A simplified sample preparation method, based on the matrix solid-phase dispersion technique, is proposed for the sensitive determination of 15 organic fungicides in vineyard soils by gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS). Under final working conditions, sieved samples (0.5 g) were blended and dispersed with 2 g of C18 and transferred to a polypropylene syringe containing 1 g of diatomaceous earth.Analyteswere recovered using 10 mL of ethyl acetate, this extract was concentrated to 1 mL and fungicides determined by GC–MS, without additional cleanup. The method provided recoveries in the range from 74 to 122% for soils with total carbon contents up to 5.5% and it allowed the use of external standard as quantification technique. Inter-day precision, given as relative standard deviations, stayed between 3 and 13%, and the limits of quantification were comprised between 0.6 and 15 ng g−1. Several fungicides were found in the top layer of vineyard soils with the highest detection frequency and maximum concentration corresponding to iprovalicarb. Some real samples were also submitted to pressurized liquid extraction. Measured concentrations were in excellent agreement with those obtained by matrix solid-phase dispersion, which reinforces the accuracy of the latter methodology.

1. 1
OPTIMIZACIÓN Y APLICACIÓN DE UN
PROCEDIMIENTO DE DISPERSIÓN DE MATRIZ EN
FASE SÓLIDA (MSPD) PARA LA DETERMINACIÓN
DE FUNGICIDAS EN SUELOS
Memoria presentada para optar al Grado de Licenciatura
JORGE CASADO AGRELO
Santiago de Compostela, Marzo de 2012
FACULTAD DE QUÍMICA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICAANALÍTICA,
NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA
INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN Y ANÁLISIS
ALIMENTARIO

2. 2
• Los Pesticidas Sustancias tóxicas empleadas para impedir el
crecimiento de seres vivos considerados plagas:
• Riesgo
• Legislación
europea
► Tóxicos  LC50
► Inhibición de enzimas  Aparato reproductor
► Migración a aguas subterráneas  Manantiales
► Fenómenos de resistencia
► Niveles máximos de residuos (MRLs) de fungicidas en:
- Agua (1998)  0.1 μg L-1 (uno) y 0.5 μg L-1 (suma)
- Frutas y verduras (2005)
► 2005 Obligada formación para venta y manejo
► 2009 Prohibidos 22 pesticidas y la fumigación aérea
INTRODUCCIÓN
► Hongos (Fungicidas)
► Insectos (Insecticidas)

3. 3
• Analitos en este estudio:
Estrobilurina Fenilamina Anilinopirimidina
Hidroxianilida
Fenilpirrol Organofosforado
Dicarboximida
Carbamato
Triazol

4. 4
• Métodos de determinación
• Métodos de preparación de muestra
► SLE
► PLE
► MAE
► MSPD
► GC
► LC
► ECD
► NPD
► MS

5. 5
Avanzar en la optimización de metodologías de preparación de muestra mediante
dispersión de matriz en fase sólida, así como en la determinación de un grupo amplio
de fungicidas orgánicos e insecticidas (algunos de ellos sistémicos) en suelos de viñedo
1. Optimización del proceso de preparación de muestra mediante MSPD
2. Caracterización y validación del método propuesto
3. Aplicación a muestras de suelo de viñedo para determinar su posible
contaminación con los pesticidas considerados
Para ello se siguieron los siguientes pasos:
OBJETIVOS

6. 6
• Optimización de GC-MS
DESARROLLO
GC Varian 450-GC
Columna cromatográfica Agilent HP-5MS
Dimensiones 30 m x 0.25 mm
Espesor de la fase estacionaria 0.25 µm
Fase estacionaria 5 % difenilo, 95 % polimetilsiloxano
Inyector Split/splitless (modo PTV)
Volumen de inyección 9 μL (1 - 10 μL)
Modo
1º Split ( 0 – 0.2 min) 20 mL min-1
2º Splitless (0.2 – 4 min)
3º Split (4 min – final) 80 mL min-1
Temperatura
50º C (0 - 0.3 min)
280º C (0.3 min - final) 200º C min-1
Gas portador Helio
Flujo de gas portador 1.2 mL min-1

