1. UNIVERSIDAD
AUTÓNOMA
DE
NUEVO
LEÓN
FACULTAD
DE
CIENCIAS
BIOLÓGICAS
INSTITUTO
DE
BIOTECNOLOGÍA
Construcción
de
un
modelo
in
silico
de
la
interacción
entre
el
factor
de
trascripción
Brn3a
y
la
región
promotora
URR
de
la
variante
16
del
Virus
del
papiloma
humano
en
un
contexto
de
terapia
génica
contra
el
Cáncer
de
Cérvix
TESIS
QUE
PRESENTA
JAVIER
ALEJANDRO
RENDÓN
CARRILLO
TESIS
COMO
REQUISITO
PARA
OBTENER
EL
TÍTULO
PROFESIONAL
DE:
LICENCIADO
EN
BIOTECNOLOGÍA
GENÓMICA
San
Nicolás
de
los
Garza,
N.L.
2
de
Junio
del
2014
RC-­‐07-­‐026
REV.00-­‐09/06

2. II
CONSTRUCCIÓN
DE
UN
MODELO
IN
SILICO
DE
LA
INTERACCIÓN
ENTRE
EL
FACTOR
DE
TRASCRIPCIÓN
BRN3A
Y
LA
REGIÓN
PROMOTORA
URR
DE
LA
VARIANTE
16
DEL
VIRUS
DEL
PAPILOMA
HUMANO
EN
UN
CONTEXTO
DE
TERAPIA
GÉNICA
CONTRA
EL
CÁNCER
DE
CÉRVIX
TESIS
PRESENTADA
COMO
REQUISITO
PARA
OBTENER
EL
TÍTULO
PROFESIONAL
DE:
LICENCIADO
EN
BIOTECNOLOGÍA
GENÓMICA
JAVIER
ALEJANDRO
RENDÓN
CARRILLO
APROBADA:
COMISIÓN
DE
EXAMEN:
DR.
JOSÉ
MARÍA
VIADER
SALVADÓ
________________________________
PRESIDENTE
M.C.
JOSÉ
CLAUDIO
MORENO
ROCHA
________________________________
SECRETARIO
DRA.
MARTHA
GUERRERO
OLAZARÁN
________________________________
VOCAL
DR.
JUAN
ANTONIO
GALLEGOS
LÓPEZ
________________________________
SUPLENTE
RC-­‐07-­‐026
REV.00-­‐09/06

3. III
CONSTRUCCIÓN
DE
UN
MODELO
IN
SILICO
DE
LA
INTERACCIÓN
ENTRE
EL
FACTOR
DE
TRASCRIPCIÓN
BRN3A
Y
LA
REGIÓN
PROMOTORA
URR
DE
LA
VARIANTE
16
DEL
VIRUS
DEL
PAPILOMA
HUMANO
EN
UN
CONTEXTO
DE
TERAPIA
GÉNICA
CONTRA
EL
CÁNCER
DE
CÉRVIX
TESIS
PRESENTADA
COMO
REQUISITO
PARA
OBTENER
EL
TÍTULO
PROFESIONAL
DE:
LICENCIADO
EN
BIOTECNOLOGÍA
GENÓMICA
JAVIER
ALEJANDRO
RENDÓN
CARRILLO
APROBADA:
COMISIÓN
DE
TESIS:
DR.
JOSÉ
MARÍA
VIADER
SALVADÓ
________________________________
DIRECTOR
M.C.
JOSÉ
CLAUDIO
MORENO
ROCHA
________________________________
CO-­‐DIRECTOR
DRA.
MARTHA
GUERRERO
OLAZARÁN
________________________________
SECRETARIO
DR.
JUAN
ANTONIO
GALLEGOS
LÓPEZ
________________________________
SUPLENTE
RC-­‐07-­‐026
REV.00-­‐09/06

4. IV
CONSTRUCCIÓN
DE
UN
MODELO
IN
SILICO
DE
LA
INTERACCIÓN
ENTRE
EL
FACTOR
DE
TRASCRIPCIÓN
BRN3A
Y
LA
REGIÓN
PROMOTORA
URR
DE
LA
VARIANTE
16
DEL
VIRUS
DEL
PAPILOMA
HUMANO
EN
UN
CONTEXTO
DE
TERAPIA
GÉNICA
CONTRA
EL
CÁNCER
DE
CÉRVIX
TESIS
PRESENTADA
COMO
REQUISITO
PARA
OBTENER
EL
TÍTULO
PROFESIONAL
DE:
LICENCIADO
EN
BIOTECNOLOGÍA
GENÓMICA
JAVIER
ALEJANDRO
RENDÓN
CARRILLO
APROBADA:
COMISIÓN
DE
TESIS:
DR.
JOSÉ
MARÍA
VIADER
SALVADÓ
________________________________
DIRECTOR
M.C.
JOSÉ
CLAUDIO
MORENO
ROCHA
________________________________
CO-­‐DIRECTOR
RC-­‐07-­‐026
REV.00-­‐09/06

5. V
ÍNDICE
V.
Dedicatoria
..................................................................................................................
VII
VI.
Agradecimientos
.........................................................................................................
VIII
VII.
Lista
de
abreviaturas
.....................................................................................................
IX
VIII.
Lista
de
tablas
................................................................................................................
X
IX.
Lista
de
figuras
............................................................................................................
XII
X.
Resumen
...................................................................................................................
XIV
1.
Introducción
...................................................................................................................
1
2.
Importancia
....................................................................................................................
2
3.
Hipótesis
........................................................................................................................
3
4.
Objetivos
........................................................................................................................
3
4.1
Objetivo
general:
................................................................................................................
3
4.2
Objetivos
específicos:
.........................................................................................................
3
5.
Antecedentes
.................................................................................................................
3
5.1
Epidemiología
y
etiología
del
cáncer
cérvicouterino
..........................................................
3
5.2
Brn3a
y
el
desarrollo
del
CaCu
mediante
la
regulación
del
VPH
........................................
5
5.3
Sitios
de
unión
de
los
homeodominios
...............................................................................
6
5.4
Reconocimiento
específico
de
una
secuencia
de
ADN
por
los
dominios
POU
...................
7
5.5
Predicción
de
la
estructura
tridimensional
de
una
proteína
..............................................
9
5.5.1
Modelaje
por
homología
...........................................................................................
10
5.5.2
Modelaje
por
reconocimiento
de
plegamientos
........................................................
11
5.5.3
Modelaje
por
predicción
Ab-­‐initio
.............................................................................
11
6.
Metodología
................................................................................................................
12
6.1
Materiales
y
equipo
..........................................................................................................
12
6.2
Estrategia
General
............................................................................................................
12
6.3
Construcción
y
validación
de
la
estructura
tridimensional
de
la
proteína
Brn3a
............
13
6.4
Construcción
y
validación
del
modelo
tridimensional
de
interacción
de
la
estructura
tridimensional
de
Brn3a
con
la
región
URR
de
tres
subtipos
de
VPH-­‐16
..........................
13
6.4.1
Construcción
del
modelo
tridimensional
de
interacción
Brn3a
con
la
región
URR
de
VPH-­‐16
..........................................................................................................................
13
6.4.2
Determinación
de
la
energía
del
complejo
proteína-­‐ADN
............................................
14
6.5
Optimización
y
cálculo
de
la
energía
de
interacción
de
los
modelos
tridimensionales
de
interacción
de
Brn3a
con
los
tres
subtipos
de
VPH-­‐16
.....................................................
14
7.
Resultados
...................................................................................................................
15
7.1
Construcción
y
validación
de
la
estructura
tridimensional
de
la
proteína
Brn3a.
...........
15
7.2
Construcción
y
validación
del
modelo
tridimensional
de
interacción
de
la
estructura
tridimensional
de
Brn3a
con
la
región
URR
de
tres
subtipos
de
VPH-­‐16
..........................
19
7.2.1
Construcción
del
modelo
tridimensional
de
interacción
Brn3a
con
la
región
URR
de
VPH-­‐16
.......................................................................................................................
19
7.2.2
Determinación
de
la
energía
del
complejo
proteína-­‐ADN
.........................................
27
7.2.3
Optimización
y
cálculo
de
la
energía
de
interacción
de
los
modelos
tridimensionales
de
interacción
de
Brn-­‐3a
con
los
tres
subtipos
de
VPH-­‐16
en
forma
de
logo.
............
33

6. VI
8.
Discusión
......................................................................................................................
36
9.
Literatura
citada
...........................................................................................................
40

7. VII
DEDICATORIA
Con todo mi cariño y mi amor para las personas que
hicieron todo en la vida para que yo pudiera lograr
mis sueños, por motivarme y darme la mano cuando
sentía que el camino se terminaba, a ustedes por
siempre mi corazón y mi agradecimiento.
A mi madre y padre.
Sapere aude.

8. VIII
AGRADECIMIENTOS
Agradezco
por
este
trabajo
en
primer
lugar:
a
mis
padres
por
todo
su
apoyo
para
finalizar
la
licenciatura,
asimismo
al
Doctor
José
Ma.
Viader
Salvadó
por
permitirme
terminar
este
proyecto
&
al
M.C.
José
Claudio
Rocha
Moreno.
Un
agradecimiento
muy
especial
a
la
Dra.
Elisa
Shaefer
Satu
por
su
asesoría
personal
en
programación,
instalación
y
ejecución
del
software
necesario
para
la
implementación
del
trabajo.
Se
agradece
al
Centro
Nacional
de
Supercómputo
(CNS)
del
IPICYT,
A.C.
por
los
recursos
de
Supercómputo
proporcionados
asignados,
los
cuales
se
enlistan
a
continuación:
Thubat
Kaal.
Agradezco
por
igual
a
mis
amigos
Marco,
Aracely
y
muy
especialmente
a
Laura
por
todo
el
apoyo
para
poder
continuar
con
el
presente
proyecto
y
concluirlo
a
pesar
de
todos
los
inconvenientes
y
retos
técnicos
que
presento.

