2. ISOLASI DNA
• Tujuan : Melakukan Isolasi DNA
• Alat dan Bahan :
Tabung Eppendorf (1,5 ml)
Sampel (Whatman Paper Blood)
Saponin 0,5 % + 1 x PBS
Sentrifus
Chelex – 100 20 %
dd H2O
3. ISOLASI DNA (lanjutan)
• Cara Kerja :
1. Siapkan tabung Eppendorf ukuran 1,5 ml dan
raknya.
2. Masukkan sampel (Whatman paper blood)
3. Tambahkan Saponin 0,5 % + 1 X PBS 1 ml
(1000µl)
Kemudian di inkubasi 4 jam atau 24 jam (overnight)
4. ISOLASI DNA (lanjutan)
• Setelah inkubasi
Sentrifus 10 menit (12.000 rpm)
Ambil presipitat secara hati-hati
Tambahkan 1ml=1000µl di ulang sentrifus
(5 menit) 12.000 rpm
Ambil presipitat tambahkan 100µl ddH2O + 50µl
20 % Chelex-100
Boiling 10 menit (Vertex tiap 5 menit)
Sentrifus (12.000 rpm)
Ambil supernatan (mengandung DNA)
Kemudian simpan pada suhu 4ºC atau - 20ºC
Dilanjutkan ke PCR
5. KEGIATAN ISOLASI DNA
Memotong Whatman
Paper Blood (P falciparum)
dimasukkan ke tabung
Eppendorf
6. ISOLASI DNA (lanjutan)
LEMARI INKUBASI - 20ºC SAPONIN 0,5% 1XPBS
MASUKKAN SAPONIN 0,5%
1XPBS KE SAMPEL MELAKUKAN VORTEX
8. PCR (Polymerase Chain Reaction)
• Tujuan : Untuk mengamplifikasi DNA
• Alat & Bahan :
Tabung Eppendorf 0,2 ml = 200 µl Larutan TAE
Rak tabung, Pipet MgCl2
Alat PCR dNTP
Alat Elektroforesis + Agarosse 2 %
Primer (Forward
Timbangan Agarrosse
dan Reverse)
Alat Pemanas (Microwave) sesuai dengan
Sarung Tangan ( anti panas) tujuan (misal: genus
Ethidium Bromida atau spesies)
dd H2O
Tag-Polymerase
Buffer PCR (Kappa)
Sampel (Template)
12. ELEKTROFORESIS
• Alat & Bahan:
Siapkan Alat cetakan Agarosse 2 %
Timbang Agarosse 2 % sebanyak 1 gram
Masukkan ke dalam tabung Erlenmeyer
Siapkan gelas ukur dan ukur cairan TAE 50 ml
Campurkan TAE ke Agarosse 2 %
Tutup tabung Erlenmeyer dengan plastik dan dilubangi
kecil-kecil (pori-pori)
Panaskan (dengan Microwave 1 menit)
Tambahkan E-Bromida 5 µgr/ml (= 5 µl)
Homogenkan, kemudian di panaskan kembali (Microwave)
10 detik
Tuangkan Agarosse 2 % ke wadah cetakan yang telah
disiapkan, tunggu mengeras (± 30 menit)
14. ELEKTROFORESIS (lanjutan)
Ambil sampel DNA sebanyak 0,8 µl secara hati-hati
dengan menggunakan pipet
Tanamkan sampel DNA tersebut kedalam sumur
(well) chamber elektroforesis dan Markernya
(diujung)
Setelah selesai welling, tutup Alat Elektroforesis
Sambungkan dengan Arus Listrik (± 80 Volt)
selama 1 jam
Angkat Agarosse dari Alat Elektroforesis
Visualisasikan hasil tersebut dengan sinar
Ultraviolet (UV)
Lihat hasil PCR (Pita DNA)/band pada layar
monitor dan di print hasilnya
Contoh : (Gambar terlampir)
17. SEKUENSING
• Tujuan : Untuk mengetahui urutan
basa, sehingga dapat mengetahui ada mutasi &
konfirmasi hasil amplifikasi yang telah di kerjakan
(PCR)
• Tahap Sekuensing :
1. Produk PCR
2. Purifikasi
3. Cycle Sequensing
4. Presipitasi
18. PURIFIKASI
Siapkan Tube mini Columns
Campurkan sampel DNA dengan Mem – BS
(perbandingan 1 : 1) (misal: sampel DNA = 20 µl
MBS = 20 µl)
Inkubasi 1 menit
Sentrifus selama 1 menit (12.000 rpm)
19. PURIFIKASI
Setelah sentrifus, endapan di luar membran tabung dibuang
+ 700 µl Membran Wash Solution (MWS) dan sentrifus 12.000 rpm
(1 menit)
Buang sisa zat diluar tabung columns, kmd tambahkan 500 µl
MWS, centrifus 12.000 rpm (1 menit)
Zat sisa diluar membran tabung columns dibuang
Ambil supernatan (tanpa MWS) disentrifus lagi 12.000 rpm (1 menit)
Supernatan diambil masukkan ke tabung Eppendorf ukuran 1,5 µl
Tambahkan 30 µl Nuclease free water (NFW)
Tambahkan 20 µl Nuclease free water (NFW) (Total 50 µl Nuclease
free water (NFW))
Fungsi NFW untuk meloloskan DNA dari membran tabung column ke
tabung Eppendorf
20. PURIFIKASI (lanjutan)
• Inkubasi selama 2 menit
• Sentrifus lagi 12.000 rpm (1 menit)
• Selesai tahap purifikasi
• Endapan di tabung columns dibuang
• 50 µl cairan di tabung Eppendorf diambil
(DNA)
• Selanjutnya ke tahap Cycle Sequencing
(Tetapi harus diukur dulu kadar konsentrasi
dan kemurnian dari sampel DNA tersebut)
21. PURIFIKASI (lanjutan)
Mengukur kadar konsenterasi dan kemurnian
dengan alat Nandrops.
