1. 0,30
0,45
0,60
0,75
0,90
Días
Fv/Fm
Control
Pb
0 2 4 7
*
*
*
*
*
Control
0
40
80
120
160
200
240
280
0 2 4 7
Días
mmoltocoferol/molclora+b
α-tocoferol
β+γ-tocoferol
Pb 200 uM
0 2 4 7
Días
α-tocoferol
β+γ-tocoferol
*
*
*
*
*
*
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
A+Z/VAZ
Control
Pb
*
*
*
60
90
120
150
Días
mmolVAZ/molclorofilaa+b
Control
Pb
*
*
0 2 4 7
0
5
10
15
20
25
30
nmolPBG/mgprot.h
2h 4h
*
*
* **
0
100
200
300
Control DA Pb DA+Pb
nmolALA/gPF
*
*
**
El Pb inhibe el enzima ALAD aunque su acción no es tan
efectiva como la del inhibidor específico DA.
La inhibición de ALAD produce una acumulación progresiva
de ALA que puede ser responsable de la generación de ROS.
Lemna minor en presencia de Pb activa rápidamente los
mecanismos de fotoprotección acumulando xantofilas (VAZ),
incrementando el índice de de-epoxidación y disminuyendo la
eficiencia fotoquímica del PSII.
Finalmente, L. minor acumula tocoferoles en respuesta al
estrés oxidativo.
0
30
60
90
120
150
Días
nmolALA/gPF
Pb
Control
*
*
*
0 2 4 7
0
20
40
60
80
nmolPBG/mgprot.h
Control
Pb **
*
0
10
20
30
40
0 12 24 36 48
Horas
Pb
C
6
*
*
30
40
50
60
0 12 24 36 48
Horas
Pb
C
*
*
*
6
María Asunción Galende, Oihana Barrutia, Ingrid Johana Méndez, José Ignacio García-Plazaola, Antonio Hernández, José María Becerril
Dpto. Biología Vegetal y Ecología. Universidad del País Vasco (UPV/EHU)
e-mail: mariaasuncion.galende@ehu.es
Objetivo
Materiales y métodos
AGRADECIMIENTOS: Este trabajo ha sido financiado por los proyectos ETORTEK BERRILUR III y UPV/EHU-GV IT-299-07. María A. Galende disfruta de una beca predoctoral
del Departemanto de Educación, Universidades e Investigación del Gobierno Vasco. Los autores agradecen el apoyo técnico y humano de la Dra. Azucena González del
Servicio Fitotrón y del Dr. Juan Carlos Raposo del Servicio Central de Análisis de los SGIker de la UPV/EHU.
XIX Reunión de la Sociedad Española de Fisiología Vegetal / XII Congreso Hispano-Luso de Fisiología Vegetal. Castelló de la Plana, 21-24 de Junio de 2011
Introducción
REFERENCIAS
• Naito K, Ebato T, Endo Y, Shimizu S (1980) Z. Pflanzenphysiol. 96: 95-102.
• Shneider HAW (1970) Z. Pflanzenphysiol. 62: 133-145.
• Becerril JM, Duke MV, Nandihalli UB, Matsumoto H, Duke S (1992) Physiol. Plantarum 86: 6-16.
• Zhao F, Mcgrath SP, Crosland AR (2004) Commun. Soil Sci. Plant Anal. 25: 407-418.
• García-Plazaola JI y Becerril JM (2001) Aust. J. Plant. Physiol. 28: 225-232.
• Hermes-Lima M (1995) Free Radic. Biol. Med. 19: 381-390.
• Noriega y cols. (2007) BioMetals 20: 841-851.
El Pb es un contaminante ambiental extremadamente tóxico para la salud de los seres vivos, incluidas las plantas. Al igual que otros metales
pesados, sus síntomas de fitotoxicidad incluyen reducción del crecimiento, clorosis e inducción de estrés oxidativo. Sin embargo, su
mecanismo molecular de acción y la interrelación con estos procesos en plantas aún no han sido establecidos. El Pb inhibe varios puntos de la
ruta de la biosíntesis de porfirinas la cual produce moléculas esenciales como clorofilas y grupos hemo. Un enzima particularmente sensible es
el enzima ácido δ-aminolevulínico deshidratasa (ALAD), que actúa en la etapas iniciales de la ruta transformando el intermediario ácido δ-
aminolevulínico (ALA) en porfobilinógeno. En animales, la acumulación de ALA induce la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS)
que causan estrés oxidativo (Hermes-Lima, 1995). Sin embargo, este efecto del Pb no ha sido investigado en plantas.
