektroforesis a) Letakan cetakan yang berisisi gel agarosa didalam bak elektroforesis dan tuang larutan 1x buffer TAE kedalam bak tersebut hingga sekitar 1 mm diatas permukaan gel b) Ambil sampel dengan mikropipet sekitar 8 µl. Letakan sampel diatas parafilm atau plastic cling wrap dan tambahan loading dye buffer sebanyak 2 µl kemudian gunakan mikropipet untuk mencampur hingga rata. Ambil larutan tersebut dengan mikropipet dan masukan kedalam sumur pada gel agarosa. c) Setelah sempel dimasukan dalam sumur, tutup bak elektroforesis dan hubungkan aparatus listrik (hati-hati tegangan listrik cukup tinggi). Setelah itu proses elektroforesis siap dijalakan d) Lamanya elektroforesis tergantung presentase gel agarose, tegangan arus listrik, dan ukuran molekul DNA. Sebagai gambaran proses elektroforsis untuk tegangan listrik 100 volt. Ukuran fragmen DNA yang dianalisis 50-2000 pasang basa maka proses elektroforesis memerlukan waktu sekitar 30 menit e) Setelah proses elektroforesis selesai, matikan arus listrik dan ambil cetakan berisi gel dengn menggunakan sarung tangan. 3) Pewarnaan dan pengamatan a) Letakan gel pada wadah yang berisi larutan etidium bromida. Direndam selama 15 menit. (hati-hati karena etidium bromida bersifat karsinogenik). b) Gel yang telah direndam dipindahkan kedalam “Gel Doc” atau UV
- 3. transiluminator dan jika pita/band molekul DNA keliatan terang maka ambil dokumentasikan melalui komputer yang terinstal dengan “Gel Doc” atau menggunakan kamera Palaroid jika menngunakn UV transiluminator. HASIL DAN PEMBAHASAN 1. Hasil No Gambar Urutan Proses Isolasi DNA Foto Hasil Pengamatan 1 Isolasi DNA buah strawberry 0,1 mL Warna larutan merah pekat (merah darah) Strawberry pekat larutannyah, belum terbentuk endapan, butiran kasar masih tersebar di sekitar larutan. 2 Setelah diinkubasi dalam penangas air suhu 60˚C selama 20 menit Warna larutan merah muda Belum terlihat adanya endapan, hanya butiran halus yang tersuspensi. 3 Setelah disimpan dalam wadah es selama 10 menit Warna larutan >> merah pucat Tidak ada endapan
- 4. 4 Setelah di sentrifuge dengan kecepatan 14000 rpm selama 10 menit Warna larutan pink pudar Terbentuk endapan 5 Setelah sentrifuge kedua dengan kecepatan 14000rpm selama 10 menit. Warna larutan pink pudar Warna larutan bening dan tidak ada endapan 6 Setelah ditambahkan alkohol 00% sebanyak 2x volume total sampel. Larutan bening DNA 1. Pembahasan Isolasi DNA Isolasi DNA pada dasarnya dapat dilakukan dengan merusak dinding dan membrane sel dan juga membrane inti. Berdasarkan hasil pengamatan, larutan yang berisi strawberry dan buffer berwarna merah sesuai dengan warna buah strawberry. Penambahan buffer ekstraksi ini berfungsi untuk melisiskan membran sel. Dan penambahan SDS 20% bertujuan untuk melisiskan dinding sel dan mendenaturasi protein sehingga DNA pada jaringan buah strawberry dapat diisolasi. Larutan dalam tabung tersebut dihomogenkan dengan menggunakan vorteks. Kemudian diinkubasi sehingga menghasilkan perubahan warna larutan. Penginkubasian sampel dalam waterbath bersuhu 65oC selama 20 menit ini dilakukan untuk mengoptimalikan kerja buffer ekstrak. Langkah selanjutnya adalah penambahan Potassium asetat yang bertujuan untuk membentuk senyawa kompleks CTAB-Potassium asetat-protein-debris sel. Yang kemudian dilanjutkan dengan sentrifugasi yang bertujuan untuk memisahkan debris dan komponen sel lain yang menjadi pengotor dengan DNA. Proses ini menghasilkan larutan dengan dua fasa,yakni fasa atas dan endapan.Kemudian,setelah fasa atas di ambil dan dipindahkan ke dalam tabung