9. IX
LISTA
DE
ABREVIATURAS
ARN
Ácido
ribonucleico
°C
Grados
Celsius
CaCu
Cáncer
Cérvicouterino
ADN
Ácido
desoxirribonucleico
et
al.
Et
alii
(y
colaboradores)
g
Gramos
h
Horas
K
Grados
Kelvin
kb
Kilobase=mil
pares
de
bases
kDa
Kilodaltones
M
Concentración
Molar
mA
Miliamperes
mg
Miligramos
min
Minutos
μg
Microgramo
μL
Microlitro
μM
Micromolar
mL
Mililitros
mM
Concentración
Milimolar
N°
Número
NaCl
Cloruro
de
sodio
NaOH
Hidróxido
de
sodio
NCBI
National
Center
for
Biotechnology
Information
ng
Nangramos
nm
Nanómetros
ns
Nanosegundos
LCR
Región
larga
de
control
pb
Pares
de
bases
ps
picosegundos
P
Fósforo
RMSD
Raíz
cuadrada
media
de
la
desviación
de
posiciones
atómicas
s
Segundos
SD
Desviación
estándar
t
Tiempo
to
Tiempo
inicial
URR
Región
reguladora
río
arriba
V
Volts
VPH-­‐16
Virus
del
papiloma
humano
variante
16
%
Porcentaje
3D
Tridimensional

10. X
LISTA
DE
TABLAS
TABLA
DESCRIPCIÓN
PÁGINA
1
VPH
y
su
asociación
con
las
principales
enfermedades
que
origina
obtenida
del
reporte
anual
de
la
Secretaria
de
Salud.
4
2
Lista
de
las
20
proteínas
con
mayor
identidad
y
valor
E
mas
alto,
listadas
por
su
clave
pdb
generado
por
el
archivo
ejecutable
build_profile.py
obtenidas
de
Modeller.
16
3
Matriz
de
distancias
de
identidad
de
secuencia,
se
presenta
la
clave
del
archivos
pdb
que
presentaron
mayor
identidad
en
secuencia
a
Brn3a.
16
4
Criterios
para
seleccionar
el
archivo
pdb
que
servirá
como
modelo
para
construir
la
estructura
tridimensional
de
Brn3a.
17
5
Evaluación
mediante
los
3
criterios
de
inclusión
para
escoger
la
mejor
estructura
tridimensional
para
construir
el
modelo
de
Brn3a.
17
6
Puntuaciones
de
energía
de
acuerdo
a
los
3
algoritmos
de
evaluación
usados
por
Modeller
que
corresponden
a
las
estructuras
tridimensionales
(PDB)
generados
por
Modeller.
18
7
Puntuaciones
de
energía
de
acuerdo
a
los
3
algoritmos
de
evaluación
usados
por
Modeller
que
corresponden
a
las
estructuras
tridimensionales
(PDB)
generados
por
el
archivo
ejecutable
ligand.py.
19
8
Puntuaciones
de
energía
de
acuerdo
a
los
3
algoritmos
de
evaluación
usados
por
Modeller
que
corresponden
a
las
estructuras
tridimensionales
(PDB)
generados
por
el
archivo
ejecutable
loop-­‐refine.py.
20
9
Puntuaciones
de
energía
de
acuerdo
a
los
3
algoritmos
de
evaluación
usados
por
Modeller
que
corresponden
a
las
estructuras
tridimensionales
(PDB)
generados
por
el
archivo
ejecutable
loop-­‐refine.py.
22
10
Cantidad
de
ángulos
diédricos
Ψ
(psi)
y
Φ
(phi)
favorables
permitidos
y
atípicos
que
del
total
de
aminoácidos
de
la
estructura
tridimensional
Brn3a-­‐ADN.
24
11
11
A:
Energía
total
previa
a
la
simulación
molecular
11
B:
Energía
total
al
final
de
la
simulación
molecular
29
12
Resultados
de
la
dinámica
molecular
por
MMPBSA.
36

11. XI
LISTA
DE
FIGURAS
FIGURA
DESCRIPCIÓN
PÁGINA
1
Estructura
de
un
factor
de
transcripción
el
cual
contiene
un
homeodominio.
6
2
Interacciones
del
motivo
hélice-­‐giro-­‐hélice
de
la
proteína
Antennapedia
de
D.
melanogaster
(código
PDB:
1AHD)
con
los
surcos
mayores
y
menores
del
ADN,
obtenido
de
la
base
de
datos
Protein
Data
Bank
(www.rcsb.org).
7
3
a)
Alineamiento
de
secuencias
de
aminoácidos
de
los
dominios
POU
de
las
proteínas
humanas
Brn-­‐5,
Oct-­‐1
y
Pit-­‐1.
Los
residuos
conservados
están
resaltados
en
letra
negrita.
Los
residuos
de
POUS
y
POUH
implicados
en
los
enlaces
de
puentes
de
hidrógeno
con
el
ADN
están
resaltados.
b)
Representación
esquemática
de
la
estructura
del
dominio
POU
de
Brn-­‐5.
El
dominio
POUS
se
muestra
en
color
rosa,
el
enlazador
en
amarillo
y
POUH
en
verde.
Las
hélices
de
los
dominios
POU
están
numeradas
como
se
muestra
en
el
alineamiento
de
la
parte
superior.
(N)
extremo
amino-­‐terminal,
(C)
extremo
carboxilo-­‐terminal.
8
4
Procedimiento
del
modelaje
por
homología.
10
5
Esquema
que
presenta
en
forma
de
jerarquía
las
rutas
de
acceso
a
los
archivos
ejecutables
del
presente
trabajo,
de
esta
manera
se
ordenaron
las
carpetas
contenidas
dentro
del
directorio
Modelaje_básico.
15
6
Dominios
y
familias
de
proteínas
relacionadas
a
los
dominios
presentes
en
la
secuencia
de
Brn3a,
la
familia
POU
a
la
izquierda
y
la
familia
de
los
homeodominios
a
la
derecha,
descritos
en
la
base
de
datos
"Conserved
Domains"
del
NCBI
y
localizados
mediante
la
herramienta
BLASTp.
15
7
Gráfico
que
muestra
el
puntaje
DOPE
de
cada
aminoácido
comparado
con
la
estructura
PDB
2XSD
usada
como
modelo
base.
La
región
enmarcada
por
el
rectángulo
corresponde
al
bucle
de
la
región
interdominios
donde
se
presenta
un
incremento
de
energía.
18
8
Gráfico
que
muestra
el
puntaje
DOPE
de
cada
aminoácido
de
la
nueva
estructura
PDB
Brn3a.B99990001
la
cual
se
encuentra
en
interacción
con
el
ADN
(azul)
obtenido
de
el
archivo
pdb
2XSD,
comparado
con
la
estructura
PDB
2XSD
(verde)
usada
como
modelo
comparativo,
la
región
enmarcada
por
el
rectángulo
corresponde
a
la
región
interdominio
donde
presenta
un
incremento
de
energía.
20
9
Gráfico
que
muestra
el
puntaje
DOPE
de
cada
aminoácido
de
la
21

12. XII
nueva
estructura
PDB
Brn3a.BL0006001
el
cual
fue
el
mejor
modelo
de
Brn3a
en
interacción
con
el
ADN
denominado
Brn3a-­‐
looprefine
(rojo),
comparado
con
la
estructura
PDB
2XSD
(verde)
usada
como
control
o
modelo
comparativo,
en
azul
se
muestra
el
modelo
previo
sin
el
proceso
de
refinamiento
de
bucle,
la
región
enmarcada
por
el
rectángulo
corresponde
al
bucle
en
la
región
C
terminal
del
archivo
pdb
Brn3a
la
cual
muestra
un
incremento
de
la
energía
por
un
arreglo
termodinámicamente
desfavorable
de
los
aminoácidos.
10
Gráfico
que
muestra
el
puntaje
DOPE
de
cada
aminoácido
comparado
con
el
archivo
pbb
2XSD
como
control
presentado
en
verde,
en
rojo
se
muestra
el
modelo
Brn3a.BL00040001.pdb
de
Brn3a
en
interacción
con
el
ADN
denominado
Brn3a-­‐looprefine
(rojo),
en
azul
se
muestra
el
archivo
pdb
que
contiene
el
modelo
previo
Brn3a.B99990001
sin
el
proceso
de
refinamiento
de
bucle
denominado
Brn3aligand.
22
11
A
la
derecha
se
presenta
la
estructura
tridimensional
de
Brn3a
unida
a
DNA,
se
muestra
en
gradiente
de
color
de
azul
(mas
preciso)
a
rojo
(menos
preciso)
los
Å
de
error
la
región
del
enlazador
(en
rojo)
la
cual
presenta
mas
de
3.5
Å
de
error,
a
la
izquierda
se
muestran
los
valores
de
torsión,
solvatación,
interacción
de
átomos
y
Cβ,
relación
SSE,
relación
ACC,
donde
al
final
de
la
barra
se
observa
el
valor
de
cada
uno
de
estos
criterios,
la
barra
negra
indica
que
tan
beneficioso
o
perjudicial
es
cada
valor
para
la
estabilidad
de
la
proteína.
23
12
Se
presentan
los
gráficos
de
Ramachandran
de
la
estructura
de
interacción
Brn3a-­‐ADN,
de
izquierda
a
derecha
en
orden
de
aparición
se
muestra
el
gráfico
general
de
la
estructura
donde
se
presenta
en
el
limite
del
gráfico
el
residuo
No
49
correspondiente
a
cisteína,
este
residuo
no
se
no
se
tomo
en
cuenta
en
la
validación
final
debido
a
que
se
encuentra
en
región
límite
del
gráfico
y
en
otros
gráficos
aparece
como
favorecido,
el
segundo
gráfico
presenta
los
residuos
de
Valina
e
Isoleucina,
el
tercer
gráfico
se
muestran
los
residuos
de
pre
Prolina,
el
cuarto
los
residuos
aminoacídicos
de
Glicina,
en
el
quinto
los
residuos
de
trans
Prolina
en
la
cual
se
muestra
el
residuo
No.
38
con
un
valor
atípico
por
lo
cual
se
deberá
modificar
su
posición
espacial
mas
adelante
con
dinámica
molecular,
el
sexto
y
último
gráfico
presenta
solamente
los
residuos
de
la
Prolina
en
posición
Cis.
25
13
A:
Secuencia
nucleotídica
que
se
encuentra
en
la
estructura
pdb
OCT-­‐6
(2XSD)
indicándose
a
la
izquierda
la
cadena
a
la
cual
pertenecen
en
el
archivo
pdb.
La
secuencia
nucleotídica
se
mutó
con
el
programa
X3DNA.
V1:
Secuencia
nucleotídica
de
la
región
URR
de
VPH-­‐16
subtipo
1
del
archivo
pdb
V1.
V2:
Secuencia
nucleotídica
de
la
región
URR
de
VPH-­‐16
subtipo
2
del
archivo
pdb
V2.
V5:
Secuencia
nucleotídica
de
la
región
URR
de
VPH-­‐16
subtipo
5
del
archivo
pdb
V5.
Las
letras
en
negrita
indican
las
26

