1. DETERMINACIÓN DE BENZOTRIAZOLES EN MUESTRAS
DE AGUA MEDIANTE MICROEXTRACCIÓN CON
POLIETERSULFONA Y CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
ESPECTROMETRÍA DE MASAS
JORGE CASADO AGRELO
Santiago de Compostela, 21 Febrero de 2013

2. 2
• Benzotriazoles Contaminantes Emergentes
• Riesgo
• Legislación
► Tóxicos  LC50
► Cancerígenos
► Antiestrogénicos
► Elevada movilidad en el agua
► No hay normativa de EEA ni EPA
► CEE permite comercialización
INTRODUCCIÓN
► Anticongelantes
► Anticorrosivos
► Antimicrobianos

3. • Analitos en este estudio:
Patrón Interno:
Benzotriazol (BTri)
log Kow: 1.44
4-metilbenzotriazol (4-TTri)
log Kow: 1.71
5-metilbenzotriazol (5-TTri)
log Kow: 1.71
Dimetilbenzotriazol (XTri)
log Kow: 2.25
5-clorobenzotriazol (5-ClBTri)
log Kow: 2.13
4-hidroxibenzotriazol (4-OHBTri)
log Kow: 0.80
5-carboxibenzotriazol (5-CBTri)
log Kow: 1.05
Benzotriazol deuterado (BTri-d4)
3

4. • Métodos de determinación
• Métodos de preparación de muestra
► LLE
► SPE
► LC-MS
► LC-MS/MS
►Microextracción sobre PES
Q-TOF  m/z exactas  Alta Selectividad
LC-ESI-QTOF
4

5. 1. Optimización y caracterización del método de determinación LC-ESI-MS/MS
2. Optimización del proceso de preparación de muestra
3. Caracterización y validación del método propuesto
4. Aplicación a muestras reales de agua para determinar su posible contaminación
OBJETIVOS
• Desarrollar un método de preparación de muestra de bajo coste para extraer
benzotriazoles de muestras de agua
• Determinar los compuestos por LC-ESI-QTOF
5

6. • Optimización de LC-ESI-MS/MS
DESARROLLO
Agilent 1200 LC
Columna cromatográfica Zorbax SB-Phenyl
Fase estacionaria Fenilo diisopropilo
Dimensiones 100 mm x 2.1 mm (d. i.)
Tamaño de partícula 3.5 μm
Temperatura del horno 30 °C
Inyector
Volumen de inyección 10 μL
Fase móvil
Flujo 0.2 mL min-1
Fase acuosa Agua ultrapura (0.1 % ácido fórmico)
Fase orgánica Acetonitrilo (0.1 % ácido fórmico)
6

7. Agilent 6520 MS MS/MS
Modo de ionización ESI positivo ESI positivo
Voltaje de la aguja 3500 V 3500 V
Temperatura de gas de secado (N2) 330 ºC 330 ºC
Flujo de gas de secado (N2) 10 L min-1 10 L min-1
Presión de gas de nebulización (N2) 30 psi 30 psi
Iones de la disolución de referencia
m/z 121.0509
m/z 922.0098
m/z 121.0509
m/z 922.0098
Modo de adquisición Centroide Centroide
7

8. • Caracterización de LC-MS
► Repetibilidad: RSD < 5 % (25 ng mL-1)
► LOQ: 0.03 – 9.1 ng mL-1
► Linealidad: 10 – 500 ng mL-1 (R2 > 0.9984)
• Caracterización de LC-MS/MS
► Repetibilidad: RSD < 14 % (25 ng mL-1)
► LOQ: 7.7 – 26 ng mL-1
► Linealidad: 10 – 500 ng mL-1 (R2 > 0.9983)
BTri
y = 0,0402x - 0,055
R2
= 0,9998
0
5
10
15
20
25
0 100 200 300 400 500 600
Concentración (ng mL-1
)
Área
/
Área
I.
S.
BTri
y = 0,0553x + 0,0617
R2
= 0,9996
0
5
10
15
20
25
30
0 100 200 300 400 500 600
Concentración (ng mL-1
)
Área
/
Área
I.
S.
8

