1. 13.10.11 Kashiwa.R#9 @ 駒場キャンパス
ゲノム解析で R を使う
ゲノム解析で R を使う
ゲノム解析で R を使う
@yuifu
おざきはるか
概要 : ゲノム解析，配列解析， NGS 解析などで R を実際にどう使っているかを紹介しま
す．
1

2. ゲノム
• 生物の遺伝情報の全て
http://en.wikipedia.org/wiki/File:NHGRI_human_male_karyotype.png
2

3. ゲノム（データとしての）
• 文字列
• ４種類の文字（塩基）
• とても長い
http://www.sciencedaily.com/releases/2009/10/091014130702.htm
3

4. ゲノム上のデータ
• どこに何があるか
• 遺伝子
• 転写イベント
• 化学修飾
http://dpb.carnegiescience.edu/labs/huala-lab/projects/genome-annotation
4

5. ゲノム解析
• ゲノムの部分文字列に対する解析
• ゲノム上の区間に対する解析
http://www.pharmainfo.net/articles/homology-modeling-family-39-glycoside-hydrolase-clostridium-thermocellum
http://bedtools.readthedocs.org/en/latest/content/tools/complement.html
5

6. 今日の内容
• 「 R でこんなこともできるんだ」という紹介
• コードの説明はあまりしません（あとで自分で試してみてください）
6

7. Bioconductor
http://bioconductor.org
7

8. ゲノム配列を手元に持ってくる
library(BSgenome)
# Bioconductor のアノテーションパッケージとして利用可能なゲノムの一覧 available.genomes()
# Fruit fly のゲノムをインストール source("http://bioconductor.org/biocLite.R") #
chooseBioCmirror()biocLite("BSgenome.Dmelanogaster.UCSC.dm3")
# パッケージを読み込む library(BSgenome.Dmelanogaster.UCSC.dm3)
# BSgenome オブジェクトとしてのゲノム配列
Dmelanogaster
8

9. あるモチーフの出現回数を数える
# IUPAC code でモチーフを定義
RRE <- "WAWNTRGGTCA"
# Fruit fly のゲノム配列全体から， RRE にマッチする箇所をカウント count.RRE <- vcountPattern(RRE, Dmelanogaster, fixed=c(pattern=FALSE,
subject=TRUE))
# ヒストグラムで結果を表示
library(ggplot2)p <- ggplot(count.RRE, aes(x=paste(seqname,strand), y=count)) + geom_histogram() + theme(axis.text.x=element_text(angle=90,
hjust = 1))plot(p)
9

10. 遺伝子配列をたくさんとってくる
# Ensembl データベースを使う
library(biomaRt)ensembl <- useMart("ensembl")
ensembl <- useDataset("drerio_gene_ensembl", mart=ensembl)
id <- c("ENSDARG00000044774", "ENSDARG00000070913")
# cDNA 配列の取得
seq <- getSequence(id=id, type="ensembl_gene_id", seqType="cdna", mart=ensembl)
# pre-mRNA 配列（エキソン＋イントロン）の取得
seq <- getSequence(id=id, type="ensembl_gene_id", seqType="gene_exon_intron", mart=ensembl)
# FASTA 形式での保存
library(Biostrings)dna <- DNAStringSet(seq[,1])names(dna) <- seq[,2]writeXStringSet(dna, file="hoge.fa", format="fasta")
http://qiita.com/yuifu/items/a757629506c1cd98156b
10

11. RNA-seq から発現変動遺伝子を抽出する
• RNASeqDataSubset （ RNA-seq のテストデータ）
• 組織 : マウスの心臓
• 実験条件 : TBX20 KO マウス と 野生型マウス
• 予備知識 : TBX20 は心臓の発生と機能に不可欠な転写因子
• 軽くするために， chr19 のみ
• mm9 にマップ（最新は mm10 なので注意）
11

12. RNA-seq から発現変動遺伝子を抽出する
• データへのアクセス（テストデータ）
# Data ( テストデータ )source("http://bioconductor.org/biocLite.R")biocLite("RNASeqDataSubset")library("RNASeqDataSubset")
# BAM ファイルの一覧を取得 fls <- RNASeqDataSubset::getBamFileList()
> fls
SRR316184
"/Library/Frameworks/R.framework/Versions/2.15/Resources/library/RNASeqDataSubset/extdata/SRR316184.bam"
SRR316185
"/Library/Frameworks/R.framework/Versions/2.15/Resources/library/RNASeqDataSubset/extdata/SRR316185.bam"
SRR316186
"/Library/Frameworks/R.framework/Versions/2.15/Resources/library/RNASeqDataSubset/extdata/SRR316186.bam"
SRR316187
"/Library/Frameworks/R.framework/Versions/2.15/Resources/library/RNASeqDataSubset/extdata/SRR316187.bam"
SRR316188
"/Library/Frameworks/R.framework/Versions/2.15/Resources/library/RNASeqDataSubset/extdata/SRR316188.bam"
SRR316189
"/Library/Frameworks/R.framework/Versions/2.15/Resources/library/RNASeqDataSubset/extdata/SRR316189.bam"
12