13. XIII
bases
nucleotídicas
que
se
mutaron.
B:
Representación
esquemática
del
modelo
de
Brn3a-­‐ADN
donde
se
representa
el
ADN
en
forma
de
palos
y
la
proteína
en
forma
de
lazos.
14
Figura
14.
Se
muestran
en
orden
ascendente
a
descendente
los
resultados
de
la
minimización
energética
donde
se
equilibró
la
energía
potencial
y
energía
total
de
cada
molécula
de
cada
uno
de
los
complejos
Bn3a
en
unión
al
ADN
de
la
región
URR
de
cada
subtipo
de
VPH-­‐16.
Las
figuras
mostradas
a
la
derecha
presentan
la
energía
total
de
cada
molécula
contra
el
tiempo
total
que
fue
de
5
picosegundos,
los
gráficos
mostrados
a
la
izquierda
presentan
la
energía
potencial
de
cada
molécula
contra
el
tiempo
total
que
fue
de
5
picosegundos.
Figura
14
A:
Subtipo
1.
Figura
14
B:
Subtipo
2.
Figura
14
C:
Subtipo
5.
27,28
15
Se
muestran
en
orden
ascendente
a
descendente
los
resultados
de
la
simulación
de
la
dinámica
molecular.
Se
presentan
en
forma
de
gráfica
la
energía
potencial
y
energía
total
de
cada
molécula
de
cada
uno
de
los
complejos
Bn3a
en
unión
al
ADN
de
la
región
URR
de
cada
subtipo
de
VPH-­‐16.
Las
figuras
mostradas
a
la
derecha
presentan
la
energía
total
de
cada
molécula.
Los
gráficos
mostrados
a
la
izquierda
presentan
la
energía
potencial
de
cada
molécula.
Figura
14
A:
Subtipo
1.
Figura
14
B:
Subtipo
2.
Figura
14
C:
Subtipo
5.
30
16
Se
muestran
en
orden
descendente
las
gráficas
del
RMSD
de
los
Cα
de
las
estructuras
pdb
obtenidas
del
proceso
de
simulación
de
dinámica
molecular
contra
los
1000
picosegundos
de
la
simulación.
Se
presenta
en
orden
descendente
subtipo
1
como
figura
15
A,
subtipo
2
como
figura
16
B
y
subtipo
5
como
figura
16
C.
LS:
limite
superior.
M:
media.
LI:
limite
inferior.
31,32
17
A:
Densidad
del
complejo
Brn3a-­‐VPH16
subtipo
1.
B:
Temperatura
del
complejo
Brn3a-­‐VPH16
subtipo
1.
33
18
A:
Energía
potencial
del
complejo
Brn3a-­‐VPH16
subtipo
1.
B:
RMSD
del
complejo
Brn3a-­‐VPH16
subtipo
1.
34
19
A:
Densidad
del
complejo
Brn3a-­‐VPH16
subtipo
1.
B:
Temperatura
del
complejo
Brn3a-­‐VPH16
subtipo
1.
C:
Energía
total
del
complejo
Brn3a-­‐VPH16
subtipo
1.
D:
RMSD
del
complejo
Brn3a-­‐VPH16
subtipo
1.
35
20
Figura
20.
Secuencia
nucleotídica
consenso
de
la
región
URR
de
VPH-­‐16
.
36

14. XIV
RESUMEN
Javier
Alejandro
Rendón
Carrillo
Fecha
de
graduación:
Mayo
de
2014
Universidad
Autónoma
de
Nuevo
León
Facultad
de
Ciencias
Biológicas
Instituto
de
Biotecnología
Titulo
de
Estudio:
CONSTRUCCIÓN
DE
UN
MODELO
IN
SILICO
DE
LA
INTERACCIÓN
ENTRE
EL
FACTOR
DE
TRASCRIPCIÓN
BRN3A
Y
LA
REGIÓN
PROMOTORA
URR
DE
LA
VARIANTE
16
DEL
VIRUS
DEL
PAPILOMA
HUMANO
EN
UN
CONTEXTO
DE
TERAPIA
GÉNICA
CONTRA
EL
CÁNCER
DE
CÉRVIX.
Candidato
para
obtener
el
título
profesional
de
Licenciado
en
Biotecnología
Genómica
Área
de
estudio:
Biotecnología.
Propósito
y
método
de
estudio:
Se
estableció
un
modelo
tridimensional
de
interacción
del
factor
de
transcripción
humano
Brn3a
con
la
región
URR
de
tres
subtipos
de
VPH-­‐16
para
el
diseño
de
una
vacuna
génica
contra
el
CaCu.
Para
ello
se
construyó
y
validó
un
modelo
tridimensional
de
la
proteína
Brn3a
utilizando
modelaje
por
homología
con
Modeller,
se
validaron
los
modelos
construidos
con
MolProbity
y
QMEAN.
Posteriormente
se
construyó
el
modelo
tridimensional
de
la
interacción
de
la
proteína
Brn3a
con
una
secuencia
nucleotídica
similar
a
la
región
URR
de
VPH-­‐16
empleando
el
programa
Modeller,
el
modelo
tridimensional
de
la
proteína
Brn3a
y
la
estructura
tridimensional
de
la
secuencia
nucleotídica
contenida
en
el
archivo
PDB
de
clave
2XSD.
Con
el
programa
X3DNA,
se
mutaron
las
secuencias
nucleotídicas
de
los
archivos
pdb
que
contienen
los
modelos
tridimensional
de
interacción
proteína-­‐ADN
en
unión
a
la
secuencia
nucleotídica
de
la
región
URR
de
tres
subtipos
de
VPH-­‐16,
de
esta
manera
se
obtuvieron
tres
modelos
tridimensionales
de
interacción
de
la
proteína
Brn3a
con
la
región
URR
de
los
tres
subtipos
de
VPH-­‐16
subtipo
1,
subtipo
2,
y
subtipo
5,
los
cuales
se
validaron
con
MolProbity
y
QMEAN.
Se
mejoraron
los
tres
modelos
tridimensionales
de
interacción
de
la
proteína
Brn3a
con
la
región
URR
de
VPH-­‐16
empleando
un
proceso
de
minimización
de
energía
con
el
programa
Amber
12.
Por
último,
se
optimizaron
los
modelos
tridimensionales
de
interacción
de
Brn3a
con
cada
uno
de
los
tres
subtipos
de
VPH-­‐16
empleando
el
programa
Amber
y
se
calcularon
las
energías
de
interacción
del
complejo
proteína-­‐ADN.
Contribuciones
y
conclusiones:
Se
generó
información
sobre
la
energía
de
interacción
de
Brn3a
con
las
secuencias
de
VPH-­‐16
y
en
base
a
los
resultados
obtenidos
se
concluye
que
la
secuencia
nucleotídica
de
VPH-­‐16
subtipo
1
presenta
la
mayor
afinidad
a
Brn3a,
con
la
cual
se
abre
la
posibilidad
de
crear
una
vacuna
génica
contra
el
VPH-­‐16.
DIRECTOR
DE
TESIS
CO-­‐DIRECTOR
DE
TESIS
__________________________
____________________________
DR.
JOSÉ
MARÍA
VIADER
SALVADÓ
M.C.
JOSÉ
CLAUDIO
MORENO
ROCHA

