oleh Nanang, Yuliani, Rosita, Eka

1. HIDROLISIS SELULOSAPADARUMPUTLAUTDENGANCRUDEENZIM
SELULASE DARI KULITSINGKONG

2. BAB 1. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Hidrolisis konvensional menggunakan
asam tidak ramah lingkungan
Hidrolisis Enzimatik lebih efisien
Rumput laut mengandung polisakarida
(selulosa)
Selulosa dihidrolisis menggunakan
Crude Enzim selulase dari singkong
Analisis menggunakan reagen DNSA
dan Sprektroskopi UV-Vis

3. 1.1 Rumusan Masalah
1.2 Tujuan
1. Bagaimana cara mengisolasi enzim dari bakteri penghasil enzim
selulase pada kulit singkong?
2. Bagaimana aktivitas crude enzim selulase pada substrat CMC
(Carboxy Methyl Cellulose)?
3. Bagaimana reaksi hidrolisis crude enzim selulase dari kulit singkong
terhadap sampel rumput laut?
1. Mengetahui cara mengisolasi crude enzim selulase dari kulit
singkong
2. Mengetahui uji aktivitas crude enzim selulase pada substrat CMC
(Carboxy Methyl Cellulose)
3. Mengetahui reaksi hidrolisis crude enzim selulase dari kulit singkong
terhadap sampel rumput laut

4. BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA
Singkong (Manihot utilissima)
Hidrolisis Enzimatik
Selulosa adalah polisakarida yang
terdiri dari monomer glukosa
Rumput laut

5. BAB 3. METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Alat
Alat-alatnya yaitu tabung reaksi steril, rak tabung, cawan petri pipet mohr 5
mL dan pipet mohr 10 mL, pipet tetes, pinset, spektrofotometer vis, kuvet,
Erlenmeyer 250 mL, gelas ukur, labu ukur 10 ; 25 ; 50 mL, ball pipet,
beakerglass 250 mL ; 100 mL, kertas saring, aluminium foil, hotplate, lemari
pendingin, spatula, botol semprot, oven, blander, sentrifuse, lemari pendingin,
baskom, pisau
Kulit singkong (penghasil enzim selulase), Mikroalga atau rumput laut
(sampel), substrat selulase (Carbokxy Methyl Cellulose (CMC)) atau (oat
spelt xylan), Aquades, Glukosa standart atau silosa standart, reagen DNSA
(Dinitrosalicylic acid), bufer fosfat pH 7, Natrium Tartat
3.2 Bahan

6. 3.2.1 Isolasi Crude Enzim Selulase dari Kulit Singkong
Kulit Singkong
Hasil
 Dicuci dengan air hingga bersih kemudian ditiriskan
 Dipotong kecil-kecil
 Dimasukkan ke dalam blender sebanyak 100 mL gram dan ditambah
100 mL fosfat pH 7
Diblender hingga halus
 Disaring slory yang didapat menggunakan kertas saring
 Disentrifugasi filtratnya dengan kecepatan 4200 rpm selama 80
menit
 Diambil Supernatan yang diperoleh, yang merupakan crude enzim
selulase dan selanjutnya akan di uji aktivitasnya
3.2 Prosedur Kerja

7. 3.2.2 Uji Aktivitas Crude Enzim Selulase pada Substrat
CMC3.2.2.1 Preparasi Larutan Substrat CMC (Carboxy Methyl Cellulose)
Substrat CMC 1%
Hasil
 Ditimbang serbuk CMC sebanyak 0,25 gram
 Dilarutkan dalam labu ukur 25 mL dengan pelarut buffer fosfat pH 7
Substrat CMC 1%
Hasil
 Dimasukkan substrat CMC sebanyak 5 mL masing-masing ke dalam tiga
tabung reaksi berbeda
 Ditambahkan 5 mL aquades pada tabung reaksi pertama, tabung reaksi
kedua ditambah crude enzim selulase yang sudah dipanaskan (enzim
inaktif), dan tabung reaksi ketiga ditambah crude enzim selulase dingin.
 Dilakukan inkubasi pada suhu kamar (25oC) selama 4 hari
3.2.2.2 Hidrolisis Enzimatik pada Substrat CMC

