Este documento describe el análisis de proteínas de fusión de translocaciones cromosómicas mediante citometría de flujo. Se detalla la detección de la proteína de fusión BCR-ABL t(9;22) y su especificidad y sensibilidad. También se muestran resultados preliminares de la detección de otras proteínas de fusión como E2A-PBX1.

1. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE
TRANSLOCACIONES CROMOSÓMICAS
POR CITOMETRÍA DE FLUJO
CENTRO DE INVESTIGACIÓN DEL CÁNCER.
UNIVERSIDAD Y HOSPITAL UNIVERSITARIO DE
SALAMANCA. SALAMANCA, ESPAÑA
Juan Flores Montero, MD
REUNION ANULAL RTICC, MADRID, NOVIEMBRE 2008

2. Proteínas de fusión
fusion gene
5' gene A gene B 3'
transcription
A
translation B
A
A
A B
B
B

3. Puntos de corte de t(9;22)(q34;q11) en genes BCR y ABL
BCR gene (# 22q11)
utr utr
m-bcr M-bcr μ-bcr
tel
~55 kb ~2.9 kb ~1 kb
cen
ABL gene (# 9q34)
utr utr
breakpoint region
tel
~200 kb
cen
J.J.M. van Dongen et al., BIOMED-1 Report, LEUKEMIA 1999;13:1901-1928

4. DETECCIÓN DE PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE
TRANSLOCACIONES CROMOSÓMICAS POR CMF
Patentes: US 6,610,498 B1 (26 de agosto de 2003)
US 6,686,165 B2 (3 de febrero de 2004)
beads coated
with anti-A bead
antibody
fusion gene
5' gene A gene B 3'
bead
transcription A A
cell lysate
A B B
translation A
B A
A B A B
B B
B
A
A
B
bead
FITC-conjugated
A
anti-B antibody
B

5. Detección de la proteína de fusión BCR-ABL t(9;22) por CMF
usando microesferas (BD™ CBA Flex beads): Especificidad
Black: 697 (t(1;19), neg. control)
Blue: TOM-1, BCR-ABL+ (p190)
Green: LAMA-84 BCR-ABL+ (p210)
Purple: AR230, BCR-ABL+ (p230)
Catching antibody: anti-BCR (clone 3E2C10)
Bead: BD-Flex bead (A7)
Detection antibody: biotinylated anti-ABL (clone 8E9) + SA-PE

6. signal/noise ratio CBA
0.1
1
10
100
1000
Dyn06-00
Dyn06-003
Dyn06-004
Dyn06-007
Dyn06-008
Dyn06-008
Dyn06-009
Dyn06-010
Dyn06-010
Dyn06-02
Dyn06-022
Dyn06-01
same sample tested in 2 separate experiments Dyn06-012
Dyn06-013
patient with mutation close to a ABL-binding site
Dyn06-014
Dyn06-015
Dyn06-016
Dyn06-017
Dyn06-018
Dyn06-019
negative in PCR
positive in PCR
Dyn06-020
Detección de BCR-ABL en LLA pB al diagnóstico usando CBA

7. Detectión de microesferas con BD™ CBA Flex beads para la
proteína de fusión BCR-ABL t(9;22) por citometría de flujo:
Sensibilidad
Black: PBMNC (100%)
Green: 0.5% Lama-84
Purple: 1% Lama-84
Blue: 2% Lama-84
Orange: 100% Lama-84
Catching antibody: anti-BCR (clone 3E2C10)
Bead: BD-Flex bead (A7)
Detection antibody: biotinylated anti-ABL (clone 8E9) + SA-PE

