Ανασυνδυασμένο DNA, Περιοιστικές ενδονουκλεάσες, Γονιδιωματική βιλιοθήκη, cDNA βιβλιοθήκη, Γενετική Μηχανική

1. Κεφάλαιο 4:
ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ
ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA

2. Γενετική Μηχανική
 Το σύνολο των τεχνικών με τις οποίες ο
άνθρωπος επεμβαίνει στο γενετικό υλικό των
οργανισμών.
 Εξυπηρετεί:
◦ Τη διερεύνηση και κατανόηση των μηχανισμών της
ζωής, αλλά και των μηχανισμών δημιουργίας και
εξέλιξής της.
◦ Τη βελτίωση της υγείας και των συνθηκών διαβίωσης
με εφαρμογές στην ιατρική, στη γεωργία και στην
κτηνοτροφία.

3. Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA
 Το σύνολο των τεχνικών με τις οποίες γίνεται μεταφορά
γενετικού υλικού από έναν οργανισμό σε άλλον.
 Εφαρμογές:
◦ Στην απομόνωση μίας συγκεκριμένης αλληλουχίας από το γονιδίωμα
ενός οργανισμού-δότη,
◦ Στην Ιατρική κατά τη γονιδιακή θεραπεία και την παραγωγή
φαρμακευτικών πρωτεϊνών από γενετικά τροποποιημένα βακτήρια
ή ζώα.
◦ Στη γεωργία και στην κτηνοτροφία (μεταφορά επιθυμητών γονιδίων σε
φυτά ή ζώα, με σκοπό τη δημιουργία γενετικά τροποποιημένων
οργανισμών με επιθυμητές ιδιότητες).
 Στην ανάπτυξη της συνέβαλαν:
◦ Η απομόνωση μορίων DNA που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη
μεταφορά γενετικού υλικού από έναν οργανισμό σε έναν άλλο
(φορείς).
◦ Η απομόνωση των περιοριστικών ενδονουκλεασών, δηλαδή
ενζύμων που κόβουν το DNA.

4. Φορέας κλωνοποίησης
 Μόριο DNA, συνήθως πλασμίδιο ή DNA φάγων (π.χ. το DNA
βακτηριοφάγου λ), το οποίο αυτοδιπλασιάζεται ανεξάρτητα μέσα
σε ένα κύτταρο ξενιστή.
 Τα πλασμίδια ενσωματώνουν τμήματα DNA μήκους περίπου
30kb, ενώ οι φάγοι τμήματα μήκους μέχρι και 100kb.
 Ανασυνδυασμένο μόριο DNA: κατασκευάζεται στο εργαστήριο
από τη συνένωση δύο ή περισσοτέρων τμημάτων DNA
διαφορετικής προέλευσης.

5. Ανακάλυψη περιοριστικών ενδονουκλεασών
Werner Arber Daniel Nathans Hamilton O. Smith
Το όνομα των περιοριστικών
ενζύμων προέρχεται από
τον οργανισμό από τον
οποίο απομονώθηκαν :
EcoRI = το 1ο περ. ένζυμο
που βρέθηκε στην E. coli

6. Περιοριστικές ενδονουκλεάσες
 Είναι ένζυμα που παράγονται από
βακτήρια.
 Ο φυσιολογικός ρόλος είναι η
προστασία του βακτηριακού κυττάρου
από την εισβολή «ξένου» DNA.
 Αναγνωρίζουν συγκεκριμένες
αλληλουχίες δίκλωνου DNA μήκους 4-8
ζευγών βάσεων και διασπούν των
φωσφοδιεστερικούς δεσμούς μεταξύ
συγκεκριμένων νουκλεοτιδίων.
 Συνήθως δημιουργούν μονόκλωνα
άκρα από αζευγάρωτες βάσεις στα
κομμένα άκρα.

8. Ενδονουκλεάση ΕcoRI
 Παράγεται από το βακτήριο E.coli
 Αναγνωρίζει την αλληλουχία
5’-GAATTC-3’
 στο δίκλωνο DNA διασπά το φ.δ. μεταξύ G-A
στους δύο κλώνους με κατεύθυνση 5’3’
δημιουργώντας μονόκλωνα άκρα από
αζευγάρωτες βάσεις.

