1. LA COMUNICAZIONE CELLULARE: SEGNALAZIONE CELLULARE E TRASDUZIONE DEL SEGNALE

4. L’ADATTAMENTO FUNZIONALE AD NUOVA SITUAZIONE AMBIENTALE E’ POSSIBILE PERCHE’ GLI ORGANISMI (COSTITUITI DA CELLULE) POSSIEDONO MECCANISMI MOLECOLARI IN GRADO DI “AVVERTIRE” IL CAMBIAMENTO E AVVIARE RISPOSTE CELLULARI ADEGUATE

5. Una risposta cellulare specifica può essere determinata dalla presenza di mediatori chimici (ormoni o altre molecole), dall’interazione con altre cellule (contatto cellula-cellula) o con strutture extracellulari (lamina basale o matrice extracellulare) Attivazione Enzimi Specifici Cambiamento nell’organizzazione del citoscheletro Cambiamento nella permeabilità agli ioni Attivazione sintesi del DNA e RNA Matrice Extracellulare Sito di contatto cellula-cellula Citoscheletro

6. Il controllo dell’attività cellulare tramite mediatori chimici può avvenire con meccanismo endocrino, paracrino o autocrino. Il controllo attraverso contatto cellula-cellula o cellula-lamina è dovuto alla presenza di proteine sulla membrana plasmatica o nelle strutture extracellulare

12. Amplificazione

13. Cascata di segnali Ligando Recettore Regolazione del metabolismo Modulazione Regolazione dell’espressione genica Riorganizzazione del citoscheletro Amplificazione Divergenza

26. Molti mediatori interagiscono con recettori posti sulla membrana cellulare e innescano una serie di reazioni chimiche (trasduzione del segnale) che portano alla formazione di un mediatore citoplasmatico (secondo messaggero) in grado di attivare la risposta cellulare specifica.

27. Famiglie di recettori

28. Le tre classi più grandi di recettori di superficie sono recettori collegati a canali ionici, a proteine G e a enzimi Sono coinvolti nella segnalazione Sinaptica rapida fra cellule eccitabili elettricamente Agiscono indirettamente nella regolazione dell’attività di una proteina bersaglio separata legata alla membrana (enzima o canale ionico) Quando sono attivati, o agiscono direttamente come enzimi o sono Direttamente associati ad enzimi che attivano

30. Altri recettori di membrana possiedono direttamente una funzione enzimatica in grado di formare il messaggero intracellulare, come il recettore per l’insulina

31. Alcuni recettori di membrana non attivano direttamente la risposta cellulare, ma un’altra proteina di membrana, denominata proteina G, la quale attiva un effettore, direttamente legato alla formazione del secondo messaggero (es. adenilato ciclasi)

32. RECETTORI ASSOCIATI A PROTEINE G

33. La subunità alfa viene liberata col suo GTP legato, e si muove lungo la membrana finché trova l'enzima adenilil ciclasi. La piccola catena alfa si lega all'enzima e lo attiva. L'adenilil ciclasi attivato produce molto AMP ciclico che diffonde il segnale all'interno della cellula. Infine, il GTP nella subunità alfa attiva si rompe formando GDP, così la proteina G si può ricostruire per unione dei due frammenti che producono la forma trimera inattiva, pronta per eseguire un altro ciclo.

34. LE VIE DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE SI BASANO SU PROTEIN-CHINASI E FOSFATASI CHE ATTIVANO PROTEINE TRAMITE L’AGGIUNTA O ELIMINAZIONE DI GRUPPI FOSFATO LA RISPOSTA CELLULARE INIZIA GENERALMENTE CON L’ATTIVAZIONE DI PROTEINE CHIAVE. UNO DEI MECCANISMI PRINCIPALI DI ATTIVAZIONE/INIBIZIONE PROTEICA NELLA TRASDUZIONE DEL SEGNALE È BASATO SUL GRADO DI FOSFORILAZIONE O DEFOSFORILAZIONE DELLA PROTEINA STESSA GLI ENZIMI CHE AGGIUNGONO GRUPPI FOSFATO SONO CHIAMATI PROTEIN-CHINASI, MENTRE GLI ENZIMI CHE ELIMINANO GRUPPI FOSFATO SONO DETTI FOSFORILASI

