4. Rekayasa Genetika
 Pada dasarnya rekayasa genetika adalah
memanipulasi DNA (asam deoksiribosenuklat). Gen
atau pembawa sifat yang bisa diturunkan dalam
mahkluk terdiri dari rantai DNA.
 Rekayasa genetika merupakan suatu rangkaian
metode yang canggih akan tetapi sederhana dalam
hal prinsip, yang memungkinkan untuk dilakukan
pengambilan gen atau sekelompok gen dari sebuah
sel dan mencangkokkan gen atau sekelompok gen
tersebut pada sel lain. Gen atau sekelompok gen
tersebut mengikat dirinya dengan gen atau
sekelompok gen yang sudah ada dan bersama-
sama menanggung reaksi biokimiawi penerima.

5. Transgenik
 Secara sederhana transgenik atau
sering disebut juga GM (genetically
modified) atau GMO (genetically
modified organism) dapat diartikan
kromosom yang di dalamnya telah
disisipkan satu atau lebih dari organisme
yang berbeda baik secara alami atau
buatan

7. Awal penemuan
 Warner Arber pada tahun 1960, menemukan
enzim untuk memotong untaian DNA, enzim
tersebut dikenal sebagai enzim restriksi.
 Stanley Cohen dan Herbert Boyer tahun 1973,
berhasil memotong dan memindahkan
potongan DNA dari satu bakteri ke bakteri lain.
Proses inilah awal mula dari “transgenik
buatan” yang dilakukan di laboratorium

8. Enzim restriksi
 Enzim tersebut diisolasi dari bakteri yang kini
menjadi amat penting dalam dunia rekayasa
genetika dan terapi gen.
 Enzim penting yang dihasilkan bakteri
tersebut disebut enzim restriksi atau enzim
endonuklease restriksi. Enzim ini sesuai
namanya berfungsi untuk melindungi bakteri
dari virus bakteri yang menginfeksinya, yang
disebut bakteriofaga.
 Manusia memanfaatkan untuk memotong-
motong DNA suatu gen.

9. lanjutan
 Enzim tersebut mengenal dan memotong DNA
pada sekuen spesifik yang panjangnya 4-6
pasang basa
 Saat ini sudah banyak enzim restriksi yang
bisa diisolasi dari berbagai spesies bakteri.
 Nama enzim diawali 3 huruf yang menyatakan
nama bakteri yang memproduksi
 Setiap enzim mengenal sekuen dan situs
pemotongan yang khas

10. Contoh Enzim
Nama Enzim Sekuens pengenal Organisme asal
EcoRI G AATTC E. coli
HindIII A AGCTT H. influenzae
HhaI GCG C H. haemolyticus
TagI T CGA T. aquaticus
BsuRI GG CC B. subtilis
BalI TGG CCA B. albidum
NotI GC GGCCGC N. otidis-carviarum
BamHI G GATCC B. amyloliquefaciens

12. Elektroforesis
 Merupakan metode standar untuk
memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakteri-
sasi dan purifikasi dari molekul DNA/RNA
maupun protein.
 Merupakan alat pendukung pokok dalam
teknologi DNA rekombinan dengan aplikasi
yang luas untuk fraksinasi untai tunggal
maupun ganda
 Dapat menggunakan Agarose atau Acrylamid

13. lanjutan
 Secara prinsip, teknik ini mirip dengan
kromatografi: memisahkan campuran
bahan-bahan berdasarkan perbedaan
sifatnya. Dalam elektroforesis gel,
pemisahan dilakukan terhadap
campuran bahan dengan muatan listrik
yang berbeda-beda

14. lanjutan
 Dalam elektroforesis gel, terdapat dua material
dasar yang disebut fase diam dan fase
bergerak (eluen). Fase diam berfungsi
"menyaring" objek yang akan dipisah,
sementara fase bergerak berfungsi membawa
objek yang akan dipisah. Sering kali
ditambahkan larutan penyangga pada fase
bergerak untuk menjaga kestabilan objek
elektroforesis gel. Elektroda positif dan negatif
diletakkan pada masing-masing ujung aparat
elektroforesis gel.