- 5. baru, ditambahkan Phenol:Chloroform:Isola myl Alkohol (PCI) yang dilakukan untuk mengekstraksi DNA dari kontaminan. Fenol merupakan pelarut organik yang dapat melarutkan protein, lipid dan molekul lain seperti polisakarida, yang diharapkan akan didapatkan supernatan yang berisi DNA bebas kontaminan. Kloroform berfungsi sebagai pendenaturasi protein,tetapi DNA dan RNA tidak terdenaturasi karena tidak larut didalam pelarut organik seperti kloroform. Kemudian dilakukan penambahan alkohol sebagai presipitasi DNA setelah dilakukan sentrifugasi dan pemindahan fasa. Penambahan alkohol ini berfungsisebagaipenghilang kloroform. Sebab apabila kloroform masih berada di dalam sampel maka dikhawatirkan akan menghambat kerja enzim-enzim restriksi atau enzim lain yang digunakan untuk analisis molekuler. Dihasilkanlah larutan bening dan gumpalan di dalam tabung. Gumpalan tersebut merupakan DNA dari jaringan buah strawberry. 2. Pembahasan Elektroforesis DNA Pada praktikum elektroforesis ini, sampel diambil dari sampel molekul DNA yang telah dilarutkan dalam TE sebanyak 30 mikroliter dan telah disimpan pada suhu 4˚C selama 24 jam. Lalu penambahan Loading dye ke dalam sampel dengan perbandingan 5 bagian sampel DNA dan 2 bagian loading dye. Dalam proses elektroforesis, sampel molekul DNA ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga,kemudian dialirkan listrik dengan kutub yang terpisah satu sisi dengan sisi lainnya. Molekul- molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk linear dan bermuatan negatif pada sisi luarnya sehingga pada saat dielektroforesis akan menuju ke kutub positif secara seragam. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dideteksi. Dalam praktikum ini kami menggunakan Etidium bromida sebagai zat pewarnanya,. Etium bromida akan berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan akan memberikan warna orange fluoresance yang dapat dilihat di bawah sinar ultraviolet. Ketika dilihat di bawah sinar ultraviolet akan terlihat pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari sumur gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang berarti bahwa molekul- molekul tersebut berukuran sama. Penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng- elektroforesis penanda tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marker tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untukmenentukan ukurannya.Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul. Dalam Hasil pengamatan terlihat bahwa terdapat fragmen DNA yang terlihat terurai dan tidak terurai. Semakin sedikit DNA yang terurai, maka semakin baik hasil elektroforesis DNA nya. Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Elektroforesis ter bagi atas dua yaitu: Elektroforesis kertas yaitu jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut. Elektroforesis gel yaitu elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis geldilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media. KESIMPULAN Untuk melakukan isolasi DNA dari jaringan tumbuhan, diperlukan beberapa senyawa kimia tertentu. Senyawa-senyawa tersebut diantaranya buffer ekstraksi yang berfungsi untuk
- 6. melisiskan membran sel, SDS 20% yang berfungsi untuk melisiskan dinding sel dan mendenaturasi protein, Potassium asetat yang bertujuan untuk membentuk senyawa kompleks CTAB-Potassium asetat-protein-debris sel, Phenol: Chloroform:Isolamyl Alkohol (PCI) yang berfungsi untuk mengekstraksi DNA dari kontaminan, Fenol yang berfungsi untukmendapatkan supernatan yang berisi DNA bebas kontaminan, Kloroform yang berfungsi sebagai pendenaturasi protein kecuali DNA dan RNA, dan alkohol yang berfungsisebagai penghilang kloroform. Sedangkan, dalam melaksanakan elektroforesis DNA, diperlukan Buffer TAE 10 x (400mM Tris asetat,10 mM EDTA pH 8), Agarose, Loading Buffer, DNA Marker, dan Etidium Bromida yang akan mewarnai DNA. DAFTAR PUSTAKA Albert, B., 1994. Biologi MolekulerSel Edisi Kedua.PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta. Asris., 2010. Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi DNA.http://asris07. Student.ipb.ac.id. Diakses pada tanggal 17 Maret 2015, pada pukul 23.00 WIB. Elrod, S., 2007. Genetika Edisi Keempat. Erlangga. Jakarta. Kirsman, 2010.Isolasi DNA Buah. http://kirsman83.weebl..com. Diakses pada tanggal 17 Maret 2015, pada pukul 23.00 WIB. Rachmat, 2012. Isolasi DNA. http://rachmatyusuf.blogspot.com.Diakses pada tanggal17 Maret 2015, pada pukul 23.00 WIB. Suryo, 2004. Genetika Strata 1. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta. Dwidjoseputro. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan. Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha Muda dan USESE Foundation. Tohib, 2012. Macam Metode Isolasi DNA. http://www.tohib.web.id. Diakses pada tangga17 Maret 2015, pada pukul 23.00 WIB.