10.  Δύο τμήματα DNA που
έχουν κοπεί με την ίδια
περιοριστική
ενδονουκλεάση, μπορούν
να συνδεθούν λόγω
συμπληρωματικότητας των
άκρων τους, με τη δράση
του ενζύμου DNA
δεσμάση.
 Πόσες φορές φέρει την
αλληλουχία αναγνώρισης
της περιοριστικής
ενδονουκλεάσης ο
ανασυνδυασμένος φορέας;

11. Τα πλασμίδια είναι άριστοι φορείς κλωνοποίησης
 Διαθέτουν θέσεις αναγνώρισης για διάφορες περιοριστικές
ενδονουκλεάσες.
 Είναι δυνατό με σχετική ευκολία να εισαχθούν σε κάποιο
κύτταρο-ξενιστή (μετασχηματισμός).
 Αυτοδιπλασιάζεται ανεξάρτητα μέσα σε ένα κύτταρο-ξενιστή.
Κάθε βακτήριο που προσλαμβάνει ανασυνδυασμένο πλασμίδιο
πολλαπλασιάζεται δίνοντας πολλά όμοια κύτταρα, σε καθένα
από τα οποία υπάρχουν πολλά αντίγραφα του
ανασυνδυασμένου DNA.
 Διαθέτουν γονίδια ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά, επιτρέποντας
την επιλογή μόνο των ανασυνδυασμένων βακτηρίων.
 Αποτελούν συνηθέστερο φορέα για οργανισμούς με μικρό
γονιδίωμα, ενώ για οργανισμούς με μεγαλύτερο γονιδίωμα
χρησιμοποιείται ο βακτηριοφάγος λ.

12. Στάδια κλωνοποίησης
 Το DNA που πρόκειται να κλωνοποιηθεί
συνδέεται σε φορέα κλωνοποίησης.
 Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο εισάγεται
τεχνητά σ’ ένα βακτήριο – ξενιστή
(μετασχηματισμός).
 Καλλιέργεια βακτηρίων.
 Το πλασμίδιο αντιγράφεται ανεξάρτητα από
το κύριο DNA του βακτηρίου.
 Το βακτήριο διαιρείται, ενώ ταυτόχρονα, σε
κάθε βακτήριο, το πλασμίδιο συνεχίζει να
αντιγράφεται ανεξάρτητα από το κύριο DNA
του βακτηρίου.
 Δημιουργούνται πολλά αντίγραφα της
αλληλουχίας DNA του δότη (κλωνοποίηση)

13. Βακτήριο
Βακτηριακό
DNA
Πλασμίδιο
2
1
3
4
Το γονίδιο εισάγεται
στο βακτήριο
Κύτταρο που περιέχει
το επιθυμητό γονίδιο
Ανασυνδυασμένο
πλασμίδιο
Επιθυμητό
γονίδιο
Το πλασμίδιο εισάγεται
στο βακτηριακό κύτταρο
DNA του οργανισμού
δότη
Μετασχηματισμένο
βακτήριο
Ανάπτυξη κυττάρου-ξενιστή σε καλλιέργεια
για να σχηματιστεί κλώνος κυττάρων
που περιέχουν το επιθυμητό γονίδιο
Επιθυμητό
γονίδιο
Πρωτεΐνη από την έκφραση
του επιθυμητού γονιδίου
Αντίγραφα γονιδίου
Βασική έρευνα
Και
εφαρμογές
Βασική
έρευνα στην
πρωτεΐνη
Βασική
έρευνα
στο γονίδιο
Γονίδια
Ανθεκτικότητας σε
έντομα
Γονίδια για μετασχη-
ματισμό βακτηρίων που
χρησιμοποιούνται στον
καθαρισμό τοξικών
αποβλήτων
Πρωτεΐνη για τη
διάλυση θρόμβων
στη θεραπεία της
καρδιακής προσβολής
Ανθρώπινη αυξητική
ορμόνη αντιμετωπίζει
την καχεκτική ανάπτυξη
Σύνοψη σταδίων κλωνοποίησης γονιδίων και εφαρμογές αυτής

14. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)
 Πολλαπλασιάζονται επιλεκτικά, εκατομμύρια φορές, συγκεκριμένες
αλληλoυχίες DNA, από ένα σύνθετο μείγμα μορίων DNA χωρίς τη
μεσολάβηση ζωντανού κυττάρου.
 Από το σύνολο του χρωμοσωμικού DNA ενός οργανισμού
πολλαπλασιάζεται κάθε φορά μόνο το επιθυμητό τμήμα DNA (π.χ.
ένα συγκεκριμένο γονίδιο).
 In vitro διαδικασία που μιμείται την αντιγραφή που
πραγματοποιείται σε ζωντανά κύτταρα.
 Εφαρμογές:
◦ στην Ιατρική, για τη διάγνωση ασθενειών όπως το AIDS.
◦ στην Εγκληματολογία, για τη διαλεύκανση υποθέσεων.
◦ στην Παλαιοντολογία, για τη μελέτη του DNA απολιθωμάτων.

