2. I batteri patogeni
Gli agenti patogeni sono in continua
evoluzione, perché i batteri e l’ospite, così
come le condizioni ecologiche che
prevedono la loro interazione, subiscono
continui cambiamenti.
Gli agenti patogeni emergono e perdono
virulenza nel corso tempo.
Malattie infettive emergenti sono causate da
organismi che esistono già come
opportunisti o veri patogeni e che
acquistano ulteriori elementi di DNA
codificanti per un determinante di virulenza.
La transizione verso la patogenicità può
essere causata da cambiamenti nei batteri,
o, in alternativa, nell ’ ospite divenuto
sensibile, o per l ’ acquisita capacità di
sopravvivere da parte dei batteri nell’uomo.
Una ricerca sul sito di PubMed del National Institute of Heath degli Stati Uniti
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) alla voce bacterial pathogenicity lista
quasi 60 000 articoli scientifici.
3. Salmonella
Il nome Salmonella deriva dal nome del veterinario americano Daniel
Elmer Salmon, ma il vero scopritore di tale batterio, fu il suo
assistente, il patologo Theobald Smith nel 1885.
Smith e Salmon identificarono l’agente causale del colera nel maiale,
e lo chiamarono Hog-cholera bacillus.
Nel 1900 lo scienziato francese
Joseph Léon Lignières propose di
sostituire il nome Hog-cholera
bacillus con Salmonella in onore di
Salmon (solo successivamente si e
scoperto che Salmonella cholerae-
suis non è la vera causa della peste
suina, che è invece una malattia
virale).
3
4. Salmonella
Habitat
L'habitat principale delle salmonelle è il tratto intestinale dell'uomo e di altri animali sia a
sangue caldo che freddo.
I serbatoi animali più comuni sono polli, tacchini, maiali e decine di altri animali domestici e
selvatici.
Attraverso le feci dell’animale, il batterio viene diffuso nell’ambiente (acqua, suolo, piante,
successivamente ingerite) causando notevoli perdite di bestiame e rappresentando un grave
problema di salute pubblica.
Nell ’ uomo la salmonellosi di solito è un ’ intossicazione alimentare autolimitante
(gastroenterite), e solo occasionalmente si manifesta come una grave infezione sistemica
Al genere Salmonella appartengono
(febbre tifoide) che richiede immediato trattamento antibiotico.
batteri Gram- della famiglia delle
Enterobacteriaceae.
Salmonella è un bacillo di 0.7 - 1.5 x
2-5 μ in grado di crescere sia in
condizioni aerobiche che
anaerobiche.
Le salmonelle sono prive di capsula e sono asporigene.
Le salmonelle crescono in modo ottimale a 37°C su
terreni di coltura standard, dove si sviluppano piccole
colonie di 2-4 mm di diametro, lisce, brillanti e di colore
omogeneo.
4
5. Salmonella
Habitat
Alcune caratteristiche metaboliche di Salmonella sono l'utilizzo di citrato come unica fonte di
carbonio e la produzione di gas a partire da glucosio.
Generalmente, non fermentano il lattosio a eccezione di alcuni ceppi di S. diarizonae.
Come per la maggior parte dei batteri, il loro pH ottimale di crescita è intorno alla neutralità (pH 6.5
- 7.5), anche se possono crescere in una vasta gamma di pH (da 4.5 a 9.5) a seconda delle altre
condizioni ambientali.
La temperatura più bassa alla quale è stata isolata Salmonella è di 2°C e la più alta è di 54°C
(per S. typhimurium).
La stragrande maggioranza delle
salmonelle è mobile grazie alla presenza di
flagelli peritrichi (flagelli distribuiti su tutta la
superficie cellulare,) a eccezione di rari
sierotipi non mobili come S. gallinarum e S.
pullorum.
Come altre cellule flagellate, le salmonelle
mobili possono perdere la loro capacità di
sviluppare flagelli sotto l'effetto di stress
sub-letali, quali la refrigerazione o l ’ alta
temperatura.
5
6. Salmonella
Struttura antigenica
•Il genere Salmonella presenta tre tipi di antigeni principali:Antigeni somatici (antigene O, o della
parete cellulare);Antigene capsulare (o di superficie);Antigene Flagellare (H).
Gli antigeni somatici rappresentano i componenti più esterni del lipopolisaccaride (LPS), che
sono stabili al calore e resistenti all'alcool.
Sono formati da due parti:
•la prima, più interna, è composta da cinque carboidrati ed è comune a tutte le Enterobacteriaceae;
•la seconda, più esterna, è formata da catene saccaridiche dalle quali dipende la diversità degli
antigeni somatici.
Gli antigeni capsulari (o di superficie) sono associati alla capsula che sono identificati con
Studi di cross-assorbimento hanno individuato circa 67 diversi antigeni O polisaccaridica e sono
numeri romani. sierotipi di Salmonella e in altri generi di batteri enterici (per esempio, E. coli e
presenti in alcuni
Klebsiella):
•l’antigene Vi (Vi sta per virulenza, in quanto i sierotipi che lo possiedono risultano più virulenti);
l’antigeni K (capsulare) di altri enterobatteri corrisponde all’antigene Vi delle salmonelle.
Tali antigeni possono mascherare gli antigeni O impedendo l’agglutinazione del batterio con
antisieri O.
Su circa 2.500 sierotipi di Salmonella, questo antigene è presente solo in tre sierotipi: Typhi,
Paratyphi C, e Dublino.