7. 7
Horno
Temperatura inicial 55 ºC
Tiempo inicial 1 min
Rampa 1
Gradiente 10 ºC min-1
Temperatura final 200 ºC
Rampa 2
Gradiente 5 ºC min-1
Temperatura final 250 ºC
Rampa 3
Gradiente 30 ºC min-1
Temperatura final 285 ºC
MS Varian 240-MS
Modo de ionización
Impacto electrónico
(70 eV)
Tiempo de delay 7 min
Tiempo de adquisición 7 - 36.67 min
Rango de masas (m/z) 80 - 450 a.m.u.
Temperatura de la línea de
transferencia
280º C
Temperatura de la fuente de
iones
200º C
Temperatura de la trampa de
iones
150 ºC

8. 8
• Caracterización de GC-MS
► Repetibilidad: RSD < 9.4 % (20 ng mL-1)
► Reproducibilidad: RSD < 8.6 % (40 ng mL-1)
► LOQ (10 mL): 0.3 – 3 ng mL-1
► Linealidad: 1 – 500 ng mL-1 (R2 > 0.998)
Analito Ión (m/z) Tiempo (min)
CHLOR-Me 286 17.52
MET 206 17.83
CHLOR-Et 314 18.78
CYP 224 19.49
PEN 248 19.71
PROC 283 20.17
FLUD 248 21.49
IPRO 116 + 134 21.58; 21.87
MYC 179 21.69
FLU 233 21.78
DIN 268 22.64
BEN 148 23.58
PRO 173 23.75; 23.95
FEN 177 23.86
TEB 250 24.32
DIF 323 30.75; 30.88
AZO 344 31.98
BEN
y = 2164,8x + 2448,6
R² = 0,999
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
0 100 200 300 400 500
Concentración (ng mL-1
)
Área
DIF
y = 2401,5x - 15420
R² = 0,999
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
0 100 200 300 400 500
Concentración (ng mL-1
)
Área

9. 9
0
25
50
kCuentas
0
20
40
60
0
10
20
30
40
0
50
100
150
0
20
40
0
5
10
15
20
m/z 286
m/z 206
m/z 314
m/z 224
m/z 248
m/z 283
0
10
20
30
0
10
20
m/z 248
m/z 116+134
17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5
minutos
kCuentas
kCuentas
kCuentas
kCuentas
kCuentas
kCuentas
kCuentas
CHLOR-Me
MET
CHLOR-Et
CYP
PEN
PROC
FLUD
IPRO 1
IPRO 2
0
25
50
kCuentas
0
20
40
60
0
10
20
30
40
0
50
100
150
0
20
40
0
5
10
15
20
m/z 286
m/z 206
m/z 314
m/z 224
m/z 248
m/z 283
0
10
20
30
0
10
20
m/z 248
m/z 116+134
17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5
minutos
kCuentas
kCuentas
kCuentas
kCuentas
kCuentas
kCuentas
kCuentas
CHLOR-Me
MET
CHLOR-Et
CYP
PEN
PROC
FLUD
IPRO 1
IPRO 2
0
10
20
30
40
0
50
100
1
2
3
0
50
100
150
0.0
5.0
10.0
0
2
4
6
0
5
10
15
20
0.0
5.0
10.0
0
20
40
60
m/z 179
m/z 233
m/z 268
m/z 148
m/z 177
m/z 250
m/z 323
AZO
17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5
kCuentas
kCuentas
kCuentas
kCuentas
kCuentas
kCuentas
kCuentas
kCuentas
kCuentas
MYC
FLU
DIN
BEN
PRO 2
PRO 1
FEN
TEB
DIF 1 DIF2
m/z 344
m/z 173
0
0
10
20
30
40
0
50
100
1
2
3
0
50
100
150
0.0
5.0
10.0
0
2
4
6
0
5
10
15
20
0.0
5.0
10.0
0
20
40
60
m/z 179
m/z 233
m/z 268
m/z 148
m/z 177
m/z 250
m/z 323
AZO
17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5
kCuentas
kCuentas
kCuentas
kCuentas
kCuentas
kCuentas
kCuentas
kCuentas
kCuentas
MYC
FLU
DIN
BEN
PRO 2
PRO 1
FEN
TEB
DIF 1 DIF2
m/z 344
m/z 173
0