15. 9-15
Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display.
Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR)
Το DNA αποδιατάσσεται με θέρμανση και οι
συμπληρωματικές αλυσίδες του δίκλωνου μορίου αποχωρίζονται.
C T T G A T CGC
3’5’
G ATCAA GCG
3’ 5’

16. 9-16
Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display.
Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR)
Το DNA αποδιατάσσεται με θέρμανση και οι
συμπληρωματικές αλυσίδες του δίκλωνου μορίου αποχωρίζονται.
C T T G A T CGC
3’5’
G ATCAA GCG
3’ 5’

17. 9-17
Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display.
Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης(PCR)
C T T G A T CGC
3’5’
G ATCAA GCG
3’ 5’
Κάθε DNA εκκινητήρας υβριδοποιείται και συνδέεται
με την συμπληρωματική αλληλουχία στην αλυσίδα DNA
C T T
GCG
5’
5’
3’
3’

18. 9-18
Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display.
Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR)
Η Taq πολυμεράση συνθέτει μία νέα αλυσίδα DNA
συμπληρωματική με την αλυσίδα εκμαγείο επιμηκύοντας την
αλληλουχία του εκκινητήρα.
C T T G A T CGC
3’5’
G ATCAA GCG
3’ 5’
C T T
GCG
5’
5’
3’
C G CG A T
G A A C T A
3’

19.  Το δίκλωνο τμήμα DNA που απομονώθηκε από έναν
οργανισμό αποδιατάσσεται με θέρμανση στους 95οC.
 Ψύξη στους 55-60οC και προσθήκη εκκινητήρων, που
υβριδοποιούν τα άκρα των μονόκλωνων αλυσίδων
 Τα τμήματα που σχηματίστηκαν επωάζονται στους
72οC παρουσία των τεσσάρων νουκλεοτιδίων ώστε
να επιμηκυνθούν οι εκκινητήρες από μία κατάλληλη
πολυμεράση (Taq πολυμεράση)
 Η διαδικασία επαναλαμβάνεται.

22. Αποδιάταξη - Υβριδοποίηση
 Αποδιάταξη: In vitro διάσπαση των
δεσμών υδρογόνου που συγκρατούν
τους δύο κλώνους ενός μορίου DNA, με
αποτέλεσμα, οι δύο κλώνοι να
αποχωρίζονται.
 Μπορεί να γίνει:
◦ Με αύξηση της θοC.
◦ Με δράση κατάλληλων χημικών ουσιών
 Σε κατάλληλες συνθήκες οι κλώνοι
μπορούν να επανασυνδεθούν
 Υβριδοποίηση: Δημιουργία δεσμών
υδρογόνου μεταξύ συμπληρωματικών
αλληλουχιών DNA-DNA ή DNA-RNA(ή
RNA-RNA).

23. Γονιδιωματική βιβλιοθήκη(1)
 Το γονιδίωμα του οργανισμού-«δότη» και το DNA του φορέα
κόβονται με την ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση.
 Το γονιδίωμα του δότη έχει χιλιάδες φορές σε τυχαίες θέσεις την
αλληλουχία αναγνώρισης της περιοριστικής ενδονουκλεάσης.
Αντίθετα, τα πλασμίδια έχουν την αλληλουχία αναγνώρισης μία μόνο
φορά.
 Το DNA του δότη κόβεται σε χιλιάδες τυχαία κομμάτια, ενώ τα
πλασμίδια γίνονται γραμμικά. Τα τμήματα DNA του δότη και του
πλασμιδίου έχουν μονόκλωνα άκρα τα οποία είναι συμπληρωματικά.

24. Γονιδιωματική βιβλιοθήκη(2)
 Τα τμήματα DNA του δότη και του φορέα αναμιγνύονται και έτσι
συνδέονται λόγω συμπληρωματικότητας των μονόκλωνων άκρων
τους (με δεσμούς υδρογόνου).
 Με τη δράση της DNA δεσμάσης, η οποία δημιουργεί 3’-5’
φωσφοδιεστερικούς δεσμούς δημιουργούνται ανασυνδυασμένα
μόρια DNA.
 Ορισμένα πλασμίδια ξαναγίνονται κυκλικά χωρίς να συνδεθούν με
DNA του δότη (μη ανασυνδυασμένα πλασμίδια).