35. Signalling mediante recettori accoppiati a proteine G recettore t s q i G proteina cAMP Ca 2+ messaggero intracellulare enzima canale effettore

37. Recettori 7TM Il 50% dei farmaci sono attivi su questi recettori (di questi il 25% dei 200 farmaci più usati) Sono state identificate 6 famiglie di questi recettori e di queste le prime 3 sono ben studiate.

43. Proteine G

44. Il genoma umano contiene: 20 geni che codificano per subunità  5 geni per subunità  6 geni per subunità  In teoria almeno 1000 combinazioni diverse. Amplificazione e diversificazione del segnale Proteine G

46. Famiglie di proteine G

48. I bersagli dei componenti dissociati delle proteina G sono enzimi (adenilato ciclasi, fosfolipasi ) o canali ionici che trasmettono in avanti il segnale

49. Attivazione proteine G

51. Un solo tipo di segnale extracellulare (adrenalina) può attivare vie multiple di segnalazione e quindi influenzare più aspetti del comportamento cellulare. 1) tipo di recettore 2) tipo di proteine G (Gs o Gi) a cui è accoppiato il recettore 3) bersagli enzimatici attivati nella cellula

52. G s vs. G i Regolazione dell’attività dell’adenilato ciclasi G s stimola adenilato ciclasi G i inibisce adenilato ciclasi L’adrenalina causa aumento o riduzione dei livelli intracellulari di cAMP, In funzione del recettore al quale si lega recettori  adrenergici sono accoppiati a G s , mentre recettori  2 adrenergici sono accoppiati a G i

54. I bersagli dei componenti dissociati delle proteina G sono enzimi (adenilato ciclasi, fosfolipasi ) o canali ionici che trasmettono in avanti il segnale

55. La subunità alfa viene liberata col suo GTP legato, e si muove lungo la membrana finché trova l'enzima adenilil ciclasi. La piccola catena alfa si lega all'enzima e lo attiva. L'adenilil ciclasi attivato produce molto AMP ciclico che diffonde il segnale all'interno della cellula. Infine, il GTP nella subunità alfa attiva si rompe formando GDP, così la proteina G si può ricostruire per unione dei due frammenti che producono la forma trimera inattiva, pronta per eseguire un altro ciclo.

56. AMP CICLICO CALCIO La fosfolipasi attivata taglia PI(4,5)P2 generando due prodotti: inositolo 1,4,5-trifosfato (IP3) e diacilglicerolo.

57. L’adenosin mono- fosfato ciclico (cAMP), che viene formato a partire dall’ATP, è un esempio di secondo messaggero molto utilizzato nelle cellule. Il cAMP attiva diverse chinasi in grado di iniziare processi cellulari differenti

58. La formazione di cAMP a partire dall’ATP è catalizzata dall’enzima adenilato ciclasi, presente nella membrana plasmatica. Questo enzima viene attivato solo dopo il legame del recettore con un mediatore chimico spacifico

59. REAZIONE CATALIZZATA DALL’ADENILATO CICLASI SECONDO MESSAGGERO cAMP SECONDO MESSAGGERO cGMP REAZIONE CATALIZZATA DALLA GUANILATO CICLASI

60. IP3 è una piccola molecola solubile in acqua che lascia la membrana plasmatica e diffonde rapidamente nel citosol, dirigendosi verso il ER dove si lega a recettori per IP3. Questo recettore è un canale tetramerico del Ca++ Diacilglicerolo resta immerso nella membrana e va ad attivare una proteina chinasi C (PKC), Calcio-dipendente. L’aumento di Ca++ citosolico indotto da IP3 è essenziale per l’attivazione di PKC. PKC attivata fosforila proteine bersaglio tesuto-specifiche.La PKC svolge ruoli importanti nella crescita, differenziamento,metabolismo, attivazione della trascrizione.