8. EVALUACIÓN DEL KIT BCR-ABL RUO
POR EL GRUPO EuroFlow (n=144)
n=61 n=41 n=12 n=17 n=13

9. KIT BCR-ABL RUO: CONCLUSIONES
PRELIMINARES
.- Elevada sensibilidad y especificidad:
- Concordancia absoluta con los resultados de PCR:
12/41 LLA-pB (todos adultos)
12/12 LMC
0/29 LMA y LLA-T
.- Cantidad de proteína bcr/abl:
- Patrón heterogéneo con dos grupos de casos positivos:
● Expresión elevada: IMF ≥ 2.000
● Expresión relativamente baja: IMF ≥ 500 y < 2.000
- IMF de las muestras negativas < 150
.- Diferente patrón de expresión en LLA-pB y LMC:
LLA-pB: 83% (10/12) mostraron expresión elevada
LMC: 75% (9/12) mostraron expresión baja/intermedia*
*¿Expresión baja o activitad residual de proteasas?

10. PANEL DE TUBOS DE ESFERAS PARA LA
CLASIFICACIÓN DE LEUCEMIAS AGUDAS
Precursor-B-ALL AML ‘MLL’ T-ALL
BCR-ABL PML-RARA MLL-AF4 CALM-AF10
TEL-AML1 AML1-ETO MLL-AF9 LMO2
E2A-PBX1 CBFB-MYH11 MLL-AF10 HOX11L2
( MLL-AF4) MLL-ENL TAL1
MLL-AF6

11. E2A-PBX1: test en líneas celulares y muestras de
pacientes
5000
4000
3000
signal
2000
1000
0
Jurkat 697 healthy donor ALL patient ALL patient
no translocation t(1;19)
Conclusión: El CBA para E2A-PBX1 detecta la proteína
E2A-PBX1 en lisados de líneas celulares y muestras
de pacientes positivos para t(1;19)

12. Microesferas: nuevos diseños
TEL-AML1: especificidad AML1-ETO: especificidad
3000 900
800
2500
700
2000 600
signal
signal
1500 500
400
1000 300
500 200
100
0 0
697 K562 Lama RS4;11 REH Jurkat Lama-84 REH K562 697 Kasumi-1
Conclusión: El CBA para la detección de TEL-AML1 y AML1-ETO es
específico para las líneas celulares REH con t(12;21) y Kasumi
t(8;21), respectivamente.

13. DETECCIÓN SIMULTÁNEA DE LAS PROTEÍNAS DE
FUSIÓN BCR-ABL Y E2A-PBX
100% K562 100% 697
10% 697/K562 10% K562/697
R2 = green = BCR beads
R3 = pink = E2A beads

14. Valor diagnóstico del sistema de microesferas para
la detección de proteínas de fusión en leucemias
1. Por vez primera la citometría de flujo puede reemplazar
técnicas moleculares
2. Primer ensayo diagnóstico clínicamente relevante usando
microesferas
3. Herramienta novedosa directamente aplicable en el
diagnóstico de leucemias
4. De aplicación rápida y sencilla en cualquier laboratorio
diagnóstico con equipamiento para citometría de flujo
amplia diseminación en laboratorios médicos

15. www.euroflow.org EuroFlow participants
University Institutes / Medical Schools
Erasmus MC, Rotterdam, NL J.J.M. van Dongen, V.H.J. van der Velden
USAL, Salamanca, ES A. Orfao, J.F. San Miguel
IMM, Lisbon, PT P. Lucio, A. Parreira
UNIKIEL, Kiel, DE M. Kneba, M. Ritgen, S. Böttcher
AP-HP, Paris, FR E. Macintyre, V. Asnafi
UNIVLEEDS, Leeds, GB S. Richards, A.C. Rawstron
DPH/O, Prague, CZ O. Hrusak, J. Trka
SAM, Zabrze, PL T. Szczepanski
Companies (SME’s)
DYNOMICS, Rotterdam, NL Peter Schoevers, Liesbeth Dekking, R.
Noordijk. A. van der Linden
CYTOGNOS, Salamanca, ES M. Martin, M. Castaño, A. Rodríguez Prieto,
J. Bensadon