25. Γονιδιωματική βιβλιοθήκη(3)
 Τα πλασμίδια εισάγονται σε βακτήρια. Τα βακτήρια που
χρησιμοποιούνται ως ξενιστές δεν περιέχουν πλασμίδιο, άρα είναι
ευαίσθητα σε αντιβιοτικά.
 Τα τοιχώματα του βακτηρίου γίνονται παροδικά διαπερατά σε
μακρομόρια. Η εισαγωγή ενός πλασμιδίου (ανασυνδυασμένου ή
μη) σ’ ένα βακτήριο λέγεται μετασχηματισμός.
 Μεγάλο ποσοστό βακτηρίων δε δέχεται κανένα πλασμίδιο (μη
μετασχηματισμένα βακτήρια).

26. Γονιδιωματική βιβλιοθήκη(4)
 Επιλογή των βακτηρίων-ξενιστών, δηλαδή των βακτηρίων που
δέχθηκαν πλασμίδιο, με καλλιέργεια σε θρεπτικό υλικό που
περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό.
 Τα βακτήρια που δεν έχουν προσλάβει πλασμίδιο ( με
μετασχηματισμένα βακτήρια) πεθαίνουν.

27. Γονιδιωματική βιβλιοθήκη(5)
 Τα βακτήρια που επιβίωσαν διαιρούνται. Κάθε μετασχηματισμένο
βακτήριο σχηματίζει μία αποικία που αποτελεί έναν κλώνο.
 Τα βακτήρια κάθε κλώνου περιέχουν το ίδιο τμήμα DNA του
οργανισμού – «δότη».
 Δημιουργούνται χιλιάδες διαφορετικοί κλώνοι, καθένας από τους
οποίους περιέχει ένα διαφορετικό τμήμα του οργανισμού-δότη.

28. E coli
πλασμίδιο
2. Κόψιμο με την ίδια
περιοριστική ενδονουκλεάση
Θέση που κόβει
η περιοριστική
ενδονουκλεάση
Γονίδιο
ανθεκτικότητας
σε αντιβιοτικό
1. απομόνωση DNA
Μονόκλωνα άκρα
3. Ανάμιξη των
μορίων DNA
4. H DNA δεσμάση
ενώνει τα διαφορετικά
κομμάτια
ανασυνδυασμένο
DNA

29. ανασυνδυασμένο
DNA 5. Το ανασυδυασμένο
πλασμίδιο εισάγεται
σε βακτήριο ξενιστή
6. Τα βακτήρια καλλιεργούνται
σε θρεπτικό υλικό που
περιέχει κατάλληλο
αντιβιοτικό
7. Επιλέγονται τα βακτήρια
που έχουν προσλάβει
(ανασυνδυασμένο ή μη)
πλασμίδιο.
Βακτήρια που
έχουν προσλάβει
πλασμίδιο (λευκά)

30. Επιλογή επιθυμητού κλώνου από μία βιβλιοθήκη
 Ανιχνευτής: Ιχνηθετημένο μόριο DNA ή RNA, το οποίο είναι
συμπληρωματικό του επιθυμητού τμήματος DNA (π.χ.
επιθυμητού γονιδίου)
 Διαδικασία: Ο ανιχνευτής αναμειγνύεται με το DNA της
βιβλιοθήκης, το οποίο έχει προηγουμένως αποδιαταχθεί και
υβριδοποιείται μόνο με τη συμπληρωματική του αλληλουχία.
5’3’
Ιχνηθετημένος
ανιχνευτής
Αποδιαταγμένο
DNA βιβλιοθήκης
G A T C A G T A G
C T A G T C A T C

33. Κατασκευή cDNA βιβλιοθήκης
 Αν θέλουμε να απομονώσουμε ένα ευκαρυωτικό γονίδιο με σκοπό
να το εκφράσουμε σε βακτήριο, ώστε να παράγει μεγάλες
ποσότητες της πρωτεΐνης, πρέπει να δημιουργήσουμε cDNA
βιβλιοθήκη, η οποία περιέχει μόνο τα γονίδια που εκφράζονται
σ’ ένα κυτταρικό τύπο και μας δίνει τη δυνατότητα να
απομονώσουμε μόνο τα εξώνια αυτών των γονιδίων (δηλαδή
μόνο τις αλληλουχίες του γονιδίου που εκφράζονται σε αμινοξέα).