Tera dulu dengan 1 µl ddH2O
misalnya : Sampel A (DNA) 50 µl
1 µl sampel hasil konsentrasi = 24,2 ng/µlDNA
(artinya: dalam 1 µl sampel mengandung
konsentrasi = 24,2 ng/µlDNA, 50 µl X 24,2
ng/µl = 1200 ng/ µlDNA)
Sampel A – 260 = 0,782
A – 280 = 0,418
22. PURIFIKASI (lanjutan)
Kemurnian 260/280 = 1,87
Panjang gelombang 260
Panjang gelombang 280
DNA dinyatakan murni bila = 1,8 – 2
23. DNA Purifikasi “ PROMEGA”
New tube (mini column)
PCR Product : memb.Bind.Solution (1:1)
Incubate 1’ at room temperature (25oC)
12.000 rpm 1’
Discard the solution (put mini column back)
Add 700 µl membrane wash solution
12.000 rpm 1’
24. DNA Purifikasi “ PROMEGA”(lanjutan)
Discard supernatant
Add 500 µl membrane wash solution
12.000 rpm 1’
Discard supernatant, 12.000 rpm 1’
Transfer 1,5 µl tube
30 nuclease free water
So nuclease free water
Incubate 2’ , 12.000 rpm: 1’
25. TAHAP CYCLE SEQUENCING
Tabung sampel DNA ukuran 0,5 µl (dilabel)
Formulasinya :
1. Sampel sesuai perhitungan
2. ddH2O sesuai perhitungan
3. Primer 4 piccomol (biasa 1 µl)
4. Bigdye (biasa 6 µl)
Biasanya : total volume = 15 µl
Kemudian ke tahap PCR untuk Cycle Sequencing
26. TAHAP CYCLE SEQUENCING(lanjutan)
Setting Alat PCR (Cycle Sequencing)
Pre – PCR Cycle Sequencing
96ºC 96ºC 50ºC 60ºC 4ºC
3 menit 10 detik 5 detik 4 menit ~
1 X Cycle 25 X Cycle
Ket :
Suhu 96ºC : Denaturasi
Suhu 50ºC : Anealing (penempelan primer)
Suhu 60ºC : Elongation (perpanjangan urutan basa)
Selanjutnya ketahap presipitasi
27. “Precipitation Method”
Sample
Spindown & move 1,5 µl tube (wrap in alufo)
Add 1,5 µl of 125 mm EDTA
Add 1,5 µl of 3 m Sodium Acetate
Add 37,5 µl of 100 % ETOH (mix by invert 4x)
Incubate in room temperature ± 15’
Spin in refrigerator centrifuge (4 oC : 12.000 rpm; 20’)
28. Precipitation Method (lanjutan)
Aspirate solution
Add 250 µl of 70 % ETOH
Spin in refrigerator centrifuge (4 oC : 12.000 rpm; 20’)
Aspirate solution
Dry it using speed vac ± 15’
Cover the tube with alufo
Store at 4 oC
30. HASIL SEQUENCING
KONFIRMASI KE GEN BANK NCBI
DICOCOKKAN APAKAH BENAR YG DIBACA
SESUAI GEN YG DIPERIKSA
URUTAN WARNA:
T : MERAH
C: BIRU
G: HITAM
A: HIJAU
TINGGI RENDAHNYA GELOMBANG TGT
KONSENTRASI SAAT TERBACA OLEH ALAT
SEKUENSING.