15. 1
1. Introducción
La
transcripción
es
el
proceso
en
que
la
información
codificada
en
el
ADN
se
transcribe
a
ARN
mensajero.
La
síntesis
del
ARN
la
realiza
la
ARN
polimerasa,
pero
para
la
iniciación
y
progresión
del
proceso
se
necesita
la
participación
de
un
gran
número
de
proteínas
(factores
de
transcripción)
que
posibilitan
el
acoplamiento
de
la
ARN
polimerasa
al
promotor
del
gen
en
concreto
y
la
síntesis
del
mensajero
en
una
cantidad
precisa.
La
regulación
de
forma
específica
de
la
síntesis
de
cada
proteína
depende
de
los
factores
de
transcripción.
Los
factores
de
transcripción
son
proteínas
que
coordinan
y
regulan
la
expresión
de
un
gen
o
de
un
grupo
de
genes.
En
muchos
casos
regulan
su
propia
expresión
y
también
es
frecuente
que
regulen
a
otros
factores
de
transcripción.
Estos
factores
interaccionan
con
regiones
específicas
del
ADN,
con
elementos
de
la
maquinaria
de
transcripción
y
con
moléculas
que
activan
o
inhiben
su
actividad.
Su
función
es
conectar
los
estímulos
externos
e
internos
de
la
célula
actuando
como
transductores
de
señales.
El
conjunto
de
los
factores
de
transcripción
de
una
célula
dibuja
una
red
transcripcional
cuyas
conexiones
determinan
el
conjunto
de
genes
que
se
expresan
en
un
determinado
momento
(transcriptoma).
La
diferenciación
celular
depende
de
la
expresión
de
un
patrón
específico
de
genes,
lo
que
está
en
gran
medida
determinado
por
el
perfil
de
factores
de
transcripción
expresados
en
cada
tipo
celular.
Dentro
de
este
perfil
hay
factores
de
transcripción
cuya
expresión
está
constantemente
activa
los
cuales
son
responsables
de
la
expresión
de
los
genes
constitutivos,
y
hay
otros
que
cuya
expresión
se
activa
o
inhibe
en
respuesta
a
estímulos
externos.
Los
factores
de
transcripción
se
clasifican
en
familias
según
su
estructura
tridimensional.
Para
pertenecer
a
la
misma
familia
las
proteínas
deben
poseer
al
menos
un
25%
de
identidad
entre
ellas,
además
de
estar
relacionadas
evolutivamente.
La
familia
de
los
factores
de
transcripción
POU
(Pit-­‐1,
Oct-­‐1,
Unc-­‐86)
poseen
un
papel
determinante
en
el
desarrollo
estructural
de
los
organismos,
esta
familia
contiene
un
dominio
estructural
bipartito
denominado
dominio
POU.
El
dominio
POU
es
un
dominio
proteico
el
cual
se
une
a
ADN
o
ARN
y
está
altamente
conservado
en
la
mayoría
de
los
eucariotas.
Un
dominio
proteínico
se
define
como
una
unidad
compacta,
de
características
globulares,
que
suele
comprender
entre
30
a
150
aminoácidos
y
se
considera
que
su
conformación
tridimensional
está
determinada
por
su
secuencia
de
aminoácidos,
los
cuales
se
pliegan
de
forma
independiente
al
resto
de
la
proteína,
por
lo
que
poseen
una
estructura
y
función
distinguible
de
otras
regiones
de
la
proteína.
La
familia
de
factores
de
transcripción
POU
contiene
por
lo
regular
dos
subdominios
uno
denominado
homeodominio
y
otro
denominado
POU,
este
último
subdominio
está
más
conservado
en
eucariotas
que
el
homeodominio.
Estos
subdominios
trabajan
en
sinergia
para
activar
la
transcripción
de
varios
genes.
Cabe
destacar
a
la
sub-­‐familia
de
proteínas
POU
IV
por
su
importancia
en
el
desarrollo
del
sistema
nervioso
del
embrión
humano,
específicamente
a
los
factores
de
transcripción
Brn3a
y
Brn-­‐3b.
Estos
factores
poseen
papeles
antagónicos,
el
factor
de
transcripción
Brn3a
está
implicado
en
el
desarrollo
del
tubo
neural,
mientras
que
el
factor
de
transcripción
Brn-­‐3b
inhibe
a
Brn3a;
estos
factores
pertenecen
a
la
familia
POU
debido
que
comparten
un
dominio
estructural
de
150
a
160
aminoácidos
el
cual
está
presente
en
las
proteínas
Pit-­‐1,
Oct-­‐1
y
Unc-­‐86
que
tienen
función
regulatoria.
El
dominio
POU
deriva
su
nombre
de
la
identificación
original
en
los
loci
homeóticos
de
Drosophila.
Este
dominio
se
caracteriza
por
un
dominio
de
unión
a
ADN
separado
por
una
región
de
15
a
20
aminoácidos
unida
a
un
homeodominio
el
cual
está
relacionado
con
las
proteínas
homeobox.

16. 2
El
dominio
de
unión
a
ADN
de
la
proteína
Brn3a
ha
sido
estudiado
con
antelación
donde
se
logró
determinar
la
secuencia
de
unión
al
ADN.
Estos
estudios
se
basaron
en
los
sitios
homólogos
de
otras
proteínas
tales
como
Oct-­‐1
(el
octámero
TAATGARAT
se
ha
descrito
como
un
sitio
de
unión
específico
para
dicha
proteína).
Cabe
destacar
que
en
diversos
estudios
se
ha
correlacionado
el
papel
de
activación
de
estos
factores
en
los
genes
virales,
puesto
que
los
virus
poseen
secuencias
de
unión
a
estos
factores
de
transcripción.
En
el
presente
estudio
se
decidió
construir
tres
modelos
tridimensionales
de
la
interacción
del
sitio
de
unión
del
factor
de
transcripción
Brn3a
con
la
secuencia
nucleotídica
de
la
región
URR
correspondiente
a
tres
subtipos
del
virus
del
papiloma
humano
variante
16
(VPH-­‐16),
mediante
herramientas
bioinformáticas
para
el
posterior
diseño
de
una
vacuna
génica.
El
genoma
del
VPH
consiste
de
una
molécula
de
ADN
circular
de
doble
cadena,
aproximadamente
de
8
kb.
Se
divide
en
tres
regiones:
la
región
larga
de
control,
LCR
o
URR,
que
no
contiene
regiones
codificantes;
las
regiones
E1
a
E8
que
codifican
para
las
proteínas
de
expresión
temprana;
y
las
regiones
L1
y
L2
que
codifican
para
las
proteínas
de
expresión
tardía
en
el
ciclo
de
vida
del
virus.
La
importancia
del
presente
trabajo
reside
en
que
en
el
experimento
de
Turner
et
al.,
1997
se
encontraron
ocho
sitios
de
unión
de
factores
de
transcripción
en
el
genoma
del
VPH-­‐16
con
la
secuencia
nucleotídica
ta/taatnanta/t
los
cuales
están
distribuidos
en
el
20%
del
genoma
del
virus.
Estos
sitios
no
están
ligados
a
la
activación
de
la
expresión
de
los
factores
de
transcripción
del
genoma
viral
ni
de
los
oncogenes,
puesto
que
no
son
regiones
codificantes
y
se
encuentran
frecuentemente
cerca
de
los
extremos
3’
de
los
genes
tardíos
del
VPH.
A
pesar
de
ello
estudios
de
afinidad
demostraron
que
los
factores
de
transcripción
humanos
que
contienen
el
dominio
POU
interaccionan
con
estos
sitios
y
activan
la
expresión
cinco
genes
virales
denominados
E6,
E7,
E5,
E4,
y
E2.
Es
necesario
contar
con
un
modelo
de
interacción
molecular
de
la
proteína
Brn3a
y
la
región
URR
del
VPH-­‐16
debido
a
que
la
activación
de
la
expresión
de
genes
virales
se
encuentra
correlacionada
con
el
desarrollo
de
Cáncer
cérvicouterino
(CaCu).
Una
vacuna
génica
del
CaCu
podría
ser
un
vector
con
una
secuencia
nucleotídica
que
presente
una
mayor
afinidad
por
Brn3a
que
la
URR
silvestre.
Una
consecuencia
directa
de
tal
vector
sería
la
disminución
de
la
transcripción
de
proteínas
oncogénicas
del
VPH.
En
el
presente
proyecto,
por
medio
de
técnicas
computacionales
avanzadas
se
construirán
modelos
de
interacción
entre
Brn3a
y
las
secuencias
de
la
región
promotora
URR
de
los
suptipos
1,
2
y
5
del
VPH-­‐16
que
permitirán
predecir
la
especificidad
de
unión
de
Brn3a
por
dichas
secuencias.
Esto
permitirá
a
futuro
la
elección
de
secuencias
nucleotídicas
específicas
dentro
de
cientos
de
posibilidades
para
el
desarrollo
de
una
vacuna
génica.
2. Importancia
El
cáncer
de
cérvix
o
cérvicouterino
(CaCu)
es
la
segunda
causa
de
muerte
por
cáncer
en
mujeres
tanto
en
México
como
a
nivel
mundial
(Rapose,
2009),
afectando
principalmente
a
mujeres
en
edad
productiva
(Parkin
et
al.,
2006;
Agosti
et
al.,
2007).
La
infección
genital
con
el
VPH
es
un
factor
necesario
para
el
desarrollo
del
cáncer
de
cérvix
(Walboomers
et
al.,
1999).
El
VPH
se
destaca
por
ser
el
virus
de
transmisión
sexual
más
frecuente
a
nivel
mundial
(Rapose,
2009).
Por
esto
es
necesario
construir
un
modelo
in
silico
que
analice
la
especificidad
de
la
unión
entre
el
factor
de
transcripción
Brn3a
y
un
fragmento
de
ADN
de
la
región
promotora
URR
de
VPH-­‐16,
el
cual
permitirá
diseñar
sitios
específicos
de
unión
a
Brn3a
para
el
desarrollo
y
construcción
de
vectores
virales
terapéuticos
dirigidos
contra
el
CaCu.