9. • MS
• MS/MS
0
BTri
0
0
0
0
5-ClBTri
0
Tiempo (min)
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
Cuentas
4-OHBTri
5-CBTri
4-TTri 5-TTri
XTri
x102
x102
x103
x103
x102
x104
m/z 136,0505
m/z 164,0455
m/z 120,0556
m/z 134,0713
m/z 154,0167
m/z 148,0869
0
0
XTri
0
4-TTri
0
5-CBTri
x102
0
4-OHBTri
0
Tiempo (min)
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
Cuentas
BTri
5-TTri
5-ClBTri
x102
x102
x101
x103
x103
136,0505 → 80,0495
164,0455 → 80,0495
120,0550 → 65,0386
134,0713 → 77,0386
154,0167 → 98,9998
148,0869 → 77,0386
120,0556 → 65,0386
10 ng mL-1
10 ng mL-1
9

10. • Optimización de la Microextracción
1
) 2
)
3
)
Concentrar
100 µL
Fase Móvil
Desorber
disolvente
Introducir
15 mL
muestra
Agitar
Membrana de PES
1) 2) 3) 4)
PDMS
PES
PP
Polietersulfona:
PES
10

11. Variables a priori relevantes:
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
BTri 4-TTri 5-TTri XTri 5-ClBTri
Respuesta
normalizada
pH 6 pH 2
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
BTri 4-TTri 5-TTri XTri 5-ClBTri
Respuesta
normalizada
10 mL 50 mL
0%
50%
100%
150%
200%
250%
BTri 4-TTri 5-TTri XTri 5-ClBTri
Respuesta
normalizada
0 g 2 g
No se extraen:
4-OHBTri ni
5-CBTri
pH de la muestra NaCl añadido a la muestra
Volumen de muestra
11

12. Diseño 23 + 4 puntos centrales:
► A: pH (2 – 6)
► B: % NaCl (5 – 30)
► C: Velocidad de agitación (400 – 800 rpm)
► pH: Significativo para casi todos los analitos (mejor 6), excepto para 5-ClBTri
► % NaCl: Poco significativo (mejor 30 %), excepto para BTri
► Velocidad de agitación: No significativo
BTri
0 1 2 3 4 5
AC
B
C
BC
AB
A +
-
5-ClBTri
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
AC
BC
C
A
B
AB +
-
12

13. Parámetro más importante: pH de la muestra
Desorción
Fracciones de 1.5 mL de MeOH:
0%
50%
100%
150%
200%
BTri 4-TTri 5-TTri XTri 5-ClBTri
Respuesta
normalizada
pH 2 pH 4 pH 6 pH 8
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
BTri 4-TTri 5-TTri XTri 5-ClBTri
Respuesta
normalizada
Dietiléter AcOEt MeOH
pH 4
0%
20%
40%
60%
80%
100%
BTri 4-TTri 5-TTri XTri 5-ClBTri
1ª Fracción 2ª Fracción 3ª Fracción
1.5 mL
MeOH
13

14. Tiempo de extracción:
BTri
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 5 10 15 20 25
Tiempo (horas)
Área
4-TTri
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 5 10 15 20 25
Tiempo (horas)
Área
5-TTri
0
1
2
3
4
5
0 5 10 15 20 25
Tiempo (horas)
Área
XTri
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25
Tiempo (horas)
Área
5-ClBTri
0
0,5
1
1,5
2
0 5 10 15 20 25
Tiempo (horas)
Área
6 horas
14

15. PES vs PDMS:
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
BTri 4-TTri 5-TTri XTri 5-ClBTri
Respuesta
normalizada
PES PDMS
PES: 42 μL PDMS (SBSE): 24 μL
15

16. LC-MS/MS
(inyección 10 μL)
Muestra de agua: 15 mL
pH 4
30 % NaCl (4.5 g)
Extracción con polímero: PES
5 cm
Agitación a 600 rpm
6 horas
Desorción en MeOH
1.5 mL
15 minutos
Concentración
100 μL de ACN/H2O (1:9; 0.1 % ácido fórmico)
16