10. 10
0
20
40
60
80
100
120
FLU DIN BEN PRO FEN TEB DIF AZO
Respuesta
normalizada
(%)
0
20
40
60
80
100
120
CHLOR-Me MET CHLOR-Et CYP PEN PROC FLUD IPRO MYC
Respuesta
normalizada
(%)
C18 Tierra de diatomeas Florisil Alúmina Sílica
• Optimización de la MSPD
Materiales de dispersión:

11. 11
Diseño 23 + 4 puntos centrales:
► A: Volumen de acetato de etilo en la elución:
10 – 15 mL
► B: Material de dispersión:
tierra de diatomeas - C18
► C: Masa de dispersante:
0.5 – 2 g
► Significativo para todos los analitos: Material dispersante (mejor C18)
► Significativo en algunos casos: Masa de dispersante (mejor 2 g)
► Significativo sólo para CHLOR-Me: Volumen de eluyente (mejor 15 mL)
CHLOR-Me
0 1 2 3 4 5 6
AB
AC
BC
A
B
C +
-
MYC
0 1 2 3 4 5 6
AC
A
AB
BC
C
B +
-
CHLOR-Me
0 1 2 3 4 5 6
AB
AC
BC
A
B
C +
-
MYC
0 1 2 3 4 5 6
AC
A
AB
BC
C
B +
-

12. 12
Adsorbentes de clean-up:
► Fase reversa: C18
► Fase normal: florisil desactivado al 5 %
► Inerte: tierra de diatomeas
C18
Florisil desactivado 5 %
5 10 15 20 25 30 minutos
5 10 15 20 25 30
0
100
200
300
400
500
600
700
800
kCuentas
Tierra de diatomeas
minutos
0
100
200
300
400
500
600
700
800
kCuentas

13. 13
0
20
40
60
80
100
120
FLU DIN BEN PRO FEN TEB DIF AZO
Recuperación
normalizada
(%)
0
20
40
60
80
100
120
CHLOR-Me MET CHLOR-Et CYP PEN PROC FLUD IPRO MYC
Recuperación
normalizada
(%) DCM ACN AcOEt
Disolvente de extracción:
Volumen de extractante: 10 mL

14. 14
0,5 g de suelo
Dispersión con 2 g de C18
Cartucho:
• Frita de polietileno
• Dispersión
• 1 g de tierra de diatomeas
• Frita de polietileno
1. Elución: 10 mL acetato de etilo
2. Concentración: 1 mL
GC-MS
(inyección 9 μL)
0,5 g de suelo
Dispersión con 2 g de C18
Cartucho:
• Frita de polietileno
• Dispersión
• 1 g de tierra de diatomeas
• Frita de polietileno
1. Elución: 10 mL acetato de etilo
2. Concentración: 1 mL
GC-MS
(inyección 9 μL)

15. 15
Calibración
externa
• Caracterización del método propuesto
► Diferentes niveles de adición: 40 – 600 ng/g
► Diferente contenido de carbono total: 1.8 – 5.5 %
Precisión (RSD):
► Intra-day: < 14.0 % (n = 6) ► Inter-day: < 15.5 % (n = 9)
Límites de cuantificación globales (LOQs): 0.6 – 15 ng g-1
Recuperaciones cuantitativas: 84 – 111 %
0
20
40
60
80
100
120
CHLOR-Me MET PROC FLUD BEN
Recuperación
(%)
TC 1,8% TC 4,2% TC 5,5%

16. 16
• Aplicación a muestras reales
Suelos de viñedo de la denominaciones geográficas de Rías Baixas y Ribeiro
ng g-1 n = 3
Código Punto de
muestreo
Mes de
muestreo
Concentración (ng g-1) ± desviación estándar
IPRO CHLOR-Et TEB FLU BEN
1 A Mayo 732 ± 50
2 A Junio 273 ± 30
2* A Junio 289 ± 21
3 A Septiembre 31 ± 7
8 E Mayo 81 ± 3
9 E Septiembre 173 ± 7 17 ± 1
11 G Junio 2491 ± 110 808 ± 19
12 G Julio 937 ± 42 869 ± 204
13 G Agosto 201 ± 14 428 ± 44
14 G Septiembre 83 ± 9 99 ± 14
15 H Junio 2855 ± 199 79 ± 7
17 J Agosto 116 ± 17
21 N Septiembre 63 ± 4 31 ± 3 446 ± 25
* Preparación de muestra mediante PLE