Alcuni ceppi di questi sierotipi possono anche non avere l'antigene Vi. 6
7. Salmonella
Struttura antigenica
Antigene Flagellare (H)
In Salmonella si conoscono circa 35 antigeni flagellari (la flagellina è una proteina termolabile che
si organizza in un cilindro cavo per formare il flagello).
Salmonella è unico tra i batteri enterici in quanto, la maggior parte dei suoi sierotipi può esprimere
alternativamente due flagelli con diversa specificità antigenica (Fase 1 o Fase 2).
Poche salmonelle (a esempio, Enteritidis, Typhi) producono flagelli con un unico tipo di flagellina e
quindi con la stessa specificità antigenica (Antigene H monofasico);
Salmonelle monofasiche si possono ottenere anche attraverso l'inattivazione del gene che codifica
per la Fase 1 o per la Fase 2.
Pochissime specie hanno 3 fasi sierologiche H e sono dette “trifasiche”, mentre, in rari casi le
salmonelle possono perdere tale struttura antigenica H, diventando immobili.
7
8. Salmonella
Tassonomia
La parete cellulare dei microrganismi contiene una serie di proteine e
lipopolisaccaridi con molte varianti strutturali e molecolari.
Ognuna di queste strutture può fungere da antigene e reagire con un
anticorpo.
Facendo reagire un microrganismo con diversi anticorpi si ottiene la sua
tipizzazione sierologica (stabilire cioè quali antigeni sono presenti su quel
determinato microrganismo).
Sulla base della presenza di tali antigeni e in base a alcuni caratteri
biochimici, una singola specie può essere suddivisa in centinaia o anche
migliaia di sierotipi diversi.
8
9. Salmonella
Tassonomia
S. enterica è suddivisa ulteriormente in sei sottospecie o gruppi (che si
differenziano biochimicamente) e più di 2.500 sierotipi.
Salmonella enterica sottospecie enterica, rappresenta quasi il 99% delle
salmonelle isolate nella pratica medica.
Oggi il sierotipo non è più identificativo di una specie, peraltro i nomi sono
mantenuti solamente per i sierotipi appartenenti a S. enterica subsp. enterica
(per esempio, S. Typhimurium), mentre quelli ascrivibili alle altre sottospecie
vengono identificati attraverso le relative formule antigeniche.
9
11. Salmonella
Patogenesi
Salmonella enterica è soprattutto un patogeno gastrointestinale, che ha la
capacità di provocare un ampio spettro di malattie che vanno da una
infiammazione gastrointestinale locale autolimitante, a malattie sistemiche
letali come la febbre tifoide.
L'esito della malattia dipende principalmente dal sierotipo di S. enterica.
S. enterica sierotipo Typhi e, in misura minore, S. enterica sierotipo Paratyphi
causano infezioni sistemiche che rappresentano un grave problema di salute
nei paesi emergenti e negli individui immunocompromessi (AIDS).
Le infezioni gastrointestinali da Salmonella sono un problema globale
causato soprattutto da sierotipi come Enteritidis e Typhimurium.
11
12. Salmonella
Patogenesi
In seguito all ’ ingestione per via orale,
Salmonella infetta le cellule dell'epitelio
gastrointestinale (cellule non fagocitiche), e
in particolare colonizza l'intestino tenue
Sebbene la maggior parte delle infezioni da
Salmonella rimangono localizzate a livello
intestinale, in cui la stimolazione della
risposta infiammatoria contribuisce alla
diarrea, nel caso del tifo la Salmonella riesce
a traslocare attraverso lo strato epiteliale
intestinale e a raggiungere il vano sotto-
epiteliale dove può interagire con le cellule
dendritiche e i macrofagi.
12
13. Salmonella
Salmonella essendo anche un patogeno intracellulare facoltativo sia in grado di sopravvivere e
replicare anche all’interno di tali cellule fagocitiche, nelle quali non entra nel citoplasma ma risiede nel
fagosoma, facendo fronte a cambiamenti ambientali quali la rapida diminuzione del pH e la carenza
nutrizionale, per poi diffondere al fegato e alla milza attraverso il flusso sanguigno e il sistema linfatico.
14. Isole di Patogenicità e Sistemi di
Secrezione di Tipo III
La patogenesi delle malattie provocate da Salmonella spp. dipende dal
coordinamento dell’espressione temporale di numerosi fattori di virulenza, Isole di
Patogenicità e Sistemi di Secrezione di Tipo III codificati dalle isole di patogenicità
(PAI) che nel corso dell'evoluzione Salmonella ha acquisito, anche da specie affini,
attraverso eventi ripetuti di trasferimento genico orizzontale (HGT).
15. Isole di Patogenicità
La patogenesi delle malattie provocate da Salmonella spp. dipende dal coordinamento
dell’espressione temporale di numerosi fattori di virulenza, Isole di Patogenicità e Sistemi
di Secrezione di Tipo III codificati dalle isole di patogenicità (PAI) che nel corso
dell'evoluzione Salmonella ha acquisito, anche da specie affini, attraverso eventi ripetuti di
trasferimento genico orizzontale (HGT).
Le PAI possono avere sia una localizzazione cromosomiale che plasmidica e in Salmonella
sono definite isole di patogenicità di Salmonella (SPI).
Tra queste, SPI-1 e SPI-2 codificano per due distinti Sistemi di Secrezione di Tipo III
(T3SS) chiamati T3SS-1 e T3SS-2.