61. PIP2: PHOSPHATIDYLINOSITOL 4,5-BIPHOSPHATE Hydrolysis of PIP2 is activated by different PLC, stimulated either by G-protein or protein tyrosine kinase. DAG: Diacylglycerol activates the protein kinase C family, that play a crucial role in cell growth and differentiation.

63. Amplificazione

64. TRASLOCAZIONE DELLA PKA NEL NUCLEO

65. Calcio – il messaggero universale Il Ca 2+ è mantenuto ad una concentrazione estremamente bassa nel citosol (a causa della sua tossicità), tuttavia la concentrazione del Ca 2+ è alta fuori dalla cellula e all’interno di alcuni organelli L’apertura rapida e transitoria di canali permette al Ca 2+ di fluire nel citosol seguendo il suo gradiente di concentrazione e costituisce la base di un sistema di signalling ubiquitario Un’ipotesi suggerisce che la frequenza di ‘spikes’ di Ca 2+ rapidamente oscillanti codifica informazioni segnale-specifiche

66. PLC DAG PKC Calcio – il messaggero universale L’IP 3 si lega al recettore per l’IP 3 sul reticolo endoplasmatico e apre un canale del Ca 2+ (che fa parte del recettore) L’attivazione della PLC porta alla formazione di IP 3 solubile in acqua Il Ca 2+ rilasciato dal RE si lega alle Calmoduline permettendole di interagire con altre proteine e attivarle La Calmodulina può attivare pompe del Ca 2+ del reticolo endoplasmatico abbassando la [Ca 2+ ] citosolico La Calmodulina può attivare pompe del Ca 2+ sulla membrana plasmatica abbassando la [Ca 2+ ] citosolico La Calmodulina attiva una vasta gamma di proteine p.es chinasi calmodulina-dipendenti kinasi

68. Le proteine G sono bersagli di alcune tossine importanti dal punto di vista medico. La tossina colerica , prodotta dal batterio che causa il colera. IPERSTIMOLAZIONE DELLE PROTEINE G O INIBIZIONE DELLE PROTEINE G La tossina della pertosse , prodotta dal batterio che causa la pertosse.

69. Come una singola cellula riesce a mostrare risposte specifiche a segnali multipli? Proteine di supporto: -facilitano l’interazione dei recettori con i propri effettori -assicurano la specificità nella attivazione delle vie di trasduzione del segnale -confinano il processo di segnalazione in una specifica regione della cellula. Adaptor/scaffolding proteins

71.  -arrestina. Disaccoppia il recettore a serpentina dalla sua proteina G . Lega enzimi della cascata delle MAP-chinasi, facilitando alcuni processi di segnalazione

72. La possibilità di spegnere le vie di trasduzione del segnale è per la cellula una funzione tanto cruciale quanto la capacità di accenderle

74. Il legame recettore-ormone spesso provoca la rapida attenuazione della responsività recettoriale (DESENSITIZZAZIONE) 3. down-regulation dei recettori totali a seguito della ridotta sintesi di mRNA e di proteina, o della degradazione lisosomiale 2. internalizzazione del recettore 1. disaccoppiamento recettore-proteine G in risposta alla fosforilazione del recettore Desensitizzazione recettoriale

75. 1. Il sistema più rapido di desensibilizzazione: il disaccoppiamento recettore-proteine G in risposta alla fosforilazione del recettore tramite PKA e/o PKC (desensibilizzazione eterologa) PKC PKA       AC PLC  P P