17. Calibración pseudo-externa
• Caracterización del método propuesto
Diferente matriz:
► Agua superficial
► Agua residual sin tratar
► Agua residual tratada
Precisión (RSD): < 7 % (n = 5; 1 ng mL-1)
Límites de cuantificación globales (LOQ Extracción-LC-MS): 0.001 – 0.204 ng mL-1
Recuperaciones relativas al agua ultrapura: 84 – 124 %
(después de corregir con el patrón interno)
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
BTri 4-TTri 5-TTri XTri 5-ClBTri
Respeusta
normalizada
Inyección de extracto de muestra
Inyección directa de muestra
17

18. • Aplicación a muestras reales
Agua superficial del entorno de Santiago de Compostela
n = 3
Lugar Fecha
Concentración (ng mL-1) ± desviación estándar
BTri 4-TTri 5-TTri XTri 5-ClBTri
1 Río Sarela 01/03/2012 < LOQ < LOQ < LOQ n.d. n.d.
2 Río Sar 27/03/2012 0.71 ± 0.04 0.46 ± 0.03 0.35 ± 0.04 n.d. n.d.
3 Río Sar 24/04/2012 < LOQ 0.18 ± 0.03 0.14 ± 0.00 n.d. n.d.
4 Río Sar 26/04/2012 < LOQ 0.38 ± 0.04 0.11 ± 0.01 n.d. n.d.
Frecuencia de detección (%) 100 % 100 % 100 % 0 % 0 %
Concentración máxima
(ng mL-1)
0.71 0.46 0.35 - -
18

19. Lugar Fecha
Concentración (ng mL-1) ± desviación estándar
BTri 4-TTri 5-TTri XTri 5-ClBTri
5
Influente
EDAR
11/01/2012 2.31 ± 0.04 0.47 ± 0.00 0.49 ± 0.07 n.d. n.d.
6
Efluente
EDAR
11/01/2012 0.90 ± 0.03 1.21 ± 0.00 1.52 ± 0.06 n.d. n.d.
7
Influente
EDAR
27/03/2012 2.03 ± 0.02 0.36 ± 0.00 0.39 ± 0.03 n.d. n.d.
8
Efluente
EDAR
27/03/2012 1.62 ± 0.05 1.22 ± 0.00 1.00 ± 0.05 n.d. n.d.
9*
Influente
EDAR
18/04/2012 5.93 ± 0.21 1.51 ± 0.01 1.44 ± 0.08 n.d. n.d.
10
Efluente
EDAR
18/04/2012 1.32 ± 0.05 1.82 ± 0.09 1.63 ± 0.08 n.d. n.d.
11*
Influente
EDAR
24/04/2012 0.49 ± 0.03 0.54 ± 0.02 0.48 ± 0.02 n.d. n.d.
12
Efluente
EDAR
24/04/2012 0.29 ± 0.02 0.62 ± 0.06 0.49 ± 0.04 n.d. n.d.
13*
Influente
EDAR
26/04/2012 1.58 ± 0.11 0.44 ± 0.01 0.37 ± 0.02 n.d. n.d.
14
Efluente
EDAR
26/04/2012 1.57 ± 0.11 0.81 ± 0.01 0.58 ± 0.04 n.d. n.d.
Agua residual del entorno de Santiago de Compostela
19

20. Cromatograma muestra 9:
7
x10
0
0.5
1
1.5
TIC
Tiempo (min)
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Cuentas
7
x10
0
0.5
1
1.5
TIC
Tiempo (min)
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Cuentas
20

