In this work, we investigate the suitability of a commercial available and low cost polyethersufone (PES) sorbent for the microextraction of 1H-benzotriazole (BTri), and four polar derivatives (4 and 5-methyl-1H-benzotriazole, 4-TTri and 5-TTri; 5,6-dimethyl-1H benzotriazole, XTri; and 5-chloro-1H-benzotriazole, 5-ClBTri) from surface and wastewater samples. The performance of liquid chromatography (LC) combined with quadrupole time-of-flight mass spectrometry (QTOF-MS) for the selective determination of target compounds is also discussed. Parameters affecting the efficiency of the microextraction step, such as sample’s pH, ionic strength, stirring speed and extraction lapse of time, and the PES membrane desorption process have been thoroughly investigated. Analytes were extracted from 15 mL samples, containing a 30% of sodium chloride and adjusted at pH 4.5, using a tubular PES sorbent (5 cm length x 0.7 mm o.d., sorbent volume 42 μL). After methanol desorption and solvent exchange, benzotriazoles were determined by LC-MS, with chromatograms extracted using a mass window of 20 ppm, centered in their [M+H]+ ions. The identity of chromatographic peaks was confirmed with accurate ion product scan (MS/MS) spectra. The method provided limits of quantification (LOQs) between 0.005 and 0.1 ng mL-1, and relative recoveries from 81% to 124% (except for XTri in sewage samples, ca. 60%) with associated standard deviations between 2% and 9%. The efficiency of the PES sorbent for the extraction of these compounds has been compared with that attained by stir-bar sorptive extraction (SBSE), with polydimethylsiloxane (PDMS) covered stir bars. The PES polymer achieved significant higher responses (5- to 20-fold) for these polar pollutants. To the best of our knowledge, this research constitutes the first application of both techniques (microextraction using a PES sorbent and LC-QTOF-MS) for benzotriazoles determination in water samples. The method was used to provide data regarding the levels of target compounds in river and urban wastewater samples, including the individual quantification of 4-methyl and 5-methyl-benzotriazole isomers. Obtained results confirmed the ubiquity of benzotriazole, 4-methyl and 5-methyl-benzotriazole in urban wastewater and their incomplete removal at sewage treatment plants

1. DETERMINACIÓN DE BENZOTRIAZOLES EN MUESTRAS
DE AGUA MEDIANTE MICROEXTRACCIÓN CON
POLIETERSULFONA Y CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
ESPECTROMETRÍA DE MASAS
JORGE CASADO AGRELO
Santiago de Compostela, 21 Febrero de 2013

2. 2
• Benzotriazoles Contaminantes Emergentes
• Riesgo
• Legislación
► Tóxicos  LC50
► Cancerígenos
► Antiestrogénicos
► Elevada movilidad en el agua
► No hay normativa de EEA ni EPA
► CEE permite comercialización
INTRODUCCIÓN
► Anticongelantes
► Anticorrosivos
► Antimicrobianos

3. • Analitos en este estudio:
Patrón Interno:
Benzotriazol (BTri)
log Kow: 1.44
4-metilbenzotriazol (4-TTri)
log Kow: 1.71
5-metilbenzotriazol (5-TTri)
log Kow: 1.71
Dimetilbenzotriazol (XTri)
log Kow: 2.25
5-clorobenzotriazol (5-ClBTri)
log Kow: 2.13
4-hidroxibenzotriazol (4-OHBTri)
log Kow: 0.80
5-carboxibenzotriazol (5-CBTri)
log Kow: 1.05
Benzotriazol deuterado (BTri-d4)
3

4. • Métodos de determinación
• Métodos de preparación de muestra
► LLE
► SPE
► LC-MS
► LC-MS/MS
►Microextracción sobre PES
Q-TOF  m/z exactas  Alta Selectividad
LC-ESI-QTOF
4

5. 1. Optimización y caracterización del método de determinación LC-ESI-MS/MS
2. Optimización del proceso de preparación de muestra
3. Caracterización y validación del método propuesto
4. Aplicación a muestras reales de agua para determinar su posible contaminación
OBJETIVOS
• Desarrollar un método de preparación de muestra de bajo coste para extraer
benzotriazoles de muestras de agua
• Determinar los compuestos por LC-ESI-QTOF
5

6. • Optimización de LC-ESI-MS/MS
DESARROLLO
Agilent 1200 LC
Columna cromatográfica Zorbax SB-Phenyl
Fase estacionaria Fenilo diisopropilo
Dimensiones 100 mm x 2.1 mm (d. i.)
Tamaño de partícula 3.5 μm
Temperatura del horno 30 °C
Inyector
Volumen de inyección 10 μL
Fase móvil
Flujo 0.2 mL min-1
Fase acuosa Agua ultrapura (0.1 % ácido fórmico)
Fase orgánica Acetonitrilo (0.1 % ácido fórmico)
6