17. 3
3. Hipótesis
Mediante
herramientas
bioinformáticas
se
podrá
confeccionar
un
modelo
tridimensional
de
la
interacción
entre
el
factor
de
transcripción
Brn3a
y
la
secuencia
nucleotídica
de
la
región
promotora
URR
de
tres
subtipos
del
VPH-­‐16.
4. Objetivos
4.1 Objetivo
general:
Establecer
un
modelo
tridimensional
de
interacción
del
factor
de
transcripción
humano
Brn3a
con
la
región
URR
de
tres
subtipos
de
VPH-­‐16
para
el
diseño
de
una
vacuna
génica
contra
el
CaCu.
4.2 Objetivos
específicos:
• Construir
y
validar
un
modelo
tridimensional
de
la
proteína
Brn3a.
• Construir
y
validar
el
modelo
tridimensional
de
interacción
de
la
proteína
Brn3a
con
la
región
URR
de
tres
subtipos
de
VPH-­‐16.
• Optimizar
los
modelos
tridimensionales
de
interacción
de
Brn3a
con
cada
uno
de
los
tres
subtipos
de
VPH-­‐16
y
calcular
las
energías
de
interacción
del
complejo
proteína-­‐
ADN.
5. Antecedentes
5.1 Epidemiología
y
etiología
del
cáncer
cérvicouterino
El
cáncer
de
cérvix
o
cérvicouterino
(CaCu)
es
la
segunda
causa
de
muerte
por
cáncer
en
mujeres
tanto
en
México
como
a
nivel
mundial
(Rapose,
2009),
afectando
principalmente
a
mujeres
en
edad
productiva
(Parkin
et
al.,
2006;
Agosti
et
al.,
2007).
La
infección
genital
con
el
virus
del
papiloma
humano
(VPH)
es
un
factor
necesario
para
el
desarrollo
del
cáncer
de
cérvix
(Walboomers
et
al.,
1999).
El
VPH
se
destaca
por
ser
el
virus
de
transmisión
sexual
más
frecuente
a
nivel
mundial
(Rapose,
2009).
En
la
tabla
1
se
muestra
la
relación
entre
el
VPH
y
las
principales
patologías
infecciosas
que
origina
de
las
cuales
algunas
pueden
progresar
a
cáncer
debido
a
su
potencial
oncogénico.
El
Sistema
Nacional
de
Salud
Mexicano
brinda
atención
médica
aproximadamente
a
9,000
casos
de
CaCu
invasor
y
se
registran
4,000
muertes
anualmente
(Walboomers
et
al.;
1999).
En
el
año
2001,
se
reportaron
4,051
muertes
en
mujeres
por
CaCu,
con
una
tasa
de
mortalidad
de

18. 4
8.8
por
cada
100,000
mujeres.
Para
el
año
2002
se
registraron
4,323
casos
con
una
tasa
de
8.6
por
100,000
mujeres
(Estadísticas
de
la
Secretaria
de
Salud;
2002).
Sin
embargo,
este
tipo
de
cáncer
es
absolutamente
prevenible
y
su
tratamiento
es
relativamente
fácil,
cuando
el
diagnóstico
es
oportuno.
El
CaCu
es
de
etiología
infecciosa
y
desde
la
perspectiva
de
la
salud
pública
se
está
consciente
que
los
programas
de
control
no
han
funcionado
como
se
esperaba.
La
experiencia
de
países
desarrollados
ha
permitido
demostrar
que
la
mejor
opción
para
disminuir
la
mortalidad
por
CaCu
es
la
detección
y
el
tratamiento
oportuno
de
lesiones
precursoras
y
lesiones
malignas
por
medio
de
programas
de
detección
oportuna
del
CaCu
y
del
VPH
(World
Health
Organization,
1995).
El
genoma
de
VPH
tiene
una
longitud
aproximada
de
8
kb
y
su
organización
se
encuentra
prácticamente
establecida.
Este
virus
contiene
nueve
genes,
los
cuales
dependiendo
del
momento
de
su
transcripción
durante
la
infección
viral,
se
dividen
en
genes
tempranos
(E1,
E2,
E3,
E4,
E5,
E6,
E7
y
E8)
y
genes
tardíos
(L1
y
L2).
La
expresión
de
estos
genes
está
controlada
por
una
región
promotora
río
arriba
del
gen
E6
(Gloss
et
al.,
1987),
denominada
unidad
reguladora
no
codificada
(URR)
o
también
unidad
larga
de
control
(LCR),
de
0.4
a
1
kb
de
longitud,
esencial
para
funciones
reguladoras
del
genoma
durante
la
replicación,
así
como
para
servir
de
origen
de
replicación
del
ADN
y
actuar
como
una
región
potenciadora
de
la
transcripción
viral
por
promotores
de
síntesis
del
ARN.
Tabla
1:
VPH
y
su
asociación
con
las
principales
enfermedades
que
origina
obtenida
del
reporte
anual
de
la
Secretaria
de
Salud.

19. 5
Los
genes
de
expresión
tempranos
codifican
para
proteínas
responsables
de
las
funciones
de
transformación
celular,
replicación
y
de
la
persistencia
del
ADN
integrado
en
las
células
a
las
que
infecta.
De
este
grupo
destacan
las
proteínas
codificadas
por
los
genes
E1
y
E2
que
intervienen
en
la
replicación
viral,
las
proteínas
codificadas
por
los
genes
E2
en
sinergia
con
E4
para
facilitar
la
amplificación
del
genoma
viral
y
la
expresión
de
proteínas
tempranas
y
sobre
todo,
las
que
intervienen
en
los
procesos
de
transformación
celular
codificadas
por
los
genes
E5,
E6
y
E7.
Las
regiones
E6/E7
tienen
un
especial
interés
ya
que
poseen
un
importante
papel
en
los
mecanismos
de
transformación
celular.
Estas
regiones
están
siempre
virtualmente
expresadas
en
los
cánceres
asociados
al
VPH.
Las
proteínas
codificadas
por
estos
genes
virales
se
unen
y
ubiquitinan
a
las
proteínas
supresoras
de
tumores
p53,
pRB
y
Rb105,
induciendo
su
degradación,
desregulando
el
ciclo
celular
y
provocando
el
bloqueo
de
la
apoptosis.
Existen
vacunas
eficientes
en
la
prevención
de
neoplasias
cervicales
intraepiteliales
de
grado
2
y
3
causadas
por
los
VPH-­‐16
y
18,
aunque
todavía
no
se
conoce
el
grado
de
protección
contra
otro
tipo
de
VPH
como
VPH-­‐31,
33,
35,
45,
52,
y
58.
El
alto
costo
es
también
un
factor
limitante
para
su
aplicación
en
países
en
vías
de
desarrollo
(Lowy,
2006;
Agosti
et
al.,
2007).
5.2 Brn3a
y
el
desarrollo
del
CaCu
mediante
la
regulación
del
VPH
Uno
de
los
factores
de
transcripción
que
se
une
al
sitio
URR
del
VPH
es
Brn3a.
Esta
proteína
pertenece
a
la
subfamilia
4
de
las
proteínas
POU,
identificada
en
el
GenBank
del
NCBI
como
POU4F1
y
está
conformada
por
3
miembros
homólogos:
Brn3a,
Brn-­‐3b,
Brn-­‐3c
(Guerrero
et
al.,
1993).
Brn3a
juega
un
papel
importante
en
el
proceso
del
desarrollo
del
tubo
neural
durante
la
embriogénesis
regulando
el
balance
entre
proliferación
y
diferenciación
celular,
por
lo
que
ejerce
una
gran
influencia
en
el
destino
celular
neuronal.
Sin
embargo,
su
abundancia
declina
llegando
a
ser
ausente
en
neuronas
maduras.
Por
otra
parte,
se
ha
detectado
la
sobreexpresión
de
este
factor
en
diversos
tipos
de
cáncer
como
el
cáncer
de
próstata,
neuroblastoma,
neuroendocrino
y
CaCu.
Respecto
al
CaCu,
diversos
estudios
en
pacientes
han
demostrado
la
sobreexpresión
del
ARNm
de
Brn3a
en
tejido
tumoral
de
hasta
300
veces
comparada
con
el
tejido
circundante
(Ndisang
et
al.,
1998).
La
sobreexpresión
de
este
factor
transcripcional
se
ha
visto
correlacionada
con
la
activación
de
la
expresión
génica
del
VPH,
principalmente
de
los
oncogenes
E6
y
E7,
los
cuales
alteran
la
tasa
de
crecimiento
celular
tanto
in
vivo
como
in
vitro.
Se
han
detectado
alteraciones
específicas
en
las
secuencias
del
URR
de
los
subtipos
1,
2
y
5
del
VPH-­‐16
las
cuales
están
correlacionadas
con
el
aumento
en
la
tasa
de
transcripción
de
los
oncogenes
virales.
De
manera
similar
se
han
identificado
variantes
en
las
secuencias
de
la
región
E5
de
VPH-­‐16,
que
están
asociadas
con
diferencias
en
los
niveles
de
transcripción
viral
de
los
oncogenes
virales,
ocasionando
la
inducción
de
la
neoplasia,
encontrando
al
subtipo
2
asociado
positivamente
al
desarrollo
de
CaCu.
Aunado
a
esto
se
ha
reportado
que
el
subtipo
2
presenta
mayores
niveles
de
expresión
de
los
oncogenes
E6
y
E7,
estos
oncogenes
son
activados
por
el
factor
de
transcripción
Brn3a.
Se
ha
demostrado
experimentalmente
que
la
región
URR
de
variantes
de
VPH
presentan
una
afinidad
a
los
factores
de
transcripción
Brn3a
y
Brn-­‐3b,
sin
embargo
ambas
proteínas
se
antagonizan.
En
el
subtipo
2
del
VPH-­‐16,
el
factor
de
transcripción
Brn3a
es
más
afín
a
dicha
secuencia
que
Brn-­‐3b
promoviendo
la
activación
de
la
región
URR
y
con
ello
la
expresión
de
los