8. 3.2.3 Pembuatan Kurva Kalibrasi Glukosa Standart
3.2.3.1 Pembuatan Larutan Glukosa Standar
Glukosa Standart
Hasil
 Dibuat Larutan glukosa standart 0,01 M
 Diencerkan dengan cara ditempatkan pada labu ukur
kemudian ditambah aquades sampai tanda batas dan
dipindahkan ke tabung reaksi
 Dibuat larutan standar menjadi variasi konsentrasi 0 ; 0,0005 ;
0,0010 ; 0,0020 ; 0,0025 M

9. 3.2.3.2 Persiapan Pengukuran Absorbansi
Glukosa Standart (Variasi Konsentrasi)
Hasil
 Diambil larutan glukosa standart masing-masing sebanyak 0,5 mL
dan dimasukkan dalam tabung reaksi yang berbeda,
 Ditambah masing-masing tabung reaksi dengan 1,5 mL reagen
DNSA (Dinitrosalicylic acid) dan 0,5 mL Natrium Tartat.
 Dipanaskan tabung reaksi tersebut selama 5 menit menggunakan
penangas air
 Diamati Warna larutan sebelum dan sesudah pemanasan diamati.

10. 3.2.3.3 Pengukuran Absorbansi dan Pembuatan Kurva Kalibrasi
Glukosa Standart + Reagen DNSA + Na Tartat
Hasil
 Dimasukkan larutan tersebut ke dalam kuvet dimulai dari blanko
sampai konsentrasi terbesar
 Diukur absorbansinya menggunakan Spektrofotometer Visible pada
panjang gelombang 540 nm.
 Dibuat grafik hasil nilai absorbansi larutan glukosa standar sehingga
didapat persamaan y = ax + b

11. 3.2.4 Uji Real Sampel
3.2.4.1 Preparasi Sampel
Rumput Laut
Hasil
 Dicuci menggunakan air kemudian ditiriskan
 Ditimbang sebanyak 100 gram
 Diblender menggunakan pelarut aquades sebanyak 100 mL
 Diambil slory yang didapat untuk uji berikutnya

12. 3.2.4.2 Hidrolisis Enzimatik Pada Rumput Laut Menggunakan
Variasi Volume Crude Enzim
Sampel Rumput Laut
Hasil
 Diambil slory dengan takaran yang sama dan dimasukkan ke dalam
lima tabung reaksi
 Ditambah masing-masing tabung reaksi dengan 4 mL aquades
 Ditambah tabung reaksi pertama dengan 5 mL crude enzim selulase
yang sudah dipanaskan (enzim inaktif), tabung reaksi kedua sampai ke
lima secara berurutan ditambah crude enzim selulase dingin sebanyak
1 ; 2 ; 4 ; 5 mL
 Ditutup tabung rekasi tersebut dengan aluminium foil
 Dilakukan inkubasi selama 4 hari pada suhu kamar (25oC)

13. 3.2.5 Analisis Kuantitatif Glukosa Menggunakan Metode
KolorimetriSampel Rumput Laut (Hasil Inkubasi)
Hasil
 Diambil masing-masing sebanyak sebanyak 0,5 mL dan dimasukkan
dalam tabung reaksi yang berbeda
 Ditambah masing-masing tabung reaksi dengan 1,5 mL reagen DNSA dan
0,5 mL Natrium Tartat
 Dipanaskan tabung reaksi tersebut dipanaskan selama 5 menit
menggunakan penangas air
 Diamati Warna larutan sebelum dan sesudah pemanasan (apabila larutan
berwarna pekat maka harus diencerkan dengan aquades)
 Dimasukkan larutan tersebut ke dalam kuvet dimulai dari tabung reaksi
pertama (dari blanko ke konsentrasi paling tinggi)
 Diukur absorbansinya menggunakan Spektrofotometer Visible pada
panjang gelombang 540 nm.
 Dihitung konsentrasi glukosa berdasarkan hasil absorbansi dan persamaan
kurva kalibrasi (apabila larutan sebelumnya diencerkan, setelah didapat
nilai konsentrasi glukosa maka dikalikan dengan faktor pengencerannya)

14. BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
Crude Enzim Selulase dari Singkong
Berwarna kuning,
4.1.1 Crude Enzim Selulase