15. lanjutan
 Zat yang akan dielektroforesis dimuat pada
kolom (disebut well) pada sisi elektroda
negatif. Apabila aliran listrik diberikan, terjadi
aliran elektron dan zat objek akan bergerak ke
arah sisi elektroda positif. Kecepatan
pergerakan ini berbeda-beda, tergantung dari
muatan dan ukuran objek. Kisi-kisi gel
berfungsi sebagai pemisah. Objek berukuran
lebih besar akan lebih lambat berpindah

16. lanjutan
 Pada pH mendekati netral DNA bermuatan (-)
dan akan bermigrasi dari Kathode ke Anode
 Poliakrilamid gel (tanpa denaturasi) dapat
digunakan untuk memisahkan fragmen DNA
(double strain) mulai dari 6 bp (20% akrilamid)
sampai 1000 bp (3% akrilamid)
 Agarose gel mempunyai kemampuan range
yang lebih luas : 70 bp (3% agarose) dan
800.000 bp (0,1 % agarose)

17. Agarose gel elektroforesis
 Lokasi fragmen DNA dapat diamati secara in
situ dengan menggunakan etidium bromid
sebagai pewarna (mencampur langsung dalam
gel, gel buffer atau setelah elektroforesis
berakhir.
 Pemakaian etidium bromid dengan melarutkan
langsung dalam buffer akan mempengaruhi
mobilitas DNA dalam gel. Warna ini
berinteraksi dengan basa dari molekul DNA
dan memberikan warna orange flourescence di
bawah lampu UV.

18. lanjutan
 Konsentrasi agarose menentukan besar pori-
pori dari matrik gel. Makin tinggi konsentrasi
agarose maka pori yang terbentuk makin kecil.
Network pori-pori gel berfungsi sebagai
saringan molekul, DNA dengan fragmen kecil
bermigrasi lebih cepat dari pada fragmen
besar
 Pemilihan konsentrasi yang tepat menentukan
range molekul yang dapat dipisahkan

19. Range Pemisahan Molekul DNA
dengan Agarose Gel
Agarose (%) Separasi optimal dari mol DNA (kb)
0,3 5,0 - 60
0,6 1,0 - 20
0,7 0,8 - 10
0,9 0,5 - 7,0
1,2 0,4 - 6,0
1,5 0,2 - 4,0
2,0 0,1 - 3,0

20. lanjutan
 Agarose dengan konsentrasi di bawah
0,5% tidak begitu menguntungkan
karena sukar penanganannya dan gel
yang terbentuk sangat fragil
 Agarose merupakan polimer molekul
(polisakarida)

21. Poliakrilamid gel elektroforeses
(PAGE)
 Poliakrilamid gel terbentuk dari
polimerisasi monomer poliakrilamid
menjadi rantai linier
 Konsentrasi akrilamid menentukan
panjang rantai polimer

22. Contoh hasil elektroforesis

23. Contoh hasil elektroforesis

25. Kloning
 Kloning gen : suatu prosedur
untuk memperoleh replika yang
sama dari sel atau organisme

26. Kloning
 Teknik kloning salah satu teknik yang digunakan
untuk mencoba menciptakan makhluk hidup yang
hampir sama dengan yang sudah ada melalui
rekayasa genetika. Kloning memperkenalkan
manusia pada perkembangan badan yang
deterministik, lewat cetak biru gen organisme
induknya. Membuat klon gen merupakan suatu
teknologi untuk mengidentifikasi, mengisolasi, dan
membuat copy gen dari protein tertentu, dengan
tujuan agar gen itu dapat dianalisis atau dipakai
untuk memproduksi protein tersebut dalam jumlah
besar .

27. lanjutan
 Kloning yang pertama kali berhasil :
domba Dolly
 Legalitas kloning manusia sejauh ini
memang masih diperdebatkan
sehubungan masih adanya pro dan
kontra.

28. FATWA MUI
 Secara umum, kloning terhadap tumbuh-tumbuhan
dan hewan akan membawa kemanfaatan dan
kemaslahatan kepada umat manusia.
 Kloning terhadap manusia dapat membawa manfaat,
antara lain : rekayasa genetik lebih efisien dan
manusia tidak perlu khawatir akan kekurangan organ
tubuh pengganti (jika memerlukan) yang biasa
diperoleh melalui donor, dengan kloning ia tidak akan
lagi merasa kekurangan ginjal, hati, jantung, darah,
dan sebagainya, karena ia bisa mendapatkannya dari
manusia hasil teknologi kloning.
 Kloning terhadap manusia juga dapat menimbulkan
mafsadat (dampak negatif yang tidak sedikit) antara
lain :

29. lanjutan
• menghilangkan nasab anak hasil kloning
yang berakibat hilangnya banyak hak anak
dan terabaikannya sejumlah hukum yang
timbul dari nasab;
• institusi perkawinan yang telah disyari'atkan
sebagai media berketurunan secara sah
menjadi tidak diperlukan lagi, karena
proses reproduksi dapat dilakukan tanpa
melakukan hubungan seksual;

30. lanjutan
• lembaga keluarga (yang dibangun melalui
perkawinan) akan menjadi hancur, dan
pada gilirannya akan terjadi pula
kehancuran moral (akhlak), budaya,
hukum, dan syari'ah Islam lainnya;
• tidak akan ada lagi rasa saling mencintai
dan saling memerlukan antara laki-laki
dan perempuan;
• hilangnya maqashid syari'ah dari
perkawinan, balk maqashid awwaliyah
(utama) maupun maqashid tabi'ah
(sekunder).