21. Cromatograma muestra 9:
7
x10
0
0.5
1
1.5
TIC
Tiempo (min)
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Cuentas
Muestra 9
Blanco de proceso
4
x10
0
0.5
1
1.5
2
5 10 15 20 25 30 35 40
0
4-TTri
Tiempo (min)
Cuentas
5-TTri 0
1
2
77.0392
128.0490
56.9432
100.0757
134.0705
50 100 150 200
Masa/Carga (m/z)
Cuentas
x103
0
1
2
3
4
77.0392
56.9429 100.0755
50 100 150 200
Masa/Carga (m/z)
Cuentas
x103
134.0703
m/z 134,0713
4
x10
0
1
2
3
4
5
5 10 15 20 25 30 35 40
BTri
Cuentas
0
0
2
4
6
8 65.0387
94.0396
121.0502
52.0186
Masa/Carga (m/z)
50 100 150
Cuentas
x103
120.0543
m/z 120,055
Tiempo (min)
200
Cromatogramas de iones:
Ventana de masas: 50 ppm
4
x10
0
1
2
3
4
5
5 10 15 20 25 30 35 40
BTri
Cuentas
0
0
2
4
6
8 65.0387
94.0396
121.0502
52.0186
Masa/Carga (m/z)
50 100 150
Cuentas
x103
120.0543
m/z 120,0556
Tiempo (min)
200
21

22. Muestra 9 Blanco de proceso
4
x1
0
0
0.5
1
1.5
2
5 10 15 20 25 30 35 40
0
4-TTri
Tiempo (min)
Cuentas
5-TTri 0
1
2
77.0392
128.0490
56.9432
100.0757
134.0705
50 100 150 200
Masa/Carga (m/z)
Cuentas
x103
0
1
2
3
4 77.0392
56.9429 100.0755
50 100 150 200
Masa/Carga (m/z)
Cuentas
x103
134.0703
m/z 134,0713
Cromatogramas de iones:
Ventana de masas: 50 ppm
4
x10
0
1
2
3
4
5
5 10 15 20 25 30 35 40
BTri
Cuentas
0
0
2
4
6
8
65.0387
94.0396
121.0502
52.0186
Masa/Carga (m/z)
50 100 150
Cuentas
x103
120.0543
m/z 120,0556
Tiempo (min)
200
22

23. Muestra 9 Blanco de proceso
4
x10
0
0.5
1
1.5
2
5 10 15 20 25 30 35 40
0
4-TTri
Tiempo (min)
Cuentas
5-TTri 0
1
2
77.0392
128.0490
56.9432
100.0757
134.0705
50 100 150 200
Masa/Carga (m/z)
Cuentas
x103
0
1
2
3
4
77.0392
56.9429 100.0755
50 100 150 200
Masa/Carga (m/z)
Cuentas
x103
134.0703
m/z 134,0713
Cromatogramas de iones:
Ventana de masas: 50 ppm
4
x10
0
1
2
3
4
5
5 10 15 20 25 30 35 40
BTri
Cuentas
0
0
2
4
6
8 65.0387
94.0396
121.0502
52.0186
Masa/Carga (m/z)
50 100 150
Cuentas
x103
120.0543
m/z 120,0556
Tiempo (min)
200
23

24. • Estabilidad relativa de los isómeros del TTri
Fecha de muestreo Influente Efluente
11/01/2012 0.52  0.06 0.45  0.03
27/03/2012 0.46  0.09 0.52  0.01
18/04/2012 0.45  0.02 0.50  0.02
24/04/2012 0.50  0.00 0.54  0.02
26/04/2012 0.51  0.01 0.59  0.04
Promedio 0.49  0.04 0.52  0.02
► Mezcla de isómeros comercial (Dr. Ehrenstorfer): 0.69  0.01
Cocientes entre la concentración de 4-TTri y 5-TTri calculados para las muestras de
agua residual antes y después del tratamiento de depuración:
24

25. CONCLUSIONES
► Extracción mediante adsorción en polímero de PES  Bajo coste: poco volumen de
muestra, sin grandes cantidades de adsorbentes ni disolventes
► El polímero de PES proporciona una eficacia de extracción muy superior al PDMS
para compuestos de polaridad media-baja
► LOQs: 0.001-0.204 ng mL-1. Precisión: RSD < 7 %. Linealidad: LOQs-50 ng mL-1
25