Questi sistemi rilasciano nella cellula ospite oltre 30 proteine specializzate (proteine
effettrici), che sono codificate dalle SPI e agiscono coordinatamente per
•modificare il citoscheletro,
•le vie di trasduzione del segnale,
•il traffico di membrana della cellula ospite e
•le risposte pro-infiammatorie dell’ospite.
Ciò consente a Salmonella di
•invadere le cellule epiteliali non fagocitiche,
•stabilire e mantenere una nicchia intracellulare replicativa,
•o vacuolo contenente Salmonella (SCV, Salmonella containing vacuole) e,
•in alcuni casi, diffondere e causare malattie sistemiche.
16. Isole di Patogenicità e Sistemi di Secrezione di Tipo III
Rappresentazione schematica degli stadi di infezione di Salmonella.
SPI1 è necessario per l'invasione di cellule ospiti non fagocitiche (invasione diretta), mentre
SPI2 è essenziale per la sopravvivenza e replicazione dei batteri all’interno delle cellule fagocitiche.
La trasmigrazione dei leucociti polimorfonucleati (PMN) contribuisce all’infiammazione intestinale.
Gli effettori SPI-1 e SPI-2 non operano sequenzialmente e indipendentemente gli uni dagli altri, ma
cooperano alla maturazione, posizionamento e replicazione degli SCV.
I sierotipi di Salmonella associati a malattie sistemiche sono in grado di entrare nei macrofagi intestinali,
inducendo la morte cellulare e/o utilizzandoli come veicolo per la diffusione al fegato e alla milza attraverso
il flusso sanguigno e il sistema linfatico.
17. Isole di Patogenicità e Sistemi
di Secrezione di Tipo III
I geni di SPI-1 sono espressi durante la tarda fase logaritmica in condizioni di alta osmolarità e bassa
tensione di ossigeno, tipiche dell’ambiente intestinale.
In particolare, la funzione di SPI-1 è richiesta per le fasi iniziali della salmonellosi, cioè per l'ingresso di
Salmonella in cellule non fagocitiche, innescando l'invasione e la penetrazione dell'epitelio gastrointestinale
(sintomi diarroici).
La funzione di SPI-2 è richiesta per le fasi successive del contagio, sopravvivenza e replicazione nei
fagociti, diffusione sistemica e colonizzazione degli organi dell’ospite.
18. Sistemi di Secrezione di
Tipo II
T3SS-1
Il T3SS-1 è un apparato multi-proteico costituito da
più di 20 proteine altamente conservate, e comune
a molti batteri patogeni Gram-.
La regione centrale di questo sistema è una
struttura macromolecolare conosciuta come il
needle complex (il complesso dell ’ ago) che
attraversa la parete batterica.
I Sistemi di Secrezione di Tipo III hanno molte
analogie con il corpo basale dei flagelli,
suggerendo una relazione evolutiva tra questi due
tipi di strutture.
Il needle complex è composto da una base a più
anelli e un sottile ago (un tubo rettilineo di circa 80
nm di lunghezza) formato da una singola proteina,
PrgI (PhoP-repressed gene) che sporge verso
l'esterno della parete batterica e attraverso la
quale vengono iniettate le proteine effettrici nel
citoplasma della cellula ospite.
L ’ anello associato alla membrana esterna del
batterio (outer ring) che ha un diametro più piccolo
ed è formato da 12-14 subunità della proteina InvG
(secretin), mentre l ’ anello associato alla
membrana interna (inner ring) ha un diametro
maggiore ed è costituito da due anelli posti uno
19. Sistemi di Secrezione di
Tipo II
T3SS-1
Negli ultimi anni sono state identificate almeno 13 proteine
effettrici iniettate dal T3SS-1 nelle cellule epiteliali
dell’intestino:
AvrA, SipA, SipB, SipC, SipD, SlrP, SopA,
SopB, SopD, SopE, SopE2, SptP e SspH1.
Alcune di queste proteine sono codificate da SPI-1 e altre
da altre isole di patogenicità o altri loci cromosomici.
Questo primo gruppo di effettori è fondamentale per
l’ingresso dei batteri nelle cellule dei mammiferi, in quanto
portano alla riorganizzazione dell’actina del citoscheletro
della cellula ospite e ne deformano la membrana
plasmatica.
Per esempio, le proteine SipA e C (Salmonella invasion
protein), legano l’actina raggruppandola in fasci nel punto
di entrata del batterio.
La proteina SopB (Salmonella outer protein B) è una
fosfatasi fosfoinositide che de-fosforila la fosfatidil-inositolo-
4,5-bis-fosfato [PI(4,5)P2] a livello della membrana
plasmatica alterandone la carica superficiale. SopB è
anche considerata una enterotossina in quanto innalza i
livelli di 1,4,5,6-tetrafosfato con conseguente perdita di ioni
cloro e secrezione di fluidi nel lume intestinale. Il risultato
finale dell ’ azione coordinata di queste proteine è la
formazione di pseudopodi e increspature a livello della
membrana della cellula ospite (membrane ruffling) che
portano all ’ internalizzazione dei batteri, e quindi alla
biogenesi degli SCV.
20. Sistemi di Secrezione di
Tipo II
T3SS-2
Successivamente all’invasione, attraverso T3SS-
2 viene rilasciato un secondo gruppo di effettori
che cooperando con il primo gruppo, consentendo
ai batteri di sopravvivere e replicare all’interno
degli SCV e ne impediscono la fusione con i
lisosomi.