31. FATWA MUI
• FATWA MUSYAWARAH NASIONAL MAJELIS
ULAMA INDONESIA TENTANG KLONING.
• Kloning terhadap manusia dengan cara
bagaimanapun yang berakibat pada
pelipatgandaan manusia hukumnya adalah
haram.
• Kloning terhadap tumbuh-tumbuhan dan
hewan hukumnya boleh (mubah) sepanjang
dilakukan demi kemaslahatan dan/atau untuk
menghindarkan kemudaratan (hal-hal negatif).

32. lanjutan
 Kloning ekspresi : salah satu teknik
dasar biologi molekular yang digunakan
misalnya untuk mempelajari fungsi
protein. Pada teknik ini, potongan DNA
penyandi protein yang diinginkan
ditransplantasikan ke suatu plasmid
(DNA sirkular yang biasanya ditemukan
pada bakteri; dalam teknik ini, plasmid
disebut sebagai vektor ekspresi).

33. lanjutan
 Plasmid yang telah mengandung potongan DNA
yang diinginkan tersebut kemudian dapat disisipkan
ke dalam sel bakteri atau sel hewan. Penyisipan
DNA ke dalam sel bakteri disebut transformasi, dan
dapat dilakukan dengan berbagai metode, termasuk
elektroporasi, mikroinjeksi dan secara kimia.
Penyisipan DNA ke dalam sel eukaryota, misalnya
sel hewan, disebut sebagai transfeksi, dan teknik
transfeksi yang dapat dilakukan termasuk transfeksi
kalsium fosfat, transfeksi liposom, dan dengan
reagen komersial. DNA dapat pula dimasukkan ke
dalam sel dengan menggunakan virus (disebut
transduksi viral).

34. lanjutan
 Setelah penyisipan ke dalam sel, protein yang
disandi oleh potongan DNA tadi dapat
diekspresikan oleh sel bersangkutan. Berbagai
jenis cara dapat digunakan untuk membantu
ekspresi tersebut agar protein bersangkutan
didapatkan dalam jumlah besar. Protein dalam
jumlah besar tersebut kemudian dapat
diekstrak dari sel bakteri atau sel eukaryota

35. Langkah dasar kloning gen
 Fragmen DNA yang mengandung gen yang
akan diklon diinsersikan pada molekul DNA
sirkular yang disebut sektor untuk
menghasilkan molekul DNA rekombiner
 Vektor yang bertindak sebagai wahana
pembawa gen masuk dalam sel tuan rumah
(host)
 Di dalam sel host, vektor megadakan replikasi
menghasilkan banyak copy atau turunan yang
identik dengan gen yang dibawanya

36. lanjutan
 Ketika sel host membelah, copy molekul DNA
rekombinasi diwariskan pada progeni dan
terjadi replikasi selanjutnya
 Setelah terjadi sejumlah besar pembelahan
sel, maka dihasilkan koloni atau klon yang
identik
 Tiap sel dalam klon mengandung 1 copy atau
lebih molekul DNA rekombinasi. Dengan
demikian gen yang dibawa oleh molekul
rekombinasi telah diklon

37. lanjutan
 Untuk dapat bertindak sebagai wahana
suatu molekul DNA harus mampu
memasuki sel tuan rumah dan
mengadakan replikasi untuk
menghasilkan copy dalam jumlah besar
 Molekul DNA alamiah yang memenuhi
persyaratan tersebut : Plasmid dan
bakteriofaga (virus yang menginfeksi
bakteri)

38. Plasmid
DNA sirkuler selain kromosom yang terdapat
pada bakteri. Dapat bereplikasi sendiri dan
mengandung berbagai gen. Jenis dan jumlah
pada pada bakteri berbeda sekalipun dalam
satu spesies.

39. lanjutan
Pemotongan plasmid digunakan enzim retriksi
Plasmid yang sudah terpotong dicampur
dengan DNA asing deng ditambah enzim
ligase (plasmid akan bergabung dengan
DNA asing atau DNA awal).
Transformasi : plasmid dicampur dengan
bakteri yang tidak mempunyai plasmid
akan terbentuk 3 bakteri (tidak
mengandung plasmid, plasmid asli dan
plasmid rekombinan)**

41. lanjutan
 Seleksi bakteri yang mengandung plasmid rekombinan
dapat digunakan antibiotik.
 Contoh plasmid lain pUC 118 dan pUC 119 yang
mengandung gen lac Z yang menyandi enzim beta-
galaktosidase.
 Enzim beta-galaktosidase akan memecah x-gel menjadi
galaktosa dan 5-bromo-4 chloroindigo (biru). Oleh karena itu
bakteri yang mengandung pUC 118 dan 119 akan berwarna
biru bila ditumbuhkan pada media x-gel