20. 6
oncogenes
E6
y
E7,
contrario
a
la
función
de
la
proteína
Brn-­‐3b,
la
cual
en
ensayos
de
silenciamiento
de
Brn3a
ha
regulado
negativamente
la
expresión
de
dichos
genes
(Ndisang
et
al.,
2001).
Se
ha
identificado
la
presencia
de
Brn3a
en
las
líneas
celulares
cervicales
C33
y
SiHa
(Ndisang
et
al.,
1999).
Experimentos
de
sobreexpresión
de
Brn3a
en
células
SiHa
con
el
genoma
de
VPH-­‐16
han
demostrado
que
la
concentración
de
Brn3a
inherente
en
este
tipo
celular
se
encuentra
en
cantidades
saturantes
para
la
expresión
de
E6,
ya
que
presenta
el
mismo
efecto
que
el
mostrado
por
los
tratamientos
exógenos
con
dicha
proteína.
La
reducción
de
los
niveles
de
expresión
de
Brn3a
in
vivo
reduce
los
niveles
de
expresión
del
gen
E6
y
del
gen
antiapoptótico
Bcl-­‐2,
así
como
la
inducción
de
la
tumorogénesis
(Ndisang
et
al.,
1999,
2001).
Por
el
contrario
la
sobreexpresión
de
Brn-­‐3b
resulta
en
la
disminución
de
la
transcripción
de
los
genes
del
VPH
(Ndisang
et
al.,
1999),
mientras
que
una
disminución
de
Brn-­‐3b
presenta
efectos
similares
a
la
sobreexpresión
de
Brn3a
(Ndisang
et
al.,
2001).
La
sobreexpresión
de
Brn-­‐3b
in
vivo
presenta
un
efecto
inhibitorio
de
la
expresión
de
los
oncogenes
E6
(Ndisang
et
al.,
2001).
Con
base
en
el
papel
que
juega
Brn3a
en
la
interacción
y
activación
de
la
URR
del
VPH
se
han
sugerido
varias
vías
terapéuticas
posibles
contra
el
CaCu.
Algunas
alternativas
son
la
alteración
de
la
actividad
de
Brn3a
por
medios
farmacológicos,
o
bien
una
reducción
de
la
actividad
del
promotor
Brn3a
(Ndisang
et
al.,
1999,
2001).
La
terapia
genética
abre
el
camino
hacia
el
diseño
de
vectores
plasmídicos
o
adenovirales
como
tratamiento.
5.3 Sitios
de
unión
de
los
homeodominios
La
homeocaja
es
una
secuencia
nucleotídica
que
codifica
para
un
dominio
de
alrededor
de
60
aminoácidos
(figura
1),
que
se
encuentra
en
muchos
organismos
eucariotas,
cuyo
nombre
deriva
de
su
identificación
en
los
loci
homeóticos
de
la
mosca
de
la
fruta
(Drosophila
melanogaster).
En
los
genes
homeóticos
de
D.
melanogaster
a
menudo
el
homeodominio
está
cerca
del
extremo
C-­‐terminal
de
las
proteínas
producto
de
estos
genes.
Figura
1.
Estructura
de
un
factor
de
transcripción
el
cual
contiene
un
homeodominio.

21. 7
El
homeodominio
puesto
que
es
un
subdominio
suele
combinarse
con
otros
segmentos
o
dominios
en
los
factores
de
transcripción,
como
pasa
con
las
proteínas
Oct
(de
unión
de
octámero),
donde
una
cadena
conservada
de
75
aminoácidos,
llamada
región
POU,
se
localiza
cerca
de
una
región
que
simula
el
homeodominio,
tal
y
como
sucede
con
Brn3a.
El
homeodominio
se
encarga
de
la
unión
con
el
ADN
(figura
2),
este
posee
la
capacidad
de
reconocimiento,
donde
la
región
C-­‐terminal
del
homeodominio
es
idéntico
en
secuencia
al
segmento
hélice-­‐giro-­‐hélice
de
los
represores
procarióticos.
La
diferencia
entre
ambas
estructuras
radica
en
la
longitud
de
la
hélice
que
reconoce
al
ADN,
la
hélice-­‐3
la
cual
contiene
17
aminoácidos
de
longitud
que
son
parte
del
homeodominio
en
comparación
a
los
9
aminoácidos
del
represor
λ.
Figura
2.
Interacciones
del
motivo
hélice-­‐giro-­‐hélice
de
la
proteína
Antennapedia
de
D.
melanogaster
(código
PDB:
1AHD)
con
los
surcos
mayores
y
menores
del
ADN,
obtenido
de
la
base
de
datos
Protein
Data
Bank
(www.rcsb.org).
La
hélice-­‐3
se
une
con
el
surco
mayor
del
ADN
y
establece
el
mayor
número
de
contactos
entre
la
proteína
y
el
ácido
nucleico,
de
los
cuales,
muchos
de
los
que
orientan
la
hélice
en
el
surco
mayor
son
con
la
columna
de
fosfatos,
de
manera
que
no
son
específicos
para
la
secuencia
del
ADN,
sino
que
se
encuentran
sobre
todo
en
una
cara
de
la
doble
hélice
y
flanquean
las
bases
con
las
que
se
hacen
contactos
específicos.
Los
contactos
restantes
son
del
brazo
N-­‐terminal
del
homeodominio,
secuencia
inmediata
a
la
primera
hélice,
y
se
proyecta
hacia
el
surco
menor.
Así
las
regiones
N-­‐terminal
y
C-­‐terminal
del
homeodominio
son
las
principales
encargadas
de
hacer
contacto
con
el
ADN.
5.4 Reconocimiento
específico
de
una
secuencia
de
ADN
por
los
dominios
POU
Pit,
Unc,
Oct
son
proteínas
de
la
familia
POU
que
se
encuentra
muy
conservada
evolutivamente
entre
especies.
Además
de
la
proteína
Brn3a
incluye
a
gran
variedad
de
miembros
tales
como
Pit-­‐1,
Oct-­‐1,
Oct-­‐2,
Unc-­‐86,
Brn-­‐5,
Brn-­‐3b
(Herr
&
Cleary,
1995).
El
dominio
POU
de
unión
a
ADN
característico
de
dicha
familia
se
compone
de
dos
subdominios:
POUS
y
POUH.
El
subdominio
amino-­‐terminal
específico
(POUS)
contiene
alrededor
de
75
aminoácidos
y
el
subdominio
homeo
carboxi-­‐terminal
POUH
contiene
60
aminoácidos.
Los
dos
subdominios
se
encuentran
unidos
por
una
región
flexible
híper
variable
que
contiene
de
15
a
56
aminoácidos
llamada
linker
o
enlazador.
Los
subdominios
POUS
y
POUH
tienen
estructuras
independientes,
sin
embargo
la
flexibilidad
del
linker
permite
su
interacción
mutua
y
en
puntos
específicos
con
el
ADN
(Herr
&
Cleary,
1995),
(figura
3).

22. 8
Estudios
cristalográficos
recientes
elucidaron
la
estructura
del
complejo
proteína
Brn-­‐5
unida
a
ADN,
determinándose
que
los
dominios
POUS
y
POUH
se
unen
al
surco
mayor
del
ADN
en
posición
opuesta
(Pereira
&
Kim,
2009).
El
subdominio
POUS
se
une
a
la
secuencia
nucleotídica
atgc
en
sentido
5’,
mientras
que
el
subdominio
POUH
se
une
a
la
secuencia
aaat
en
sentido
3’,
ambos
subdominios
se
unen
en
la
misma
cadena
de
ADN.
Las
subunidades
POUS
y
POUH
no
interaccionan
directamente.
Los
dos
subdominios
contienen
un
motivo
hélice-­‐giro-­‐hélice
(HTH)
formado
por
las
hélices
alfa-­‐2
y
alfa-­‐3
distribuidas
perpendicularmente,
de
las
cuales
la
hélice
alfa-­‐3
permite
la
unión
con
el
ADN.
La
estructura
HTH
de
POUS
está
estabilizada
por
las
hélices
alfa-­‐1
y
alfa-­‐4,
mientras
que
la
estructura
HTH
de
POUH
está
estabilizada
por
la
hélice
alfa-­‐1.
La
capacidad
de
las
proteínas
de
la
familia
POU
para
activar
a
sus
promotores
blanco
está
influenciada
por
varios
factores.
Uno
de
ellos
es
atribuido
a
la
variabilidad
del
linker
entre
los
subdominios,
proporcionando
una
gran
diversidad
de
sitios
de
reconocimiento
en
el
ADN
blanco
por
parte
de
las
proteínas
POU.
El
fragmento
peptídico
linker
entre
los
dominios
se
comporta
como
un
estabilizador
de
los
subdominios
POUS
y
POUH
de
Brn-­‐5
(Pereira
&
Kim,
2009).
Además
la
estructura
cristalizada
de
Oct-­‐1
sugiere
que
Oct-­‐1
no
tiene
una
estructura
rígida,
ya
que
en
los
experimentos
realizados
no
se
logró
localizar
la
presencia
del
linker
en
el
mapa
de
densidad
electrónica.
Por
otro
lado
las
proteínas
de
la
familia
POU
pueden
compartir
sitios
de
unión
preferenciales
Figura
3.
a)
Alineamiento
de
secuencias
de
aminoácidos
de
los
dominios
POU
de
las
proteínas
humanas
Brn-­‐5,
Oct-­‐1
y
Pit-­‐1.
Los
residuos
conservados
están
resaltados
en
letra
negrita.
Los
residuos
de
POUS
y
POUH
implicados
en
los
enlaces
de
puentes
de
hidrógeno
con
el
ADN
están
resaltados.
b)
Representación
esquemática
de
la
estructura
del
dominio
POU
de
Brn-­‐5.
El
dominio
POUS
se
muestra
en
color
rosa,
el
enlazador
en
amarillo
y
POUH
en
verde.
Las
hélices
de
los
dominios
POU
están
numeradas
como
se
muestra
en
el
alineamiento
de
la
parte
superior.
(N)
extremo
amino-­‐terminal,
(C)
extremo
carboxilo-­‐terminal.
Subdominio
específico
-­‐
POU
Subdominio
homeo
-­‐
POU