13. RNA-seq から発現変動遺伝子を抽出する
• メタデータの取得
# メタデータの取得 fn <- system.file("extdata", "phenoData.txt",
stringsAsFactors=FALSE)
package="RNASeqDataSubset")pd <- read.table(fn, header=TRUE,
> pd
SRX
SRR
GSM
condition replicate1 SRX085099 SRR316184 GSM767225
normal
12 SRX085100 SRR316185
GSM767226
normal
23 SRX085101 SRR316186 GSM767227
normal
34 SRX085102 SRR316187 GSM767228 Tbx20
knockout
15 SRX085103 SRR316188 GSM767229 Tbx20 knockout
26 SRX085104 SRR316189 GSM767230 Tbx20 knockout
3
どんなバイオロジカルな implication が得られるかまで
13

14. RNA-seq から発現変動遺伝子を抽出する
• カウントテーブルの作成
• 各サンプルで各遺伝子にマップされたリード数の表
• 行数＝遺伝子数，列数＝サンプル数
• 今回は Bioconductor の easyRNAseq で作成する
14

15. RNA-seq から発現変動遺伝子を抽出する
# easyRNASeq
source("http://bioconductor.org/biocLite.R")biocLite("easyRNASeq")library(easyRNASeq)
listMarts(host="may2012.archive.ensembl.org")count.table <- easyRNASeq(filesDirectory=dirname(fls)[1],
filenames=basename(fls),
gapped=TRUE,
annotationMethod="biomaRt",
organism="Mmusculus",
count="genes",
summarization="geneModels",
host="may2012.archive.ensembl.org",
nbCore=2)
• HTSeq
• GTF ファイルのダウンロード
• http://feb2012.archive.ensembl.org/info/data/ftp/index.html
> head(count.table)
SRR316184.bam SRR316185.bam SRR316186.bam SRR316187.bam SRR316188.bamENSMUSG00000001750
98
107
88
446
386ENSMUSG00000003053
1
0
0
0
0ENSMUSG00000003228
2
0
2
11
8ENSMUSG00000003555
6
8
6
29
17ENSMUSG00000003559
8
2
1
5
6ENSMUSG00000003680
37
51
40
187
232
SRR316189.bamENSMUSG00000001750
381ENSMUSG00000003053
0ENSMUSG00000003228
5ENSMUSG00000003555
13ENSMUSG00000003559
4ENSMUSG00000003680
301
15

16. RNA-seq から発現変動遺伝子を抽出する
• ２条件間で発現が変動した遺伝子を抽出する
# DESeqcondition <- pd$condition[match(paste0(pd$SRR,".bam"), colnames(count.table))]names(condition) <colnames(count.table)library(DESeq)cds <- newCountDataSet(countData=count.table,
conditions=condition)cds <estimateSizeFactors( cds )sizeFactors(cds)
cds <- estimateDispersions( cds )
res <- nbinomTest( cds, "normal", "Tbx20 knockout" )res <- res[order(res$padj),]
sum(res$padj < 0.01,na.rm=TRUE)
plotMA(res)
deg <- res[res$padj < 0.01 & !is.na(res$padj),]
16

17. ChIP-seq でタンパク質のゲノム上の結合位置を検出できる
http://www.illuminakk.co.jp/document/pdf/datasheet_chip_sequence-J.pdf より引用
17

18. 異なる転写因子の ChIP-seq を比較すると協調関係がみえてくる
Cho et al. Nature (2012)
18

19. この転写因子の機能を知りたい
•
この転写因子のターゲットを知りたい
•
この転写因子の結合する配列（モチーフ）を知りたい
•
この転写因子が協調する転写因子を知りたい
X
Y
Z
W
19

20. テストケース : 体内時計の分子機構
•
3 つの結合モチーフ
•
•
D-box
•
•
E-box
RRE
転写因子
•
正
•
負
Ukai & Ueda, Annual Review of Physiology (2010)
20