La posizione degli SCV, e la successiva fusione
fagosoma-lisosoma è strettamente correlata ai
microtubuli e alla loro polarità (le loro estremità
negative e positive sono orientate rispettivamente
dal centro verso la periferia della cellula).
Gli organelli si muovono lungo i microtubuli grazie
all ’ azione di proteine motrici tra le quali
ricordiamo la dineina e la chinesina che fanno
muovere gli organelli in senso centripeto o
La dineina è coinvolta nel trasporto retrogrado negli assoni rispettivamente. elementi del reticolo
centrifugo e convoglia gli
endoplasmatico, gli endosomi tardivi e i lisosomi fino al centro della cellula.
La chinesina è associata al trasporto anti-retrogrado e convoglia i mitocondri, i lisosomi e un assortimento
di vescicole di membrana verso l’ER o verso la periferia della cellula.
21. Sistemi di Secrezione di
Tipo II
T3SS-2
La Figura mostra il secretion system apparatus (ssa,
apparato di secrezione), il secretion system effectors
(sse, effettori del sistema di secrezione) e lo
chaperone ssc, e i due componenti A e B del
secretion system regulator (ssr, regolatori del sistema
di secrezione).
Il sistema T3SS-2 è costituito da 31 geni organizzati
in 4 operoni distinti. Il meccanismo di base utilizzato
da S. Typhimurium per stabilire la propria nicchia
replicativa intracellulare è la carica elettrostatica della
superficie di membrana degli SCV.
Tra i diversi effettori (oltre 10) liberati nel citoplasma
dal T3SS-2 vi è la proteina SopB (già traslocata nella
cellula ospite dal T3SS-1), che riducendo i livelli di
PI(4,5)P2 e PS (fosfatidil-serina, un altro fosfolipide
carico negativamente) degli SCV nascenti, ne
diminuisce la carica negativa superficiale di
membrana.
Una delle conseguenze dell’azione di SopB è che
alcune proteine della cellula ospite, il cui legame alla
membrana dipende dalle interazioni elettrostatiche
con essa, non sono più in grado di interagire con gli
La mancata interazione delle Rabs con la membrana degli SCV fa si che questi non possano essere
SCV.
trasportati verso i lisosomi inibendo la fusione fagosoma-lisosoma (minore del le Rabs, coinvolteceppo
Tra queste proteine vi sono 25% rispetto al nel
controllo). reclutamento della dineina.
22. Sistemi di Secrezione di
Tipo II
T3SS-2
4 - 6 ore dall ’ inizio dell ’ infezione delle cellule epiteliali, la proteina
effettrice SseG induce l’accumulo di SCV intorno alle vescicole del Golgi.
Questo permette, attraverso un continuo scambio di vescicole, nutrienti e
membrane, la moltiplicazione dei batteri contenuti nel SCV.
La moltiplicazione batterica porta alla formazione di strutture tubulo-
vescicolari chiamate Filamenti Indotti da Salmonella (SIF).
Questi filamenti si originano dagli SCV e si estendono attraverso l’intera
cellula 22
23. Funzione di PhoQ/PhoP
La sopravvivenza di Salmonella
all’interno dei macrofagi avviene grazie a
un sistema a due componenti:
•il regolatore trascrizionale PhoP e
•il sensore PhoQ,
entrambi in grado di regolare i sistemi
SPI-1 T3SS e SPI-2 T3SS.
PhoQ è una histidine kinase di membrana
(membrana interna del batterio), con un
dominio periplasmico che funge da
sensore a diversi stimoli ambientali, e un
dominio chinasico citoplasmatico.
In vitro, l’attività del sensore chinasico PhoQ è repressa dagli ioni Mg2+, Ca2+ o Mn2+ che si legano alla
sua regione periplasmica
24. Funzione di PhoQ/PhoP
In vivo, la presenza di questi cationi bivalenti, in particolare quella del
Mg2+, all’interno degli SCV non è sufficiente per reprimere PhoQ che
viene attivato da altri fattori come il pH acido (circa 5 - 6.5), peptidi
antimicrobici cationici (CAMP) e radicali dell’ossigeno
Gli ioni Mg2+ o Ca2+ mantengono il dominio periplasmico di PhoQ
ripiegato sulla membrana (stato represso), all’interno degli SCV,
gli CAMP inducono un cambiamento conformazionale di tale dominio
attivandolo.
Così come i cationi bivalenti, anche gli CAMP sono carichi
positivamente e competono per gli stessi residui del dominio
periplasmico di PhoQ, ma con maggiore affinità rispetto a Mg2+ o
Ca2+, ed essendo strutturalmente più ingombranti di questi ultimi,
allontanano tale dominio dalla membrana, attivando PhoQ.
Il pH acido degli SCV provoca una perdita della rigidità del dominio
Quindi, verosimilmente, all’interno degli SCV, questi periplasmico di PhoQ, facilitandone il cambiamento conformazionale
due fattori attivano PhoQ additivamente.
da parte degli CAMP.
L’attivazione di PhoQ permette la trans-autofosforilazione della sua regione citoplasmatica e il conseguente trasferimento
di un Pi a PhoP.
È proprio questa fosforilazione che attiva la capacità di PhoP di legare il promotore dei geni pho-regolati.
È stato dimostrato con esperimenti di microarray che PhoP controlla la trascrizione di più di 100 geni, attivandoli (geni pag,
PhoP-activated genes) o reprimendoli (geni prg, PhoP-repressed genes).