Los ensayos se llevaron a cabo con plantas acuáticas de Lemna minor L. bajo condiciones ambientales controladas. Se llevaron a cabo dos ensayos exponiendo las plantas a 200 µM de Pb+2
durante 48 horas o 7 días. Posteriormente, se realizó un tercer ensayo exponiéndolas a 200 µM de Pb+2
y/o 1 mM de ácido dioxoheptanóico (DA), inhibidor específico de ALAD.
El enzima ALAD se extrajo según Naito y cols. (1980) y su actividad se determinó según Shneider (1970). La concentración de ALA se determinó según Becerril y cols. (1992). La concentración
de Pb en la planta se determinó mediante ICP-AES tras digestión con HNO3:HClO4 (85:15%) (Zhao y cols.,1994). La eficiencia fotoquímica del fotosistema II (Fv/Fm) se determinó con un
fluorímetro portátil de luz modulada, y los pigmentos y tocoferoles se determinaron mediante HPLC según García-Plazaola y Becerril (2001).
Resultados y discusión
LA INHIBICIÓN DE LA RUTA DE BIOSÍNTESIS DE CLOROFILAS
POR EL PLOMO INDUCE UNA RESPUESTA ANTIOXIDANTE
PRECOZ EN PLANTAS
Las plantas de Lemna minor expuestas a Pb acumularon este metal de forma
progresiva durante el experimento (Fig. 1a) y mostraron una reducción
significativa del crecimiento a partir del 2º día (Fig. 1b). Además, Se produjo una
rápida y gran inhibición del enzima ALAD (Fig. 2a) a partir de las 24 h de
exposición al Pb. Esta inhibición justifica los síntomas cloróticos causados por
este metal. Por otra parte, la inhibición de ALAD provocó una acumulación
progresiva de ALA, hasta alcanzar un valor 4 veces superior al inicial al final del
ensayo (Fig. 2b).
Las plantas mostraron un incremento progresivo de los niveles de xantofilas del
ciclo VAZ (Fig. 3b) y una rápida inducción del índice de de-epoxidación (Fig. 3a)
concomitante con una disminución del índice Fv/Fm (Fig. 3c). Todo ellos son
síntomas de la activación precoz de los sistemas de fotoprotección.
Posteriormente, a partir del día 2, se observó un aumento significativo del
contenido en tocoferoles, especialmente los isómeros β+γ-tocoferol, indicadores
de una respuesta antioxidante (Fig. 3d). El Pb no realiza reacciones tipo Fenton
y por ello no está claro su modo de acción en la generación de estrés oxidativo
en plantas. Noriega y cols. (2007) indicaron que la acumulación de ALA y
compuestos derivados de su oxidación pueden ser los responsables de la
generación de ROS.
La inhibición de ALAD causada por el Pb fue menos efectiva que la generada
por DA, inhibidor específico de este enzima, como se observa en la propia
inhibición del enzima (Fig. 4a) y en la acumulación de ALA en tan solo 4 horas
(Fig. 4b). Sin embargo, el efecto sinérgico observado cuando ambos inhibidores
se aplican de forma conjunta indica que además de la inhibición indicada el Pb
provoca una desregulación de la ruta de biosíntesis de las porfirinas.
Conclusiones
b) Biomasa
a) Pb en Lemna minor a) ALA-D
b) ALA
a) ALA-D
b) ALA
d) Tocoferoles
b) VAZ
c) Fv/Fm
a) A+Z/VAZ
Determinar el efecto del
Pb en la biosíntesis de
ALA y de este
intermediario en la
inducción de mecanismos
de fotoprotección y la
respuesta antioxidante de
plantas de Lemna minor.
Fig. 3
Fig. 2
Fig. 4
Fig. 1
* Los asteriscos indican diferencias significativas entre los tratamientos y el control (P<0,05).
gPb/kgPS
Pb
Control
*
*
*
0,0
1,5
3,0
4,5
Días
gPF
Pb
Control
***
0
40
90
140
190