77. 7 geni codificano per GRK (G protein-coupled receptor Kinase) : GRK1 è nota come rodopsina chinasi GRK2 è la chinasi del recettore  -adrenergico 4 geni codificano per arrestine: 2 arrestine sono espresse esclusivamente nella retina 2 arrestine sono pressocchè ubiquitarie

78. Funzioni della  -arrestina -Disaccoppia il recettore da proteina G -Interazione con numerose proteine segnale: c-Src enzimi della cascata delle MAP-chinasi, facilitando alcuni processi di segnalazione -Internalizzazione del recettore mediante endocitosi dipendente da clatrina -Ubiquitinazione del recettore

80. Biochem.J. (2003) 375, 503-51 La  -arrestina interagendo con proteine diverse guida il destino del recettore, favorendo l’intenalizzazione, il riciclo o la degradazione

81. Spegnimento della subunità  della proteina G La subunita   è dotata di una attività GTPasica intrinseca: idrolizza GTP a GDP e Pi e si riassocia alle subunità  per riformare la proteina G inattiva

82. Spegnimento della subunità  della proteina G

84. Recettori accoppiati ad enzimi Tirosin kinasi

85. Un esempio di recettori enzimatici è rappresentato dai recettori tirosin chinasici (RTK), presenti sulla membrana nella forma monomerica inattiva. Il legame del recettore con almeno due RTK permette la formazione del dimero attivo, in grado di aggiungere gruppi fosfato ai residui di tirosina presenti nel segmento citoplasmatico dei RTK. Le tirosine fosforilate vengono riconosciute da molecole citoplasmatiche specifiche, che vengono a loro volta attivate

87. Un esempio molto importante di recettori RTK è rappresentato dai recettori di molti fattori di crescita, come EGF e PDGF. In questo caso, la fosforilazione dei residui tirosinici determina l’attivazione della proteina RAS, una proteina estremamente importante nel controllo della proliferazione cellulare.

88. LA PROTEINA RAS E’ UNA PROTEINA G MONOMERICA CHE TRASDUCE IL SEGNALE DI MOLTI RTK PER ORMONI DI CRESCITA (egf, pdgf)

89. L’ATTIVAZIONE DI RAS PORTA ALL’ATTIVAZIONE DELLA VIA MAP CHINASICA (Mitogen Activated Protein Kinases)

90. Chinasi a cascata ras raf raf Mek1 Erk1 ras Mek1 ATP Erk1 GTP GDP Nucleo P P ATP ADP Erk1 ATP ADP ADP P P P Il legame del fattore di crescita epidermico al suo recettore attiva ras Ras attiva la chinasi serina/treonina raf Raf fosforila e attiva lqa chinasi Mek-1 Mek-1 fosforila la chinasi serina/treonina Erk-1 che migra nel nucleo Erk-1 fosforila il fattore di trascrizione myc e attiva la trascrizione di cicline D ed A

91. Chinasi a cascata La cascata raf Mek-1 Erk-1 è un esempio di MAP chinasi a cascata. È stato descritto un certo numero di queste cascate, e sebbene utilizzino chinasi specifiche, le catene di trasduzione sono molto simili… MAP chinasi chinasi chinasi MAP chinasi chinasi MAP chinasi Fattore di Crescita Stress Citochine Chinasi Serina/treonina Chinasi Serina/treonina N.B. La modalità di attivazione della prima chinasi della cascata varia e dipende dal segnale raf Erk1 Mek1 ATP ADP ATP ADP Mekk1 Jnk1 MKK4 ATP ADP ATP ADP MLK3 Jnk2 MKK7 ATP ADP ATP ADP

92. Oltre a Grb2 altre proteine come PI3K e fosfolipasiC presentano i domini SH e possono legarsi a recettori tirosin chinasici

93. Un singolo segnale può attivare diverse vie ras raf ras GTP PLC  DAG PKC Effetti multipli p.es. Differenziamento Proliferazione Cascata delle MAP chinasi Il legame del fattore di crescita epidermica al suo recettore attiva la via delle MAP chinasi attraverso ras Il legame del fattore di crescita epidermica al suo recettore attiva la fosfolipasi C  (PLC  ) portando alla produzione di diacilglicerolo (DAG) e all’attivazione della protein chinasi C (PKC)

95. SEGNALAZIONE DEL RECETTORE PER L’INSULINA Oltre agli effetti sul metabolismo del glucosio, l’insulina è anche un potente stimolatore della sintesi dei lipidi (negli adipociti), della sintesi proteica e della crescita e proliferazione cellulare.