Il sistema PhoPQ regola in modo opposto le due caratteristiche principali di Salmonella:
l’induzione dell’endocitosi da parte delle cellule epiteliali e la sopravvivenza nei macrofagi.
I geni del sistema SPI-1 T3SS, così come pure i geni coinvolti nella sintesi dei flagelli, sono PhoP-repressi, mentre i geni
del sistema SPI-2 T3SS, sono PhoP-attivati.
25. Funzione di PhoQ/PhoP
Regolazione negativa del sistema SPI-1 T3SS
La regolazione negativa, da parte di PhoP, del sistema SPI-1 T3SS
SsrA
avviene tramite il controllo della trascrizione dei geni del locus hil
(hyper-invasion locus) codificanti le proteine regolatrici HilA, HilC e
HilD, che a loro volta regolano l’espressione dei geni dei sistemi SPI-
1 e SPI-5.
Regolazione positiva del sistema SPI-2 T3SS
L’espressione di diversi operoni del sistema SPI-2 T3SS è controllata
positivamente dal sistema a due componenti SsrAB, costituito dal
sensore SsrA (histidine kinase) e dalla proteina SsrB (response
regulator). Quando PhoP è fosforilato si lega al promotore di SsrB,
inducendone la trascrizione, e influenza, a livello post-trascrizionale, le
concentrazione di SsrA.
A differenza del sistema PhoP/PhoQ, che risulta altamente conservato tra specie affini, il sistema SsrAB è caratteristico di
S. enterica (esempio di trasferimento genico orizzontale).
26. Variazione antigenica
S. enterica possiede due flagelli antigenicamente
diversi codificati dai geni fliC e fljB.
Sia la porzione N-terminale che quella C-terminale
delle proteine flagellari FljB e FliC sono altamente
conservate (i primi 71 e gli ultimi 46 aminoacidi
sono identici), mentre la parte esposta al
riconoscimento da parte degli anticorpi differisce
notevolmente (diversità antigenica).
Le singole cellule batteriche esprimono
alternativamente i due flagelli ogni 103 - 105
divisioni cellulari.
Questo fenomeno è conosciuto come variazione
di fase:
le cellule esprimenti fliC sono definite cellule di
fase 1, mentre le cellule esprimenti fljB sono di
fase 2.
Il gene fljB è parte di un operone contenente anche il gene
fljA,
codificante un repressore post-trascrizionale del gene fliC.
27. Variazione antigenica
La variazione di fase avviene attraverso una
inversione reversibile di un segmento di DNA
chiamato segmento H, contenente il promotore
per i geni fljB-fljA.
Il segmento H è fiancheggiato da sequenze
ripetute e invertite hixL e hixR (sequenze di
inversione), all ’ interno delle quali avviene una
ricombinazione sito-specifica che permette
l’inversione del segmento H.
L’enzima ricombinasi che effettua tale inversione
è codificata dal gene hin, localizzato all’interno
del segmento H stesso.
Quando il segmento H si trova nell’orientamento ON, i geni fljB e fljA sono co-trascritti, portando alla
generazione di cellule in fase 2, mentre quando il segmento H si trova nell’orientamento OFF non viene
prodotta né la flagellina FljB né il repressore FljA, ma solo la flagellina FliC generando cellule in fase 1.
Anche nelle cellule in fase 2 il gene fliC viene trascritto, ma il messaggero risultante viene degradato
velocemente a causa della presenza di FljA. Questo fattore è una ribonucleoproteina che si lega al 5‘-UTR
(intorno alla sequenza Shine-Dalgarno) dell ’ mRNA di fliC impedendone il legame ai ribosomi e
causandone quindi la rapida degradazione.
28. Shigella
Il nome Shigella deriva dal nome del batteriologo giapponese Kiyoshi Shiga che per primo
nel 1898 isolò e identificò un batterio appartenente a tale genere.
L’habitat naturale delle shigelle è l’intestino dei primati
superiori, soprattutto dell’uomo. Questi patogeni intestinali
sono gli agenti eziologici della dissenteria bacillare. Il
contagio avviene per via oro-fecale attraverso la
contaminazione fecale soprattutto di alimenti (le mosche
possono fungere da vettori meccanici).
Raramente i bacilli vengono isolati da acque superficiali e
potabili o da scarichi o acque contaminate da feci.
Non solo Shigella è sopraffatto dall’ antagonismo di altri
microrganismi eventualmente presenti nelle acque (per
esempio, Escherichia) ma soprattutto è particolarmente
sensibile ai trattamenti di disinfezione.
Le epidemie di shighellosi avvengono, in genere, in zone ad
alta densità demografica e in cui non vengono rispettate le
normali con condizioni igienico-sanitarie. In genere,
l’eliminazione dei bacilli da parte dei soggetti infetti avviene
nell ’ arco di qualche settimana, ma alcuni soggetti,
soprattutto i bambini, rimangono portatori sani per mesi e
raramente anche per anni.
29. Shigella
Struttura antigenica - Classificazione -
Patogenesi
Struttura antigenica Il genere Shigella appartiene alla famiglia delle Enterobacteriaceae. La Shigella
è un bacillo Gram- di 0.4 - 0.75 x 1 - 2 μ, aerobio e anaerobio facoltativo, non mobile (e quindi privo
dell’antigene flagellare H) e asporigeno.
Possiede
•antigeni somatici (O) termostabili, e talvolta
•l’antigene K termolabile che può inibire l'agglutinazione degli antigeni somatici con gli antisieri
corrispondenti.