43. PCR
 Polymerase Chain Reaction : kalau
diterjemahkan adalah reaksi rantai polimerase.
Merupakan prosedur yang efektif untuk
amplifikasi sekuen DNA
 Kegunaan utama dari PCR adalah untuk
menggandakan sebuah bagian spesifik dari
DNA (misal sebuah gen) hingga berkali-kali lipat
(amplifikasi) sehingga bagian spesifik
DNA yang kita inginkan dapat kita identifikasi
dan diketahui keberadaannya

44. lanjutan
 PCR : teknologi yang ditemukan oleh Kary
B. Mullis pada tahun 1985

45. Mekanisme
 Ada 3 langkah utama dalam PCR, yang
sebetulnya dilakukan berulang-ulang hingga
30-40 kali. Langkah-langkah ini dilaksanakan
pada mesin yang secara otomatis melakukan
reaksi dalam waktu yang singkat. Langkah
utama adalah sebagai berikut:
- Denaturasi pada suhu 95°C : Pada saat
denaturasi, rantai ganda DNA dari objek
penelitian mengalami pemisahan sehingga
media berisi rantai tunggal DNA sebagai DNA
template. (Tabung reaksi berisi DNA target, 2
primer oligonukleotida, polimerase tag yang
tahan panas, 4 deoksiribonuklotida)

46. lanjutan
- Annealing (Renaturasi) pada suhu 37°C-55°C: Pada
tahapan ini, molekul-molekul primer (rantai asam
nukleat yang digunakan untuk mengawali proses PCR)
yang telah ditambahkan pada media menempel/hibrid
pada rantai DNA target. Primer didesain secara khusus
agar bisa berkomplemen/berpasangan dengan DNA
template. Primer didesain pula untuk mengamplifikasi
target DNA yang kita inginkan (misal DNA virus
WSSV).
- Perpanjangan rantai (polimerse) pada suhu 72°C:
Pada tahapan ini DNA polimerase yang ditelah
ditambahkan pada media mulai bekerja untuk
memanjangkan rantai sehingga terbentuk rantai ganda
DNA yang diinginkan.

47. lanjutan
 Semu tahap dan perubahan suhu dilakukan
pada alat pemanas terprogram otomatis. Satu
siklus biasanya membutuhkan waktu 3-5 menit
 Rantai ganda DNA objek mengalami
penggandaan sehingga terdapat peningkatan
jumlah gen secara eksponensial. Reaksi PCR
yang berulang membuat jumah gen template
(gen yang kita ingin ketahui) memadai
untuk kita periksa pada analisa selanjutnya

48. lanjutan
 Pada fase sintesis siklus pertama, DNA yang
baru terbentuk memperpanjang masing-
masing primer sampai melewati lokus di mana
primer satu menempel. Untai baru ini bekerja
sebagai cetakan panjang yang akan
ddigunakan pada siklus ke dua
 Pada siklus ke dua, untai DNA asli dan untai
baru didenaturasi dan hibridisasi dengan
masing-masing primer. Sintesis menghasilkan
untai yang panjang dan untai DNA yang kedua
ujungnya mengandung primer dan komplemen
pimer (cetakan pendek)

49. lanjutan
 Pada siklus ke tiga, untai pendek, untai
panjang dan untai asli dihibridisasi oleh
primer dan kemudian polimerasi.
 Pada tahap berikutnya akan
terakumulasi untai pendek dan sampai
pada siklus 30 untai yaitu sekitar sejuta
kali banyaknya dari untai asli

51. lanjutan
 Secara praktis, PCR dapat dilakukan
dengan mesin yang sudah
diperjualbelikan di pasaran
 Untuk memverifikasi apakah PCR
kita berhasil menggandakan gen
maka digunakanlah teknologi
elektroforesis gel.

52. Contoh elektroforesis
Dari gambar terlihat
bahwa peneliti memakai
dua buah primer pada
positive control. Peneliti
juga menyiapkan ladder
(di ujung kanan)
sebagai rujukan.
Dari tiga buah sampel,
Tissue 1 tidak memiliki
gen yang dicari karena
terlihat tidak memiliki
garis hitam pada hasil
elektroforesis

53. Kegunaan PCR
 Mengetahui sekuen DNA yang telah
diketahui namun dalam jumlah kecil
 Mendeteksi infeksi virus atau bakteri
 Deteksi mutasi, membuat mutasi
spesifik in vitro
 Menghasilkan gen utuh dan untuk
sekunsing
 Deteksi penyakit keturunan