O documento descreve o teste de fixação do complemento, um método usado para detectar anticorpos ou antígenos em amostras utilizando o sistema complemento. O teste baseia-se na ligação do complemento ao complexo antígeno-anticorpo, levando à lise de hemácias e liberação de hemoglobina em amostras positivas. Também é descrito o teste de inibição da fixação do complemento, que detecta antígenos ao inibir a ligação do anticorpo às hemácias.

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICSDEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045 FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO Trabalho realizado pela Acadêmica de Ciências Biológicas da UCSal Paula Braga Daltro sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Claudia Brodskyn e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.

2. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

4. O sistema complemento é um conjunto de proteínas séricas que tem por função ajudar na eliminação de microorganismos invasores. Este sistema funciona em cascata e possui três vias. O teste de fixação do complemento tem como base a via clássica, onde o complemento liga-se ao sítio ativo formado pelo complexo antígeno-anticorpo.

6. A ativação do sistema complemento por anticorpos ligados a antígenos resulta na formação de complexos de ataque a membrana que podem romper a membrana celular. Se o anticorpo é ligado a antígenos adsorvidos nas hemácias, estas são destruídas e ocorre hemólise.

8. Função: ligar covalentemente a moléculas específicas na superfície de microorganismos invasores, ou em complexos Ag-Ac.

9. Objetivo: induzir desequilíbrio osmótico e/ou apoptose em microorganismos invasores ou células tumorais.

11. Complexo de ataque a membrana: Ao unir-se à membrana microbiana ou ao complexo Ac-Ag, o complemento forma um canal transmembrânico de forma anelar, causando uma lise osmótica, induzindo apoptose e, conseqüentemente, a morte da célula.Complexo de ataque à membrana Influxo de fluidos Bicamada fosfolipídica Citoplasma

13. Soro teste

14. Sistema Complemento

15. Sistema hemolítico (hemácias recobertas com antígenos)

16. Estufa para incubação

17. Centrífuga

20. Probabilidades para falso-negativos devido a:

21. Perda da atividade do complemento.

22. Diluições inadequadas.

23. Contaminação em soluções (gerando efeito anticomplementar).

24. Sensibilização insuficiente de hemácias.

25. Probabilidades para falso-positivos devido a:

26. Hemácias fragilizadas (velhas).

27. Soro não-inativado.

28. Baixa especificidade (dependendo do antígeno adsorvido na hemácia).

29. VANTAGENS:

30. Baixo custo.

31. Boa especificidade.

33. FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO O soro do paciente é incubado para a inativação do complemento provavelmente existente, para não causar interferência no teste. 2) O soro inativado é incubado com hemácias (ou outras células) que contêm o Ag específico para os Acs pesquisados adsorvido em sua membrana. O Ac pesquisado, caso presente na amostra, se ligará ao Ag da superfície das células. 3) O complemento é inserido para identificar a presença ou não do complexo Ag/Ac. Em caso positivo, as proteínas do sistema complemento se ligarão à porção Fc dos Acs, iniciando uma cascata de reações que culminará com a lise das hemácias, liberando hemogoblina. Y Sistema Complemento Y Y Ac do soro 4) Após centrifugação, o que se observa é uma solução vermelho-amarronzada homogênea, devido a liberação de hemoglobina das hemácias. Sistema Hemolítico (hemácias recobertas com Ag específico) Y

35. No caso de não haver anticorpo específico para o antígeno pesquisado, não ocorre hemólise e nem liberação de material intracelular (hemoglobina) (teste negativo). Portanto, após a centrifugação dos tubos, será observada a presença de um precipitado avermelhado no fundo dos mesmos, o qual corresponde às hemácias não lisadas.

36. No caso de encontrar o complexo Ag/Ac, o complemento é ativado e leva a lise das hemácias, com liberação de material intracelular (hemoglobina) (teste positivo).Resultado negativo Resultado positivo

37. FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO Resultado Negativo Resultado Positivo

38. FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO

39. INIBIÇÃO DA FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO

40. INIBIÇÃO DA FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO O soro do paciente é incubado para a inativação do complemento provavelmente existente, para não causar interferência no teste. 2) O soro inativado é incubado com anticorpo monoclonal dirigido para o antígeno pesquisado. No caso de haver o antígeno pesquisado na amostra, os sítios de ligação do anticorpo monoclonal ficarão ocupados. 3) A solução de soro-Ac monoclonal é então incubada com Sistema Hemolítico e com o Sistema Complemento. Caso os Acs monoclonais estejam previamente ligados aos Ags da amostra, eles não se ligarão com os Ags na membrana da hemácia, não havendo hemólise e nem liberação de material intracelular (hemoglobina). Sistema Complemento Y Y Ac monoclonal Ag do soro 5) Portanto, após centrifugação, o que se observa é um precipitado avermelhado no fundo do tubo (resultado positivo). Sistema Hemolítico (hemácias recobertas com Ag específico) Y

42. No caso de não haver o antígeno pesquisado na amostra, o anticorpo monoclonal ficará com seus sítios de ligação livres, podendo se ligar ao antígeno adsorvido na membrana das hemácias, ativando o complemento e causando hemólise com liberação de material intracelular (hemoglobina) (teste negativo).

43. No caso de haver o antígeno pesquisado na amostra, os sítios de ligação do anticorpo monoclonal ficarão ocupados, o que inibirá a sua ligação com os antígenos na membrana da hemácia, não havendo hemólise e nem liberação de material intracelular (hemoglobina) (teste positivo).Resultado negativo Resultado positivo

45. Imunoensaios: Fundamentos e Aplicações. Vaz, Adelaide J.; Takei, Kioko; Bueno, Ednéia C. Editora Guanabara Koogan

46. Imunologia Celular e Molecular 5ª ed. Abbas, Abul K.