Classificazione In base alle caratteristiche biochimiche (capacità di fermentare il D-mannitolo) e
antigeniche il genere Shigella viene suddiviso in 4 sottogruppi principali, indicati come A, B, C e D, e
44 sierotipi. I sottogruppi sono sempre stati trattati come specie:
Patogenesi La patogenicità di questo microrganismo è associata anche alla sua dose minima
infettante che è molto bassa (10-100 cellule). Questa elevata capacità infettiva di Shigella è in parte
dovuta alla presenza di sistemi di acido resistenza che gli permettono di sopravvivere nell’ambiente
acido dello stomaco, e alla capacità del batterio di reprimere l’espressione di peptidi antimicrobici che
vengono normalmente rilasciati dalla superficie della mucosa intestinale. Dopo il passaggio attraverso
30. Shigella
Patogenesi
Shigella nella fase iniziale dell'infezione non invade le cellule epiteliali intestinali dalla parte apicale,
ma innesca invece il suo assorbimento nelle cellule M ((membranose) sono una sottopopolazione del
MALT (Tessuto Linfoide Associato alle Mucose). La loro funzione che è quella di discriminare ciò che
è Self dal Non Self,), che permettono l’attraversamento dello strato epiteliale, al di sotto del quale
entra a contatto con i macrofagi che rapidamente vanno incontro ad apoptosi.
La distruzione dei macrofagi è accompagnata dal rilascio di citochine proinfiammatorie che
richiamano cellule polimorfonucleate, le quali distruggendo il rivestimento epiteliale consentono ad
altri batteri di raggiungere lo strato al di sotto della mucosa (senza l’aiuto delle cellule M).
L ’ induzione dell ’ apoptosi dei macrofagi da parte di Shigella è uno stadio fondamentale
dell’infezione perché consente al batterio di invadere le cellule epiteliali dalla base, all’interno delle
quali riesce a evadere dal fagosoma e replicare all’interno del citoplasma.
I sintomi della malattia (diarrea, nausea e vomito) si manifestano
dopo un periodo di incubazione di circa 12 - 96 ore, con una durata
di circa 4 -7 giorni nei casi lievi, e di 3 - 6 settimane nei casi gravi.
31. Isole di patogenicità
Il numero e la localizzazione genomica delle isole di patogenicità di Shigella (SHI) cambiano tra i
diversi ceppi, riflettendone la diversa virulenza. Esse sono localizzate sia sul cromosoma batterico
che su un grosso plasmide (pINV, plasmide della virulenza) di circa 200 kb, contenente un
centinaio di geni. La regione principale di questo plasmide è la cosiddetta entry region (regione
d'ingresso) di circa 31 kb, altamente conservata, la cui presenza è necessaria e sufficiente per
l'invasione delle cellule intestinali, e la distruzione dei macrofagi.
Essa è costituita da 34 geni organizzati in due unità, la cui trascrizione avviene in direzioni
Il primo gruppo èalle loro funzioni, questi geni possono essere divisi(Sistema di Secrezione di Tipo
opposte. In base costituito da proteine effettrici secrete dal T3SS in quattro gruppi diversi.
III), che interferendo con diversi processi della cellula ospite, permettono l ’ invasione e la
sopravvivenza del microrganismo all’interno di essa. Tra queste proteine visono gli antigeni
plasmidici di invasione IpaA, B, C D (invasion plasmid antigens) che oltre ad avere funzioni
effettrici, controllano anche la secrezione e la traslocazione di altri effettori nella cellula ospite.Il
secondo gruppo comprende più della metà dei geni della entry region ed è necessario per la
secrezione di proteine effettrici tra cui le Ipa. Questi geni sono stati chiamati membrane expression
of ipa (mxi) e surface presentation of ipa antigens (spa). Il locus mxi-spa codifica i componenti
necessari per l’assemblaggio e la funzionalità del T3SS, che insieme a IpaB, C e D, permette il
trasferimento di circa 25 proteine effettrici nel citoplasma della cellula ospite.
Il terzo gruppo comprende 2 attivatori trascrizionali: VirB e MxiE, che regolano i geni del sistema
T3SS.
IlL’espressione dei geni del plasmide della virulenza avviene in seguito ai cambiamenti ambientali
quarto gruppo codifica per gli chaperoni (IpgA, IpgC, IpgE e Spa15).
(temperatura, pH, osmolarità e concentrazione di ferro) a cui viene sottoposto il batterio una volta
penetrato nell’ospite. Tra questi, il passaggio a una temperatura di 37° C è il segnale principale
per l’attivazione dell’espressione dei geni della entry region.
31
32. Sistema di Secrezione di Tipo III.
Shigella, così come altri batteri Gram-, riesce a
invadere e sopravvivere all’interno di una cellula
eucariotica grazie all’azione di proteine effettrici
che il batterio inietta direttamente all’interno della
cellula ospite attraverso un Sistema di Secrezione
di Tipo III.
T3SS di Shigella che come quello di altri batteri è
un apparato multiproteico (needle complex)
costituito da una base a più anelli e un sottile ago
che attraversano la parete batterica fino ad
arrivare alla membrana della cellula ospite.
Il costituente maggiore dell’anello associato alla
membrana esterna del batterio (outer ring, anello
esterno) è la proteina MixD (secretina), mentre gli
anelli localizzati nella membrana interna (inner
ring, anello interno) e nello spazio periplasmico
sono costituiti dalla proteina di membrana MxiG e
dalla lipoproteina MxiJ.