7. Agilent 6520 MS MS/MS
Modo de ionización ESI positivo ESI positivo
Voltaje de la aguja 3500 V 3500 V
Temperatura de gas de secado (N2) 330 ºC 330 ºC
Flujo de gas de secado (N2) 10 L min-1 10 L min-1
Presión de gas de nebulización (N2) 30 psi 30 psi
Iones de la disolución de referencia
m/z 121.0509
m/z 922.0098
m/z 121.0509
m/z 922.0098
Modo de adquisición Centroide Centroide
7

8. • Caracterización de LC-MS
► Repetibilidad: RSD < 5 % (25 ng mL-1)
► LOQ: 0.03 – 9.1 ng mL-1
► Linealidad: 10 – 500 ng mL-1 (R2 > 0.9984)
• Caracterización de LC-MS/MS
► Repetibilidad: RSD < 14 % (25 ng mL-1)
► LOQ: 7.7 – 26 ng mL-1
► Linealidad: 10 – 500 ng mL-1 (R2 > 0.9983)
BTri
y = 0,0402x - 0,055
R2
= 0,9998
0
5
10
15
20
25
0 100 200 300 400 500 600
Concentración (ng mL-1
)
Área
/
Área
I.
S.
BTri
y = 0,0553x + 0,0617
R2
= 0,9996
0
5
10
15
20
25
30
0 100 200 300 400 500 600
Concentración (ng mL-1
)
Área
/
Área
I.
S.
8

9. • MS
• MS/MS
0
BTri
0
0
0
0
5-ClBTri
0
Tiempo (min)
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
Cuentas
4-OHBTri
5-CBTri
4-TTri 5-TTri
XTri
x102
x102
x103
x103
x102
x104
m/z 136,0505
m/z 164,0455
m/z 120,0556
m/z 134,0713
m/z 154,0167
m/z 148,0869
0
0
XTri
0
4-TTri
0
5-CBTri
x102
0
4-OHBTri
0
Tiempo (min)
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
Cuentas
BTri
5-TTri
5-ClBTri
x102
x102
x101
x103
x103
136,0505 → 80,0495
164,0455 → 80,0495
120,0550 → 65,0386
134,0713 → 77,0386
154,0167 → 98,9998
148,0869 → 77,0386
120,0556 → 65,0386
10 ng mL-1
10 ng mL-1
9

10. • Optimización de la Microextracción
1
) 2
)
3
)
Concentrar
100 µL
Fase Móvil
Desorber
disolvente
Introducir
15 mL
muestra
Agitar
Membrana de PES
1) 2) 3) 4)
PDMS
PES
PP
Polietersulfona:
PES
10

11. Variables a priori relevantes:
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
BTri 4-TTri 5-TTri XTri 5-ClBTri
Respuesta
normalizada
pH 6 pH 2
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
BTri 4-TTri 5-TTri XTri 5-ClBTri
Respuesta
normalizada
10 mL 50 mL
0%
50%
100%
150%
200%
250%
BTri 4-TTri 5-TTri XTri 5-ClBTri
Respuesta
normalizada
0 g 2 g
No se extraen:
4-OHBTri ni
5-CBTri
pH de la muestra NaCl añadido a la muestra
Volumen de muestra
11

12. Diseño 23 + 4 puntos centrales:
► A: pH (2 – 6)
► B: % NaCl (5 – 30)
► C: Velocidad de agitación (400 – 800 rpm)
► pH: Significativo para casi todos los analitos (mejor 6), excepto para 5-ClBTri
► % NaCl: Poco significativo (mejor 30 %), excepto para BTri
► Velocidad de agitación: No significativo
BTri
0 1 2 3 4 5
AC
B
C
BC
AB
A +
-
5-ClBTri
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
AC
BC
C
A
B
AB +
-
12

13. Parámetro más importante: pH de la muestra
Desorción
Fracciones de 1.5 mL de MeOH:
0%
50%
100%
150%
200%
BTri 4-TTri 5-TTri XTri 5-ClBTri
Respuesta
normalizada
pH 2 pH 4 pH 6 pH 8
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
BTri 4-TTri 5-TTri XTri 5-ClBTri
Respuesta
normalizada
Dietiléter AcOEt MeOH
pH 4
0%
20%
40%
60%
80%
100%
BTri 4-TTri 5-TTri XTri 5-ClBTri
1ª Fracción 2ª Fracción 3ª Fracción
1.5 mL
MeOH
13