34. Στάδια κατασκευής cDNA βιβλιοθήκης
1 2 ν
ώριμο mRNA
γονιδίου Χ
1. Απομόνωση ολικού ώριμου
mRNA από τα κύτταρα- «στόχους»
2. Σύνθεση mRNA – cDNA με την
αντίστροφη μεταγραφάση.
3. Απομάκρυνση του mRNA.Τα
υβριδικά μόρια αποδιατάσσονται.
4. Mε καλούπι το cDNA
δημιουργούνται δίκλωνα μόρια DNA
με τη δράση DNA πολυμεράσης.
5. Δημιουργία
ανασυνδυασμένων μορίων
DNA (DNA δεσμάση).
6. Τα δίκλωνα μόρια εισάγονται σε πλασμίδια.

35. 7. Τα πλασμίδια εισάγονται σε
βακτήρια-ξενιστές (μετασχηματισμός).
8. Τα βακτήρια καλλιεργούνται σε
θρεπτικό υλικό που περιέχει
αντιβιοτικό.
9. Προσδιορίζονται τα βακτήρια
που έχουν προσλάβει
πλασμίδιο.
10. Με ειδική διαδικασία επιλέγεται ο επιθυμητός κλώνος. Χρήση κατάλληλου
ανιχνευτή, ο οποίος είναι συμπληρωματικός με μία αλληλουχία του επιθυμητού τμήματος
DNA
Το σύνολο των βακτηριακών κλώνων που περιέχει όλα τα γονίδια που
εκφράζονται σε ένα κυτταρικό τύπο, απαλλαγμένα από τα εσώνια τους,
ονομάζεται cDNA βιβλιοθήκη.

36. ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ cDNA ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ
1. Περιέχει όλες τις αλληλουχίες του γονιδιώματος ενός οργανισμού
(εσώνια και εξώνια γονιδίων, υποκινητές ρυθμιστικές περιοχές,
περιοχές με άγνωστη λειτουργία)
1. Περιέχει μόνο τα εξώνια των γονιδίων που εκφράζονται μια
δεδομένη στιγμή στο κύτταρο, δηλαδή τα «αντίγραφα» των ώριμων
mRNA.
2. Δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση ευκαρυωτικών
γονιδίων που πρόκειται να εκφραστούν σε βακτήρια
2. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί.
3. Κάθε βακτηριακός κλώνος περιέχει ένα τυχαίο τμήμα του
γονιδιώματος του οργανισμού-δότη δηλ. μπορεί να περιέχει
ολόκληρο γονίδιο, τμήμα γονιδίου κ.λ.π.
3. Κάθε βακτηριακός κλώνος περιέχει ένα μόνο γονίδιο.
4. Περιοριστικές ενδονουκλεάσες, DNA δεσμάση Αντίστροφη μεταγραφάση, DNA πολυμεράση, DNA δεσμάση,
περιοριστικές ενδονουκλεάσες

37. Βακτηριοφάγος (φάγος) λ
 Ως φορέας κλωνοποίησης μπορεί να χρησιμοποιηθεί
και το DNA ενός φάγου όπως ο βακτηριοφάγος λ,
οποίος έχει χρησιμοποιηθεί ευρύτατα διότι μπορεί να
ενσωματώσει μεγαλύτερα κομμάτια «ξένου» DNA.

38. Δημιουργία γονιδιωματικής βιβλιοθήκης
με χρήση του βακτηριοφάγου λ
 Απομόνωση του συνολικού DNA του
οργανισμού δότη και του DNA των
φάγων.
 Το DNA του δότη και του φάγου κόβονται
με την ίδια περιοριστική ενδνουκλεάση.
 Δημιουργούνται ανασυνδυασμένα μόρια
DNA δηλ. τα τμήματα DNA του δότη
συνδέονται με τα μόρια DNA των φάγων
με τη δράση της DNA δεσμάσης.
 Ακολουθεί προσθήκη των πρωτεϊνών των
φάγων, με αποτέλεσμα να δημιουργούνται
οι νέοι φάγοι.
 Οι ανασυνδυασμένοι φάγοι προστίθενται
σε βακτηριακή καλλιέργεια.
 Κάθε φάγος προσκολλάται σ’ ένα
βακτήριο και το DNA του εισέρχεται στο
βακτηριακό κύτταρο, όπου αντιγράφεται
αναξάρτητα.