33. Sistema di Secrezione di Tipo III.
La struttura dell’ago è costituita principalmente
dalla proteina MxiH, e in minor misura da MxiI.
L ’ assemblaggio dell ’ ago è controllato dal
cosiddetto anello C, costituito da proteine
citoplasmatiche associate all’inner ring.
La proteina Spa33 interagisce con altri
componenti del T3SS per estroflettere l ’ ago
mentre la Spa32 ne determina la lunghezza. In
condizioni di anaerobiosi (caratteristica del lume
intestinale) il fattore di trascrizione Fnr reprime la
trascrizione di Spa32 e di Spa33, fino a quando,
in prossimità della superficie epiteliale dove vi è
un ’ ossigenazione relativamente superiore, Fnr
viene silenziato permettendo la trascrizione di
Spa32 e Spa33 e il contatto con le cellule ospiti.
L ’ energia necessaria per l ’ assemblaggio e il
funzionamento del T3SS derivano dall'attività
La lunghezza dell’ago è evolutivamente correlata
ATPasica di Spa47, anch ’ essa associata
alla lunghezza degli antigeni O degli LPS, dai
all’anello C.
quali esso è circondato.
Durante l ’ interazione con la cellula ospite,
Shigella modifica la conformazione degli LPS
attraverso una glucosilazione che li rende più
compatti e corti, facilitando il contatto dell’ago
con la membrana cellulare delle cellule ospiti.
34. Sistema di Secrezione di Tipo III.
All’estremità dell’ago si associano le proteine
IpaB, C e D.
In assenza di cellule ospiti, la proteina idrofilica
IpaD interagisce con la proteina idrofobica IpaB
bloccandola all ’ interno del canale dell ’ ago,
impedendo così la secrezione delle proteine
effettrici.
Quindi, durante la crescita dei batteri in un terreno
liquido a 37° C, il T3SS è assemblato, ma non
attivo. È solo il contatto con la cellula ospite che
determina un cambiamento conformazionale di
IpaD, che a sua volta permette la localizzazione di
IpaB nella membrana plasmatica della cellula
eucariotica, dove insieme all ’ altra proteina
idrofobica IpaC forma un poro multimerico di
traslocazione.
In particolare, IpaB (così come il suo omologo
SipB di Salmonella), IpaC e IpaD interagiscono
direttamente con i microdomini di membrana,
ricchi in colesterolo, delle cellule eucariotiche.
Nel momento in cui l’ago è nella conformazione
“aperta” altre proteine Ipa e altri effettori proteici
possono raggiungere direttamente i loro bersagli
nella cellula ospite.
35. Patogenesi.
Le proteine effettrici che sono traslocate
cooperano per riorganizzare il citoscheletro della
cellula ospite, e formare pseudopodi e
increspature (membrane ruffling) che inglobano il
batterio.
A differenza di Salmonella che rimane nell’SCV,
Shigella 15 minuti dopo l’internalizzazione lisa il
fagosoma in cui è stata inglobata.
IpaB, IpaD e soprattutto IpaC sono i fattori decisivi
per la lisi della membrana del fagosoma. In
seguito all’invasione della cellula ospite Shigella
sintetizza due proteine regolatrici codificate dal
plasmide di virulenza pINV: VirF e VirB.
VirF è una proteina attivatrice AraC-like, che porta
all’attivazione della cascata regolatrice che attiva
i geni virB e icsA.
VirB è una proteina che attiva diversi operoni
codificanti fattori necessari per l’invasione e la
colonizzazione della mucosa intestinale.
36. Patogenesi.
La proteina IcsA (intracellular spread, disseminazione intracellulare) è una outer membrane protein
nota anche come VirG che si localizza a uno dei poli della cellula batterica, richiamando e attivando
proteine della cellula ospite che nel complesso catalizzano l’allungamento dei filamenti di actina.
Contemporaneamente, la proteina VirA secreta dal T3SS, degrada l’α-tubulina creando dei tunnel
attraverso i quali i batteri si muovono più facilmente all’interno del fitto citoscheletro in cui si vengono
a trovare.
Questa polimerizzazione direzionale dell’actina conferisce una spinta propulsiva che permette al
batterio di spingere sulla membrana plasmatica a livello delle tight junctions di cellule adiacenti.
La sporgenza derivante può essere internalizzata dalle cellule vicine. Grazie all’azione di IpaB, C e D
la doppia membrana plasmatica viene lisata e Shigella viene liberata nel citoplasma dove può iniziare
un nuovo ciclo di replicazione e diffusione cellula-cellula.
Quindi, pur essendo prive di flagelli le Shigelle liberate nel citoplasma della cellula ospite si muovono
grazie alla polimerizzazione dell’actina in corrispondenza di uno dei due poli del batterio.
37. Patogenesi di Shigella
In seguito all’invasione della cellula ospite Shigella sintetizza due proteine regolatrici codificate dal
plasmide di virulenza pINV: VirF e VirB
VirF è una proteina attivatrice AraC-like, che porta all’attivazione della cascata regolatrice che attiva
i geni virB e icsA.
VirB è una proteina che attiva diversi operoni codificanti fattori necessari per l’invasione e la
La proteina IcsA (intracellular spread, disseminazione intracellulare) è una outer membrane protein
colonizzazione della mucosa intestinale.
nota anche come VirG che si localizza a uno dei poli della cellula batterica, richiamando e attivando
proteine della cellula ospite che nel complesso catalizzano l’allungamento dei filamenti di actina.