14. Tiempo de extracción:
BTri
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 5 10 15 20 25
Tiempo (horas)
Área
4-TTri
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 5 10 15 20 25
Tiempo (horas)
Área
5-TTri
0
1
2
3
4
5
0 5 10 15 20 25
Tiempo (horas)
Área
XTri
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25
Tiempo (horas)
Área
5-ClBTri
0
0,5
1
1,5
2
0 5 10 15 20 25
Tiempo (horas)
Área
6 horas
14

15. PES vs PDMS:
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
BTri 4-TTri 5-TTri XTri 5-ClBTri
Respuesta
normalizada
PES PDMS
PES: 42 μL PDMS (SBSE): 24 μL
15

16. LC-MS/MS
(inyección 10 μL)
Muestra de agua: 15 mL
pH 4
30 % NaCl (4.5 g)
Extracción con polímero: PES
5 cm
Agitación a 600 rpm
6 horas
Desorción en MeOH
1.5 mL
15 minutos
Concentración
100 μL de ACN/H2O (1:9; 0.1 % ácido fórmico)
16

17. Calibración pseudo-externa
• Caracterización del método propuesto
Diferente matriz:
► Agua superficial
► Agua residual sin tratar
► Agua residual tratada
Precisión (RSD): < 7 % (n = 5; 1 ng mL-1)
Límites de cuantificación globales (LOQ Extracción-LC-MS): 0.001 – 0.204 ng mL-1
Recuperaciones relativas al agua ultrapura: 84 – 124 %
(después de corregir con el patrón interno)
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
BTri 4-TTri 5-TTri XTri 5-ClBTri
Respeusta
normalizada
Inyección de extracto de muestra
Inyección directa de muestra
17

18. • Aplicación a muestras reales
Agua superficial del entorno de Santiago de Compostela
n = 3
Lugar Fecha
Concentración (ng mL-1) ± desviación estándar
BTri 4-TTri 5-TTri XTri 5-ClBTri
1 Río Sarela 01/03/2012 < LOQ < LOQ < LOQ n.d. n.d.
2 Río Sar 27/03/2012 0.71 ± 0.04 0.46 ± 0.03 0.35 ± 0.04 n.d. n.d.
3 Río Sar 24/04/2012 < LOQ 0.18 ± 0.03 0.14 ± 0.00 n.d. n.d.
4 Río Sar 26/04/2012 < LOQ 0.38 ± 0.04 0.11 ± 0.01 n.d. n.d.
Frecuencia de detección (%) 100 % 100 % 100 % 0 % 0 %
Concentración máxima
(ng mL-1)
0.71 0.46 0.35 - -
18

19. Lugar Fecha
Concentración (ng mL-1) ± desviación estándar
BTri 4-TTri 5-TTri XTri 5-ClBTri
5
Influente
EDAR
11/01/2012 2.31 ± 0.04 0.47 ± 0.00 0.49 ± 0.07 n.d. n.d.
6
Efluente
EDAR
11/01/2012 0.90 ± 0.03 1.21 ± 0.00 1.52 ± 0.06 n.d. n.d.
7
Influente
EDAR
27/03/2012 2.03 ± 0.02 0.36 ± 0.00 0.39 ± 0.03 n.d. n.d.
8
Efluente
EDAR
27/03/2012 1.62 ± 0.05 1.22 ± 0.00 1.00 ± 0.05 n.d. n.d.
9*
Influente
EDAR
18/04/2012 5.93 ± 0.21 1.51 ± 0.01 1.44 ± 0.08 n.d. n.d.
10
Efluente
EDAR
18/04/2012 1.32 ± 0.05 1.82 ± 0.09 1.63 ± 0.08 n.d. n.d.
11*
Influente
EDAR
24/04/2012 0.49 ± 0.03 0.54 ± 0.02 0.48 ± 0.02 n.d. n.d.
12
Efluente
EDAR
24/04/2012 0.29 ± 0.02 0.62 ± 0.06 0.49 ± 0.04 n.d. n.d.
13*
Influente
EDAR
26/04/2012 1.58 ± 0.11 0.44 ± 0.01 0.37 ± 0.02 n.d. n.d.
14
Efluente
EDAR
26/04/2012 1.57 ± 0.11 0.81 ± 0.01 0.58 ± 0.04 n.d. n.d.
Agua residual del entorno de Santiago de Compostela
19