96. L’interazione fra recettore e proteine IRS -1 o IRS-2 fosforilate, determina l’interazione con proteine diverse aventi in comune una sequenza simile di aminoacidi, detta dominio SH2 come le proteine chinasi PI(3)K, Grb2, attivando le vie di segnalazione. Il recettore per l’insulina è costituito una catena  e da una catena  , legate da ponti disolfuro. Il legame con il ligando attiva la fosforilazione del recettore e dei Substrati Recettori per l’Insulina (IRS).

97. Gli ISR fosforilati sono a loro volta in grado di legarsi a proteine diverse aventi in comune una sequenza simile di aminoacidi, detta dominio SH2 Motivo fosfotirosinico Dominio SH2 di una proteina che si lega al recettore ISR

99. Impiego di composti che si degradano in ossido nitrico per il trattamento dell’angina

102. Per capire come un segnale cellulare possa essere trasmesso attraverso l’interazione cellula-cellula o cellula-matrice extracellulare, basta ricordare che tali rapporti richiedono sempre la partecipazione di specifiche proteine di membrana, in grado di sostenere l’organizzazione della connessione tra cellule o della matrice extracellulare. Le integrine sono una famiglia di proteine di membrana che si legano a componenti della matrice extracellulare come la fibronectina ed il collagene, trasmettendo il segnale dall’esterno all’interno della cellula.

103. La proteina integrina, è in grado di modificare la propria struttura tridimensionale nei punti in cui la matrice extracellulare o le connessioni tra cellule subiscono alterazione, attivando un segnale intracelluare che influenza molti aspetti del comportamento cellulare come il differenziamento, la mobilità, la crescita, la sopravvivenza stessa.

104. Le modificazioni conformazionali successive al legame della integrina a collagene o fibronectina, determinano l’interazione con molecole quali Talina e  –Actinina che determinano il collegamento con componenti del citoscheletro. I domini citoplasmatici delle integrine sono associati anche a protein chinasi come FAK (chinasi delle adesioni Focali) e Src. La loro attivazione, conseguente all’interazione fra integrine e ligandi extracellulari, attiva la cascata di reazioni che trasmettono i segnali attraverso la cellula.

105. Analogamente, una modificazione della struttura tridimensionale della proteina integrina può determinare l’attivazione di un secondo messaggero in grado di iniziare la sintesi di nuove proteine, come miosina ed actina.

106. Anche le caderine (Ca++ -aderine) (recettori adesivi che mediano il riconoscimento e l’adesione cellula-cellula, insieme alle CAM Cell Adhesion Molecules) generano segnali intracellulari in risposta all’adesione fra cellule. In questo caso è la B catenina e svolgere un ruolo fondamentale. La B catenina è una proteina ponte che collega l’actina del citoscheletro alla caderina, ma può anche legarsi un fattore di trascrizione (LEF1) e traslocare nel nucleo. La formazione di legami fra cellule favorisce l’associazione B catenina alla caderina, inibendo l’interazione con LEF1.

110. Le varie vie di trasmissione del segnale interagiscono reciprocamente, mettendo in grado le cellule di produrre una risposta adatta a una combinazione di segnali complessa. Alcune combinazioni significano per la cellula che deve continuare a vivere, altri che deve riprodursi; in presenza di segnali apoptotici le cellule si suicidano