15. 4.1.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi Glukosa Standart
No
C
Glukosa
Standart
(M)
Absorbansi (A)
pada 540 nm
1 0 0,147
2 0,0005 0,166
3 0,0010 0,459
4 0,0020 0,892
5 0,0025 1,483
1 ; 2 ; 3 ; 4 ; 5
Foto
(Setelah Pemanasan 5-10
menit dan diukur
Absorbansinya

16. y = 524.91x - 0.0005
R² = 0.9299
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
0 0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.0025 0.003
Absorbansi(A)
Konsentrasi (C)
Kurva Kalibrasi Glukosa Standart
Series1
Linear (Series1)

17. 4.1.3 Uji Aktivitas Crude Enzim Selulase
No Analit
Absorbansi
(A)
C Glukosa (M)
Hasil
Perhitungan
C x Faktor
Pengenceran
(10)
1
Aquades + Substrat
CMC (Tanpa
Pengenceran)
0,177 - -
2
Crude enzim selulase
panas + Substrat CMC
0,391 0,000744 0,00744
3
Crude enzim selulase
dingin + Substrat CMC
0,288 0,000548 0,00548
Hasil Setelah Inkubasi 4 hari Setelah penambahan
DNSA dan Pemanasan
Setelah pengenceran 10 kali
1 ; 2 ; 3 2 ; 31 ; 2 ; 3

18. 4.1.3 Uji Real Sampel Rumput Laut
No Analit
Absorbansi
(A)
C Glukosa
(M)
Hasil
Perhitungan
C x Faktor
Pengenceran
(10)
1
Sampel + Crude enzim
selulase panas 5 mL
(Tanpa Pengenceran)
1,048 0,0019 0,0019
2
Sampel + Crude enzim
selulase dingin 1 mL
0,121 0,000230 0,00230
3
Sampel + Crude enzim
selulase dingin 2 mL
0,223 0,000424 0,00424
4
Sampel + Crude enzim
selulase dingin 4 mL
0,279 0,000531 0,00531
5
Sampel + Crude enzim
selulase dingin 5 mL
0,289 0,000550 0,00550

19. Foto Uji Real Sampel Rumput Laut
Hasil Setelah
Inkubasi 4 hari
Setelah penambahan
DNSA dan Pemanasan
1 ; 2 ; 3 ; 4 ; 5 1 ; 5 ; 4 ; 3 ; 2 5 ; 4 ; 3 ; 2
Setelah pengenceran
10 kali

20. Perbandingan Struktur CMC dan Selulosa
4.2 Pembahasan

21. Enzim Selulase
• Endo-β-1,4-Dglukanase : memecah ikatan
internal glukosidik yang berada diantara rantai
glukan yang utuh
• Exo-β-1,4-Dglukanase/exo-β-1,4-
selobiohidrolase : memecah dimer selobiosa dari
rantai glukan dan melepaskannya ke dalam
larutan
• β-glukosidase : menyempurnakan hidrolisis
selulosa menjadi glukosa dengan memecah
selobiosa menjadi monomer glukosa

22. Reaksi Hidrolisis Enzim Selulase pada Substrat
CMC

23. Reaksi Hidrolisis Enzim Selulase pada Selulosa

24. BAB 5. PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan
bahwa :
1. Crude enzim selulase bisa diisolasi dari kulit singkong dengan cara
memblender kulit singkong menggunakan buffer fosfat pH 7 dan
slorynya disentrifugasi. Supernatan yang dihasilkan merupakan
crude enzimnya.
2. Uji aktivitas pada praktikum ini tidak mendapat hasil yang baik
karena enzim innaktif seharusnya memberikan absorbansi lebih
kecil dari pada enzim aktif (dingin).
3. Reaksi hidrolisis enzimatik dari Crude enzim selulase dengan
selulosa pada rumput laut bisa diamati, dimana konsentrasi
glukosa yang dihasilkan pada variasi volume enzim dingin 1 ; 2 ; 4
; 5 mL yaitu secara berurutan 0,00230 ; 0,00424 ; 0,00531 ; 0,0050
M.

25. 5.2 Saran
• Peralatan serta tempat praktikum harus lebih bersih.
• Perlu ditinjau tentang keadaan substrat dan reagen yang
dibutuhkan, apakah masih layak pakai atau tidak.
• Crude enzim hasil isolasi tidak terlalu lama didiamkan
dalam kulkas.