17. 17
Código Punto de
muestreo
Mes de
muestreo
Concentración (ng g-1) ± desviación estándar
MET MYC CYP FLUD PEN PROC
4 B Mayo 1374 ± 25
4* B Mayo 1436 ± 35
5 C Mayo 34.3 ± 0.1 59 ± 1 1845 ± 80
5* C Mayo 34.8 ± 0.3 53 ± 5 1701 ± 11
6 D Mayo 912 ± 179
7 D Julio 109 ± 10
10 F Junio 501 ± 22
15 H Junio 42 ± 2
16 I Junio 243 ± 3 36 ± 5 51 ± 2
18 K Agosto 733 ± 49 415 ± 11 636 ± 24
19 L Septiembre 82 ± 6
20 M Agosto 156 ± 8 1379 ± 21
21 N Septiembre 118 ± 8
22 O Septiembre 1499 ± 8
* Preparación de muestra mediante PLE
ng g-1 n = 3

18. 18
Cromatograma muestra 18:
5 10 15 20 25 30 35
minutos
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
MCuentas
5 10 15 20 25 30 35
minutos
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
MCuentas
CYP
m/z 224
5 10 15 20 25 30 35
minutos
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
MCuentas
TIC
5 10 15 20 25 30 35
minutos
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
MCuentas
5 10 15 20 25 30 35
0
50
100
150
200
250
300
350
MET
m/z 206
5 10 15 20 25 30 35
minutos
0
50
100
150
200
250
300
350
kCuentas
5 10 15 20 25 30 35
minutos
0
100
200
300
400
500
600
700
FLUD
m/z 248
5 10 15 20 25 30 35
minutos
0
100
200
300
400
500
600
700
kCuentas
100 200 300 400 m/z
0%
25%
50%
75%
100%
91.2
105.2
132.2
146.2
160.2
162.2
174.0
192.1
206.1
220.0
233.9
247.0
248.8
100 200 300 400 m/z
0%
25%
50%
75%
100%
91.2
105.2
132.2
146.2
160.2
162.2
174.0
192.1
206.1
220.0
233.9
247.0
248.8
100 200 300 400
m/z
0%
25%
50%
75%
100%
127.2
128.1
153.2
154.2
182.1
248.0
249.0
100 200 300 400
m/z
0%
25%
50%
75%
100%
127.2
128.1
153.2
154.2
182.1
248.0
249.0
100 200 300 400 m/z
0%
25%
50%
75%
100%
210.7
224.3
225.1
100 200 300 400 m/z
0%
25%
50%
75%
100%
100 200 300 400 m/z
0%
25%
50%
75%
100%
210.7
224.3
225.1

19. 19
Analito
Frecuencia de
aparición (%)
Concentración
máxima (ng g-1
)
MET 33% 1436
CHLOR-Et 13% 2491
CYP 20% 415
PEN 27% 1845
PROC 20% 1499
FLUD 20% 636
IPRO 33% 2855
MYC 7% 109
FLU 13% 79
BEN 7% 446
TEB 7% 869
► MET, IPRO y PEN: fungicidas
sistémicos frente a oidio y mildiu.
Encontrados en muestras de mayo –
junio
► FLUD y CYP: combaten la
podredumbre gris (aplicación a final
del verano).
Encontrados en muestras de mayo
(campaña anterior  Persistencia)

20. 20
• Persistencia
Viña A Viña G
Viña G
IPRO
0
200
400
600
800
1000
Mayo Junio Septiembre
Concentración
(ng/g)
CHLOR-Et
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Junio Julio Agosto Septiembre
Concentración
(ng/g)
TEB
0
200
400
600
800
1000
1200
Junio Julio Agosto Septiembre
Concentración
(ng/g)

21. 21
CONCLUSIONES
► MSPD excelente método de preparación de muestra  Evita excesiva manipulación
sin implicar el uso de equipos de elevado coste de adquisición.
► Método aplicable a suelos con diferentes características y con distinto contenido de
materia orgánica.
► LOQs: 0.6-15 ng g-1. Precisión: RSD< 12.1 %. Linealidad: LOQs-500 ng mL-1.