23. 9
que
se
traslapan
y
que
son
capaces
de
unirse
a
secuencias
nucleotídicas
con
afinidades
diversas.
Por
ejemplo,
los
factores
Oct-­‐1
y
Oct-­‐2
reconocen
exactamente
la
misma
secuencia
nucleotídica
encontrada
en
varios
promotores,
y
a
su
vez
el
factor
Pit-­‐1
se
une
in
vitro
e
in
vivo
a
esta
secuencia
común
aunque
en
menor
afinidad
(Li
et
al.,
1993).
Los
factores
Oct-­‐1,
Brn3a
y
Brn-­‐3b
se
unen
a
la
secuencia
del
promotor
viral
URR
en
VPH-­‐16,
en
la
secuencia
nucleotídica
atgcaatt.
El
factor
ubicuo
Oct-­‐1
se
expresa
en
células
cervicales
lo
que
contribuye
normalmente
a
inhibir
la
actividad
del
promotor
viral
URR
en
VPH-­‐16,
contrario
al
efecto
de
Brn3a
(Morris
et
al.,
1993).
Esta
última
proteína
activa
también
al
promotor
inmediato-­‐temprano
(Immediate-­‐Early)
del
virus
herpes
simplex
(VHS-­‐IE3)
por
medio
de
la
secuencia
nucleotídica
tatgarat
(Dawson
et
al.,
1996).
Las
modificaciones
al
contexto
del
sitio
de
unión
a
ADN
también
tienen
efectos
variables.
En
el
caso
del
factor
de
transcripción
Brn3a
en
unión
con
el
promotor
viral
en
VHS-­‐IE3,
únicamente
es
necesario
que
se
conserve
el
espacio
entre
los
sitios
de
unión
a
ADN,
efecto
contrario
al
causado
por
Brn-­‐3b
(Dawson
et
al.,
1996).
A
diferencia
de
esto
la
represión
de
dicho
promotor
por
Oct-­‐2.4
y
Oct-­‐2.5
depende
del
contexto
nucleotídico
además
del
espacio
entre
los
sitos
de
unión
(Dawson
et
al.,
1996).
El
dominio
POU
puede
influenciar
su
propia
asociación
con
una
proteína
co-­‐reguladora
en
un
sitio
diferente.
Un
buen
ejemplo
es
el
complejo
VP16-­‐inducido
que
sirve
como
activador
al
promotor
IE
del
virus
del
herpes
simplex
(Herr
&
Cleary,
1995).
Aunque
el
dominio
POU
se
encuentra
altamente
conservado,
la
región
linker
le
confiere
a
estas
proteínas
la
capacidad
de
adoptar
varias
conformaciones
para
su
unión
con
el
ADN
que
se
traducen
en
cambios
posicionales
y
direccionales
entre
POUS
y
POUH
(Li
et
al.,
1993).
Ensayos
in
vitro
han
demostrado
que
los
efectos
antagonistas
de
las
proteínas
Brn3a
y
Brn-­‐3b
son
invertidos
al
intercambiar
la
isoleucina
de
Brn-­‐3b
por
la
valina
de
Brn3a
en
la
posición
22
de
la
región
POU
(Morris
et
al.,
1994,
1997).
Debido
al
complejo
proceso
de
reconocimiento
entre
ADN
y
proteínas,
es
importante
realizar
estudios
que
permitan
elucidar
secuencias
exactas
de
interacción
de
Brn3a
con
la
secuencia
URR
de
VPH-­‐16
con
el
fin
de
diseñar
nuevas
estrategias
terapéuticas
en
el
combate
contra
el
CaCU.
5.5 Predicción
de
la
estructura
tridimensional
de
una
proteína
Aunque
la
estructura
de
Brn3a
no
se
conoce
experimentalmente,
existe
la
posibilidad
de
inferirla
in
silico
utilizando
modelos
de
predicción.
Existen
varios
métodos
que
permiten
predecir
una
estructura
tridimensional
protéica.
De
forma
general,
se
distinguen
tres
métodos:
1. Modelaje
por
comparación
o
modelaje
por
homología.
2. Modelaje
por
reconocimiento
de
plegamientos.
3. Modelaje
por
predicción
Ab-­‐initio.
La
estrategia
utilizada
para
predecir
la
estructura
tridimensional
de
una
proteína
es
determinante
para
obtener
un
buen
modelo
tridimensional,
lo
cual
requiere
generalmente
la
integración
de
varios
de
los
métodos
conocidos
(Ding
et
al.,
2008).
El
estado
de
los
avances
de
los
métodos
de
predicción
de
estructuras
tridimensionales
de

24. 10
proteínas
se
puede
valorar
con
los
experimentos
CASPs
(Critical
Assessment
of
Techniques
for
Protein
Structure
Prediction
o
Evaluación
crítica
de
las
técnicas
de
predicción
de
la
estructura
de
proteínas)
que
son
rondas
donde
se
predice
la
estructura
tridimensional
de
proteínas
y
se
comparan
con
estructuras
tridimensionales
dilucidadas
por
cristalografía
(Jauch
et
al.,
2007;
Ben-­‐David
et
al.,
2009).
Actualmente
existen
dos
limitantes
en
los
procesos
de
predicción
y
validación
de
estructuras
tridimensionales,
lo
que
requiere
una
mejora
o
implementación
de
nuevos
métodos.
Primero,
no
se
puede
predecir
cualquier
estructura
in
silico:
durante
la
ronda
experimental
de
2008,
de
las
13
estructuras
tridimensionales
a
predecir,
4
predicciones
no
fueron
aceptables
para
ninguno
de
los
grupos
participantes
(Ben-­‐David
et
al.,
2009).
Segundo,
los
criterios
de
evaluación
de
la
similitud
entre
la
predicción
y
la
estructura
experimental
aún
no
están
bien
definidos
(Jauch
et
al.,
2007;
Ben-­‐David
et
al.,
2009).
5.5.1 Modelaje
por
homología
El
modelaje
por
homología
permite
predecir
una
estructura
tridimensional
desconocida
de
una
proteína
blanco
por
medio
de
la
comparación
de
su
secuencia
con
secuencias
de
proteínas
templado
cuyas
estructuras
tridimensionales
son
conocidas
(figura
4).
Las
principales
etapas
son:
a. La
selección
de
templados.
b. El
alineamiento
con
la
secuencia
blanco.
Figura
4.
Procedimiento
del
modelaje
por
homología.

25. 11
c. El
refinamiento
para
resolver
las
regiones
de
baja
similitud.
El
modelaje
por
homología
se
utiliza
frecuentemente
con
el
fin
de
descubrir
nuevos
medicamentos
o
para
guiar
experimentos
de
mutagénesis
(Costanzi,
2008).
También
se
utiliza
para
estudios
de
relación
de
estructura
–
actividad
(QSAR),
los
cuales
buscan
relaciones
cuantitativas
entre
actividad
y
estructura
de
una
biomolécula
(Costanzi,
2008).
El
proceso
de
alineamiento
de
secuencias
es
crítico.
Rost
determinó
que
si
la
identidad
de
las
secuencias
en
los
alineamientos
es
del
30%,
el
90%
de
los
modelos
que
sean
predichos
por
homología
serán
acertados,
mientras
que
si
esta
identidad
es
del
20%
sólo
el
10%
de
los
modelos
serán
acertados,
a
esta
característica
Rost
la
denominó
la
zona
de
incertidumbre
(Rost
1999).
Si
se
obtienen
valores
mayores
al
50%
de
identidad
entre
la
secuencia
de
las
proteínas
blanco
y
de
las
proteínas
templado
se
producen
predicciones
de
alta
calidad
(hasta
3Å
de
resolución).
Por
el
contrario,
valores
de
25
a
30%
de
identidad
producen
predicciones
propensas
a
presentar
errores
(Floudas
et
al.,
2006).
El
programa
3D-­‐Coffe
(O’Sullivan
et
al.,
2004)
permite
un
mejor
alineamiento
secuencia-­‐
estructura
en
comparación
con
otros
programas,
particularmente
para
identidades
por
debajo
del
50%
(Dalton
&
Jackson,
2007).
En
las
estructuras
complejas
los
pasos
de
refinamiento
permiten
mejorar
la
predicción
hasta
0.5
Å.
En
comparación
con
SWISS-­‐MODEL
(Schewede
et
al.,
2003)
o
Builder
(Koehl
&
Delarue,
1994),
Modeller
(Sali
&
Blundell,
1993),
SegMod/ENCAD
(Levitt,
1992)
y
Nest
(Petrey
et
al.,
2003)
son
los
programas
que
presentan
mejores
resultados
en
cuanto
a
resolución
y
predicción
de
los
modelos
tridimensionales
(Wallner
&
Elofsson,
2005),
siendo
éste
último
el
que
mejor
resuelve
las
estructuras
tipo
bucle
(Dalton
&
Jackson,
2007).
5.5.2 Modelaje
por
reconocimiento
de
plegamientos
El
método
de
reconocimiento
de
plegamientos
asume
que
las
estructuras
tridimensionales
de
las
proteínas
están
más
conservadas
que
las
secuencias.
Existen
diversas
técnicas
para
llevar
a
cabo
dicho
reconocimiento,
tales
como
la
predicción
de
estructuras
secundarias
y
comparaciones
avanzadas
de
secuencias
o
pruebas
de
compatibilidad
de
secuencias
con
un
plegamiento
tridimensional
conocido
(Floudas
et
al.,
2006).
Estos
métodos
han
tenido
éxito
en
los
experimentos
CASPs
(Jauch
et
al.,
2007;
Ben
–David
et
al.,
2009).
Este
método
asegura
que
la
secuencia
es
compatible
con
cualquiera
de
los
miembros
de
un
conjunto
de
estructuras
proteicas
conocidas.
Esto
se
produce
al
colocar
los
residuos
“desconocidos”
de
la
proteína
a
lo
largo
de
la
cadena
principal
de
una
estructura
tridimensional
de
una
proteína
conocida,
para
luego
determinar
la
estabilidad
de
las
cadenas
laterales
de
la
estructura
tridimensional
de
la
proteína
desconocida
en
esa
disposición
y
luego
deslizar
la
secuencia
de
la
proteína
que
no
se
conoce
su
estructura
a
lo
largo
de
la
proteína
que
sí
se
conoce
su
estructura
tridimensional,
esto
se
realiza
residuo
por
residuo
repitiendo
el
cálculo
(Voet,
2006).
5.5.3 Modelaje
por
predicción
Ab-­‐initio
El
modelaje
por
predicción
Ab-­‐initio
consiste
en
encontrar
la
estructura
tridimensional
proteica

