Este documento describe un protocolo modificado de mutagénesis dirigida de un solo paso que permite la eliminación, inserción y mutaciones de sitios múltiples en un plásmido. El método utiliza cebadores de PCR diseñados con secuencias no superpuestas y complementarias entre sí para sintetizar ADN mutante que luego se transforma en células bacterianas. El protocolo modificado se utilizó con éxito para realizar diversas mutaciones, incluidas inserciones y deleciones, en un gen clonado de Staphylococcus

1. UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO
INGENIERÍA BIOQUÍMICA
Ingeniería de las enzimas
Un protocolo eficaz de mutagénesis de plásmidos de
eliminación, inserción, de sitio único y de sitios
múltiples en un solo paso.
INTEGRANTES:
CISNEROS RUTH
GAVILÁNEZ CHRISTIAN
LIZANO CESAR
ADRIANA RODRIGUEZ
CURSO: 8VO Bioquímica “U”
DOCENTE: Dra. Cecilia Carpio

2. Introducción
La mutagénesis dirigida
al sitio es un gran
adelanto de la biología
molecular moderna que
permite un control
exquisito de la
secuencia de proteínas.
QuikChange ™ funciona
utilizando un par de
cebadores
complementarios con
una mutación.
En una ronda de ciclos
de PCR, estos
cebadores se acoplan al
ADN plantilla,
replicando el ADN
plasmídico con la
mutación.
El producto de ADN
mutante tiene una
rotura de hebra (nick)

3.  El conjunto de ADN resultante (mutante y parental) se trata luego con
Dpnl (endonucleasa dependiente de la metilación) para destruir el ADN
metilado parental del ADN mutante no metilado recién sintetizado y se
transforma en células de E. coli, donde la mella se une por enzimas
reparadoras del huésped.
Los cebadores se
adaptaron
específicamente a las
plantillas parentales.
Extensiones de
cebadores en el
primer ciclo de PCR
usando ADN
plasmídico parental
como plantillas.
Los cebadores unen
las nicks y usan el ADN
recién sintetizado
como plantillas. Estas
fallas en el panel A
están marcadas con x

4. El método modificado utiliza cebadores que contienen
secuencias no superpuestas extendidas en el extremo 3´
y secuencias complementarias de cebador-cebador en el
extremo 5’.
Se utilizá este método modificado para realizar diversas
mutaciones, incluidas inserciones (18 residuos) y
deleciones (25 residuos) en un gen vraR clonado de
Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) .
También se a utilizado cuatro cebadores para crear
mutaciones, eliminaciones e inserciones de sitios
múltiples. Este procedimiento modificado ha demostrado
ser altamente eficiente.