Contemporaneamente, la proteina VirA secreta dal T3SS, degrada l’α-tubulina creando dei tunnel
attraverso i quali i batteri si muovono più facilmente all’interno del fitto citoscheletro in cui si
vengono a trovare.
Questa depolimerizzazione direzionale dell’actina conferisce una spinta propulsiva che permette al
batterio di spingere sulla membrana plasmatica a livello delle tight junctions di cellule adiacenti.
La sporgenza derivante può essere internalizzata dalle cellule vicine. Grazie all’azione di IpaB, C e
D la doppia membrana plasmatica viene lisata e Shigella viene liberata nel citoplasma dove può
iniziare un nuovo ciclo di replicazione e diffusione cellula-cellula.
Quindi, pur essendo prive di flagelli le Shigelle liberate nel citoplasma della cellula ospite si
muovono grazie alla polimerizzazione dell’actina in corrispondenza di uno dei due poli del batterio.
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38. Patogenesi di Shigella
La regolazione della trascrizione del gene icsA dipende anche dalla proteina nucleoide H-NS, che a
basse temperature (30ºC, ma non a 37ºC) interagisce con il promotore di icsA reprimendone la
trascrizione.
La proteina H-NS, a basse temperature, reprime la trascrizione anche di virF e virB, svolgendo un
ruolo diretto nel silenziamento del regulone della virulenza di Shigella al di fuori dell’ospite.
Il filamento complementare al gene icsA contiene un gene che codifica un RNA antisenso di 450
nucleotidi chiamato RnaG che non viene tradotto, ma che blocca la trascrizione del nascente
messaggero di icsA (80 dei 450 nucleotidi di RnaG formano il cosiddetto kissing complex con
l’mRNA icsA bloccandone prematuramente la trascrizione).
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39. La curvatura del promotore di virF determina l’attivazione
trascrizionale da parte di H-NS
Tra gli eventi primari che avvengono in Shigella quando penetra nell’uomo vi è la sintesi della
proteina VirF che attiva a cascata diversi operoni con funzioni diverse.
È stato fatto che H-NS interagisse con il promotore di virFtemperature al ditemperature32°C,
Il dimostrato che tale attivazione avviene solo a solo a particolari sopra dei
fece ipotizzare che ciò fosse dovuto a una modifica strutturale (supercoiling) del DNA
mentre a temperature inferiori H-NS reprime l’espressione di virF interagendo con il promotore
di virF in due siti specifici. target.
La proteina H-NS, a basse temperature, reprime la trascrizione di virF e virB, svolgendo un
ruolo diretto nel silenziamento del regulone della virulenza di Shigella al di fuori dell’ospite.
A basse temperature (< 32°C) i due siti di riconoscimento di H-NS del promotore di virF sono
occupati dalla proteina H-NS che ripiegando il DNA forma una struttura stabile impedendo l’accesso
all’RNA polimerasi e quindi la trascrizione.
A 37°C questo frammento di DNA viene rilassato impedendo che si formi il legame stabile tra H-NS e
il promotore e quindi l’RNA polimerasi può legarsi al promotore e attivare la trascrizione del gene virF.
Quindi il bending (ripiegamento) di questo tratto di DNA è dipendente da una particolare sequenza di
Il rilassamentofunziona da termosensore etrascrizione dal promotore virFlegame con H-NS e regola la
nucleotidi che del DNA che permette la altera in maniera reversibile il è stato anche ottenuto con
mutazioni indel gene virF. di promotore che mimano lo stesso fenomeno di quando la temperatura è
trascrizione questa regione
di 37°C.
L’induzione di 1/2 giro di elica, tramite l’inserimento di 4-6 bp, cambia l’orientamento dei siti I e II sul
promotore (e la relativa posizione di H-NS) così da permettere la trascrizione.
40. Shiga toxins
Le Shiga toxins (Stxs) sono enterotossine espresse da Shigella dysenteriae sierotipo 1 e alcuni ceppi
di E. coli denominati Stx-producing E.coli (STEC).
Tutte le Stxs presentano una struttura A-5B:
la subunità A (A, da active) è costituita da due frammenti A1 e A2 legati da un ponte disolfuro;
le 5 subunità B (B, da binding) formano un anello (pentamero) nel cui poro centrale è associata
(legame non covalente) l’estremità carbossi-terminale del frammento A2.
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41. Shiga toxins
Le subunità B si legano a un glicolipide di membrana delle cellule eucariotiche, il
globotriaosilceramide (Gb3).
Ogni pentamero B possiede 10-15 siti di legame Gb3, che sono alla base dell’alta affinità di legame
della tossina al recettore.
Tale legame porta all’endocitosi della tossina nella cellula ospite.
Gli endosomi contenenti Stxs sono indirizzati al Golgi attraverso il quale raggiungono il reticolo
endoplasmatico (trasporto retrogado).
All’interno del ER la subunità A subisce una proteolisi che porta alla scissione di A1 e A2.
Al frammento A1 è associata l’attività tossica delle Stxs, infatti essendo tale frammento una N-
glicosidasi, rimuove uno specifico residuo di adenina dalla subunità 28S dei ribosomi eucariotici (60S),
determinando l'inibizione della sintesi proteica, e morte cellulare. Oltre al blocco della sintesi proteica,
le Stxs inducono apoptosi in molte linee cellulari.
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