26. 12
más
estable
que
corresponde
a
la
conformación
que
posee
la
menor
energía
libre
según
la
hipótesis
de
Anfinsen
(Anfinsen,
1973).
Este
método
se
utiliza
con
cualquier
secuencia,
independientemente
al
conocimiento
previo
de
la
estructura,
permitiendo
así
predicciones
de
novo.
En
este
método
se
utilizan
primero
campos
de
fuerza
simplificados
en
los
cuales
se
mueven
los
residuos,
seguido
por
un
refinamiento
con
un
potencial
de
átomos
totales
(Fluodas
et
al.,
2006;
Jamal
Rahi
et
al.,
2008;
Shaeffer
et
al.,
2008;
Rohs
et
al.,
2009).
Estos
modelos
tratan
de
predecir
la
estructura
tridimensional
desconocida
de
una
proteína
comenzando
desde
cero,
y
se
basan
en
principios
físicos
con
los
cuales
se
construyen
algoritmos
que
intentar
imitar
el
plegado
de
las
proteínas,
o
bien
pueden
aplicar
un
método
estocástico
para
buscar
la
conformación
más
estable
termodinámicamente.
Este
método
requiere
de
vastos
recursos
computacionales,
como
las
supercomputadoras,
puesto
que
la
cantidad
de
información
a
procesar
es
enorme,
esto
además
los
vuelve
muy
costosos
6. Metodología
6.1 Materiales
y
equipo
Se
utilizaron
dos
sistemas
operativos
diferentes,
el
primer
sistema
operativo
fue
Mac
OS
X
Mavericks
10.9.2
ejecutado
en
una
Apple
Mac
Book
Pro
con
un
procesador
Intel
Core
i5
de
2.5
GHz
con
8
Gb
de
RAM,
el
segundo
sistema
operativo
fue
Red
Hat
Enterprise
Linux
Server
release
6.2
ejecutado
remotamente
en
el
clúster
de
Supercómputo
del
IPN
en
el
equipo
IBM
iDataPlex
denominado
Thubat
Kaal
con
los
siguientes
procesadores:
Intel
Xeon
8-­‐core
E5-­‐
2680
a
2.7
GHz,
Intel
Xeon
8-­‐core
a
2.7
GHz,
2
CPU's
Intel
Xeon
8-­‐core
a
2.7
GHz
y
2
CPU's
Intel
Xeon
8-­‐core
a
2.7
GHz
con
288
Gb
de
RAM.
6.2 Estrategia
General
En
primer
lugar
se
construyo
y
valido
un
modelo
tridimensional
de
la
proteína
Brn3a
utilizando
modelaje
por
homología
con
el
programa
Modeller
y
validado
por
MolProbity
y
QMEAN.
Posteriormente
se
construirá
el
modelo
tridimensional
de
la
interacción
de
la
proteína
Brn3a
con
una
secuencia
nucleotídica
similar
a
la
región
URR
de
VPH-­‐16
empleando
el
programa
Modeller
se
construyo
el
modelo
tridimensional
de
la
proteína
Brn3a
en
formato
PDB
unida
a
la
secuencia
nucleotídica
descrita
en
el
archivo
PDB
de
clave
1AU7.
Con
el
programa
X3DNA,
se
mutaron
las
secuencias
nucleotídicas
del
modelo
tridimensional
de
interacción
proteína-­‐ADN,
las
mutaciones
fueron
con
el
objeto
de
que
hacer
coincidir
a
la
secuencia
con
la
secuencia
nucleotídica
de
la
región
URR
de
los
tres
subtipos
de
VPH-­‐16.
De
esta
manera
se
obtuvieron
tres
modelos
tridimensionales
de
interacción
de
la
proteína
Brn3a
con
la
región
URR
de
los
tres
subtipos
de
VPH-­‐16
subtipo
1,
subtipo
2
y
subtipo
3
los
cuales
se
validaron
con
los
programas
MolProbity
y
QMEAN.
Se
optimizaron
los
tres
modelos
tridimensionales
de
interacción
de
la
proteína
Brn3a
con
la
región
URR
de
VPH-­‐16
empleando
un
proceso
de
minimización
de
energía
con
el
programa
Amber
12.
Por
último
se
calcularon
las
energías
de
interacción
del
complejo
proteína-­‐ADN.

27. 13
6.3 Construcción
y
validación
de
la
estructura
tridimensional
de
la
proteína
Brn3a
La
estructura
terciaria
de
Brn3a
fue
elucidada
in
silico
mediante
un
modelo
de
homología.
Se
determinó
una
estructura
tridimensional
templado
mediante
la
herramienta
Blastp
del
National
Center
for
Biotechnology
Information
(NCBI)
empleando
la
secuencia
aminoácidica
de
Brn3a
(clave
GenBank
NP_006228)
contra
la
base
de
datos
de
estructuras
tridimensionales
PDB
del
Protein
Data
Bank.
Se
descartaron
las
estructuras
tridimensionales
cuya
secuencia
aminoácidica
presenten
una
identidad
menor
al
30%
con
la
secuencia
de
Brn3a.
De
las
estructuras
tridimensionales,
se
eligió
a
la
plantilla
que
presento
la
mayor
identidad
en
secuencia
con
Brn3a
y
que
a
su
vez
presento
la
mejor
estructura
experimental
en
cuanto
a
resolución
cristalográfica,
y
su
secuencia
se
alineo
con
la
secuencia
de
Brn3a.
Se
calculo
o
predijo
el
modelo
tridimensional
de
Brn3a
con
el
programa
Modeller.
El
modelo
fue
evaluado
utilizando
los
programas
MolProbity
y
QMEAN
(Benkert
et
al.,
2009).
Se
ejecutaron
todos
los
comandos
desde
la
terminal
del
equipo
de
cómputo,
en
este
caso
se
utilizó
el
sistema
operativo
de
Unix
con
la
versión
de
Ubuntu
10.4,
así
como
Mac
OS
X
versión
10.8.2
Lion.
En
ambos
sistemas
se
realizaron
todos
los
comandos
del
programa
Modeller
con
la
misma
versión
del
programa,
la
versión
9.11.
Todos
los
comandos
del
programa
Modeller
ejecutan
programas
específicos
los
cuales
se
escribieron
en
el
lenguaje
de
programación
Python.
Este
lenguaje
de
alto
nivel
posee
una
sintaxis
muy
limpia
que
favorece
a
que
el
código
sea
legible.
Además
tiene
licencia
de
código
abierto
la
cual
es
compatible
con
la
licencia
pública
general
de
GNU
en
que
basan
los
sistemas
Unix.
Se
ejecutaron
los
comandos
de
modelado
básico
del
programa
Modeller.
Una
vez
obtenido
el
modelo,
se
utilizó
el
programa
Loop-­‐refine
para
corregir
los
bucles
en
la
estructura
tridimensional
de
la
proteína
y
se
validó
el
modelo
construido
con
los
programas
Molprobity
y
QMEAN.
El
modelo
fue
aceptable
según
los
criterios
de
validación
obtenidos
en
dichos
programas
y
se
procedió
al
próximo
paso.
6.4 Construcción
y
validación
del
modelo
tridimensional
de
interacción
de
la
estructura
tridimensional
de
Brn3a
con
la
región
URR
de
tres
subtipos
de
VPH-­‐16
6.4.1 Construcción
del
modelo
tridimensional
de
interacción
Brn3a
con
la
región
URR
de
VPH-­‐16
Se
utilizó
la
conformación
estructural
tridimensional
de
la
proteína
Brn3a
determinada
previamente
y
se
estableció
la
estructura
de
Brn3a
en
interacción
con
la
secuencia
de
unión
a
la
variante
1
del
VPH-­‐16
con
el
software
Modeller.
Se
usó
el
programa
Ligand
el
cual
genero
un
modelo
tridimensional
de
la
proteína
Brn3a
unida
a
la
secuencia
nucleotídica
extraída
de
un
archivo
PDB
de
clave
1AU7.
Esta
clave
corresponde
a
la
estructura
tridimensional
de
la
proteína
con
mayor
identidad
a
Brn3a
por
ello
sirvió
como
modelo
base.
Con
el
programa
X3DNA
se
mutó
la
secuencia
nucleotídica
del
modelo
de
interacción
ADN-­‐proteína
(Brn3a-­‐
ADN)
para
obtener
la
secuencia
nucleotídica
de
la
región
URR
VPH-­‐16.
El
programa
X3DNA
se
ejecutó
desde
la
terminal
del
equipo
de
cómputo
y
se
usó
el
comando
mutate
bases
de
X3DNA.
En
el
comando
a
ejecutar
se
especifico
en
primer
lugar
la
cadena
del
modelo