20. Cromatograma muestra 9:
7
x10
0
0.5
1
1.5
TIC
Tiempo (min)
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Cuentas
7
x10
0
0.5
1
1.5
TIC
Tiempo (min)
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Cuentas
20

21. Cromatograma muestra 9:
7
x10
0
0.5
1
1.5
TIC
Tiempo (min)
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Cuentas
Muestra 9
Blanco de proceso
4
x10
0
0.5
1
1.5
2
5 10 15 20 25 30 35 40
0
4-TTri
Tiempo (min)
Cuentas
5-TTri 0
1
2
77.0392
128.0490
56.9432
100.0757
134.0705
50 100 150 200
Masa/Carga (m/z)
Cuentas
x103
0
1
2
3
4
77.0392
56.9429 100.0755
50 100 150 200
Masa/Carga (m/z)
Cuentas
x103
134.0703
m/z 134,0713
4
x10
0
1
2
3
4
5
5 10 15 20 25 30 35 40
BTri
Cuentas
0
0
2
4
6
8 65.0387
94.0396
121.0502
52.0186
Masa/Carga (m/z)
50 100 150
Cuentas
x103
120.0543
m/z 120,055
Tiempo (min)
200
Cromatogramas de iones:
Ventana de masas: 50 ppm
4
x10
0
1
2
3
4
5
5 10 15 20 25 30 35 40
BTri
Cuentas
0
0
2
4
6
8 65.0387
94.0396
121.0502
52.0186
Masa/Carga (m/z)
50 100 150
Cuentas
x103
120.0543
m/z 120,0556
Tiempo (min)
200
21

22. Muestra 9 Blanco de proceso
4
x1
0
0
0.5
1
1.5
2
5 10 15 20 25 30 35 40
0
4-TTri
Tiempo (min)
Cuentas
5-TTri 0
1
2
77.0392
128.0490
56.9432
100.0757
134.0705
50 100 150 200
Masa/Carga (m/z)
Cuentas
x103
0
1
2
3
4 77.0392
56.9429 100.0755
50 100 150 200
Masa/Carga (m/z)
Cuentas
x103
134.0703
m/z 134,0713
Cromatogramas de iones:
Ventana de masas: 50 ppm
4
x10
0
1
2
3
4
5
5 10 15 20 25 30 35 40
BTri
Cuentas
0
0
2
4
6
8
65.0387
94.0396
121.0502
52.0186
Masa/Carga (m/z)
50 100 150
Cuentas
x103
120.0543
m/z 120,0556
Tiempo (min)
200
22

23. Muestra 9 Blanco de proceso
4
x10
0
0.5
1
1.5
2
5 10 15 20 25 30 35 40
0
4-TTri
Tiempo (min)
Cuentas
5-TTri 0
1
2
77.0392
128.0490
56.9432
100.0757
134.0705
50 100 150 200
Masa/Carga (m/z)
Cuentas
x103
0
1
2
3
4
77.0392
56.9429 100.0755
50 100 150 200
Masa/Carga (m/z)
Cuentas
x103
134.0703
m/z 134,0713
Cromatogramas de iones:
Ventana de masas: 50 ppm
4
x10
0
1
2
3
4
5
5 10 15 20 25 30 35 40
BTri
Cuentas
0
0
2
4
6
8 65.0387
94.0396
121.0502
52.0186
Masa/Carga (m/z)
50 100 150
Cuentas
x103
120.0543
m/z 120,0556
Tiempo (min)
200
23

24. • Estabilidad relativa de los isómeros del TTri
Fecha de muestreo Influente Efluente
11/01/2012 0.52  0.06 0.45  0.03
27/03/2012 0.46  0.09 0.52  0.01
18/04/2012 0.45  0.02 0.50  0.02
24/04/2012 0.50  0.00 0.54  0.02
26/04/2012 0.51  0.01 0.59  0.04
Promedio 0.49  0.04 0.52  0.02
► Mezcla de isómeros comercial (Dr. Ehrenstorfer): 0.69  0.01
Cocientes entre la concentración de 4-TTri y 5-TTri calculados para las muestras de
agua residual antes y después del tratamiento de depuración:
24

25. CONCLUSIONES
► Extracción mediante adsorción en polímero de PES  Bajo coste: poco volumen de
muestra, sin grandes cantidades de adsorbentes ni disolventes
► El polímero de PES proporciona una eficacia de extracción muy superior al PDMS
para compuestos de polaridad media-baja
► LOQs: 0.001-0.204 ng mL-1. Precisión: RSD < 7 %. Linealidad: LOQs-50 ng mL-1
25