21. Cho et al, Nature (2012)
21

22. ステップ１ : ChIP-seq のピークを検出する（ R の
外）
•
リード（ NGS データ）をゲノ
ム配列にマッピング（アライン
メント）
•
•
•
Bowtie
BWA
ピークを検出する
•
MACS
•
GPS
http://www.illuminakk.co.jp/document/pdf/datasheet_chip_sequence-J.pdf より引用
22

23. ステップ 2: ピークがどんな遺伝子の近くにあるか
library(Biostrings)
bedFile2 <- "~/Desktop/GSM840529_ReverbB_4086_peaks.txt"reverba.gr <BED2RangedData(read.table(bedFile1, header=T, sep="t"))
# Load TSS annotation
library(biomaRt)
mart = useMart(biomart = "ENSEMBL_MART_ENSEMBL", dataset = "mmusculus_gene_ensembl",
host="www.ensembl.org")
tss <- getAnnotation(mart, featureType = "TSS")
# Annotate peaks
library(ChIPpeakAnno)reverba.annot = annotatePeakInBatch(reverba.gr, AnnotationData = tss, output="both") #,
maxgap = 0)
Cho et al. Nature (2012)
23

24. ステップ 3: 複数の ChIP-seq と比較する
bedFile1 <- "~/Desktop/GSM840528_ReverbA_4086_peaks.txt"bedFile2 <"~/Desktop/GSM840529_ReverbB_4086_peaks.txt"data1 <BED2RangedData(read.table(bedFile1, header=T, sep="t"))data2 <BED2RangedData(read.table(bedFile2, header=T, sep="t"))strand(data1) <"*"strand(data2) <- "*"data1.data2.overlap <- findOverlappingPeaks(data1,
data2, annotate=1)#
pie(table(data1.data2.overlap$OverlappingPeaks$overlapFeature)
)
head(data1.data2.overlap$OverlappingPeaks$overlapFeature)data1.data2.over
lap.count
<makeVennDiagram( RangedDataList(data1,data2),
NameOfPeaks
=
c("Data1",
"Data2"), maxgap=0, minoverlap
=1, totalTest
=
100, useFeature=FALSE)
venn( list( Reverba=c( rep(0, nrow(data1) nrow(data1.data2.overlap$Peaks1withOverlaps)),
rep(1,nrow(data1.data2.overlap$Peaks1withOverlaps) ) ), Reverbb=c( rep(2,
nrow(data2) - nrow(data1.data2.overlap$Peaks2withOverlaps)),
rep(1,nrow(data1.data2.overlap$Peaks2withOverlaps) ) )))
24

25. ステップ 4: GO 解析をする
# Load genome-wide annotation for
mouselibrary(org.Mm.eg.db)reverba.go <getEnrichedGO( reverba.annot, orgAnn =
"org.Mm.eg.db", maxP = 0.01, multiAdj
=
TRUE, minGOterm
=
10, multiAdjMethod
=
"BH")# Top results for GO Molecular
Functionreverba.go.mf <unique(reverba.go$mf[order(reverba.go$mf[,1
0]),
c(2,10)])
go.term
BH.adjusted
.p.value
cytoskeletal protein binding
2.77E-06
GTPase regulator activity
3.79E-06
protein binding
1.04E-05
phospholipid binding
1.04E-05
nucleoside-triphosphatase regulator activity
1.04E-05
enzyme binding
2.26E-05
protein complex binding
7.09E-05
ion binding
1.17E-04
cation binding
1.66E-04
metal ion binding
1.66E-04
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26. 今後の展開
•
遺伝子発現との関連
•
•
WT ，変異体
モチーフ解析
•
共通部分と独自部分でそれぞれ
•
•
→ 新たな協調因子
別の ChIP-seq データとの比較
•
Rev-Erbα
Rev-Erbβ
→ 新たな協調因子
???
Cho et al. Nature (2012)
http://molbio.mgh.harvard.edu/sheenweb/PromoterATAK&MZ06.html より引用
???
26

27. 課題（誰か教えてください）
• makeTranscriptDbFromBiomart で古い Ensembl のアーカイブにアクセスす
る方法
• ゲノム配列に基づいてアノテーションはつくられるため，ゲノム配列の
バージョンが新しくなると，デフォルトでは新しいゲノム配列に基づく
•
例） Dec. 2011 からマウスゲノム mm10 がリリースしたため， Ensembl のアノテーションは Jul.
2012 からは mm10 ベースになっている
• 以下ではエラーが出る
> pwf <- nullp(genes, "mm9", "ensGene")Loading mm9 length data... 以下にエラー qr.R(qrx) :
ルが見つかりませんでした
ジエネリック関数の環境中に "..." というシンボ
28