Proyecto de Investigación MAster en Nutrigenomica y NUtrición Personalizada

1. LOS TRITERPENOS DE ORIGEN VEGETAL:INTERÉS COMO MICRONUTRIENTES
MEMORIA DE PRACTICUM INVESTIGACIÓN EN NUTRIGENÓMICA Y NUTRICIÓN
PERSONALIZADA
JUAN PABLO CÓRDOBA RADA
TUTOR:
FRANCISCA BARCELÓ
UNIVERSIDAD DE LAS ISLAS BALEARES
MASTER EN NUTRIGENÓMICA Y NUTRICIÓN
PERSONALIZADA
JUNIO, 2010

2. RESUMEN
Introducción. Los ácidos triterpénicos (TTPs) como el ácido oleanólico (OLA), vienen
siendo objeto de estudios durante los últimos años, debido a que se ha encontrado en
ellos diferentes efectos benéficos como: antioxidantes, anticancerigenicos, efecto
hepatoprotector, anti-VIH, entre otros.
Objetivos. Establecer el poder anti-proliferativo del OLA como agente único o en
combinación con la Doxorubicina (DXR), con el fin de establecer una posible potenciación
en 2 tipos de líneas celulares cancerígenas (SKUT-1 y SW982). Se utilizarán 3 tipos de
técnicas. Se realizarán ensayos de viabilidad por MTT, para establecer las células que
permanecen después del tratamiento con los compuestos, ensayos de citometría de flujo
para conocer la cantidad de DXR intracelular después del tratamiento con los
compuestos, inhibición de la actividad de Pgp por acción de los fármacos (citometria de
flujo) y disminución de la expresión de la Pgp por el tratamiento con los compuestos
(western Blot)
Resultados. El OLA es capaz de reducir la viabilidad de forma estadísticamente
significativa de las células tumorales con las que se realizó el estudio cuando se mezcla a
concentraciones determinadas con él fármaco. Este estudio determina que realmente la
mezcla de DXR y OLA provoca la muerte de la célula tumoral, por lo tanto se intenta
encontrar una respuesta de cómo lo hace. En el experimento de DXR intracelular se
encuentra que existe menos salida de DXR de las células, lo que sugiere que el OLA hace
que este fármaco permanezca más tiempo dentro de la célula tumoral y se consiga así
una muerte de estas. Posteriormente se estudia la actividad de la Pgp, que es una
proteína que se sobre-expresa en las células cancerosas y que está asociada a la
expulsión del DXR de la célula, en la que se encuentra que el OLA no altera la actividad
de dicha proteína, pero la literatura muestra que podría disminuir la actividad de otras
proteínas asociadas con la misma función (ABCC1). Finalmente se establece la expresión
de la Pgp por acción del OLA y sus respectivas mezclas con el fármaco DXR mediante
SDS-PAGE y se concluye que el OLA no afecta la expresión de esta proteína.
Conclusiones: Una buena opción es utilizar el OLA en la dieta como un micronutriente
que se encuentra disponible en la aceituna, frijol, garbanzo, lentejas, entre otros
alimentos. La ingesta de este micronutriente se puede utilizar en acción exclusiva o como
“potenciador” de la DXR.

3. TABLA DE CONTENIDO
Abreviaturas 4
1. INTRODUCCIÓN 5
1.1 Ácidos triterpénicos 6
1.1.1 Ácido oleanólico (OLA) 6
1.1.2 Ácido ursólico (UA) 8
1.1.3 Ácido maslínico (MA) 9
2. OBJETIVOS 10
2.1 Objetivo general del trabajo de investigación 10
2.2 Objetivos específico del trabajo de investigación 10
3. MATERIALES 11
3.1 Compuestos purificados 11
3.2 Cultivo celular 11
4 MÉTODOS 11
4.1 Protocolo del cultivo celular 11
4.2 Fundamento de un experimento de viabilidad celular 12
4.2.1 Protocolo del Experimento de Viabilidad celular por MTT 12
(Method of transcriptional and translational)
4.3 Citometría de flujo 13
4.3.1 Fundamento de un experimento de Citometría de flujo 14
4.3.2 Protocolo de DXR intracelular por citometría de flujo 14
4.4 Acumulación intracelular de Rodamina 123 por citometría de flujo 15
4.5 Western blot. 16
4.5.1 Expresión de Pgp en la célula tumoral por SDS-PAGE revelado 16
por Western Blot
4.6 Estadística 17
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 18
5.1 Viabilidad de las células SKUT-1 y SW982 mediante el tratamiento 18
con DXR y con DXR+OLA
5.2 DXR intracelular en líneas celulares SKUT-1 y SW982 19
5.3 Acumulación intracelular de R-123 por citometría de flujo 21
5.4 Expresión de Pgp en célula tumoral revelado por Western Blot 23
6. CONCLUSIONES 25
7. REFERENCIAS 27

4. Abreviaturas
TTP Ácido triterpenico pentacíclico
Ácido Oleanólico OLA
Ácido Ursólico UA
Ácido Maslínico MA
Doxorubicina DXR
Dimetil sulfoxido DMSO
Phosphate buffered saline pH 7.4 PBS
P-glucoproteína Pgp
Rodamina 123 R-123
4

5. 1. INTRODUCCIÓN
Los triterpenos pentaciclicos son biosintetizados en las plantas a partir de los ciclos de
escualeno. Entre los ácidos triterpénicos pentacíclicos (TTPs) cabe citar: el ácido oleanólico
(OLA), el ácido maslínico (MA) y el ácido ursólico (UA) (Figura 1). Los TTPs están presentes en
un amplio rango de plantas y en la oliva (concretamente aceite de orujo de oliva), formando así
parte de la dieta mediterránea. (Tabla 1). Existe relativamente poca información sobre su
distribución en los alimentos. Un estudio realizado por un grupo de investigación griego
determinó la cantidad de ácidos triterpénicos en una serie de leguminosas después de ser
sometidas al proceso de cocción, en donde se encontró que el garbanzo contiene los niveles
más altos de ácidos triterpénicos (8,54 mg/100g) (Tabla 2)
En los últimos años, existe un interés creciente por mejorar los alimentos fortificados, conocidos
como alimentos funcionales. Estos son alimentos naturales o procesados que además de sus
componentes nutritivos contienen componentes adicionales que pueden promover la salud y/o
prevenir enfermedades, entre los cuales están los TTPs.
Los ácidos triterpénicos se han utilizado por más de 2000 años en la medicina asiática
tradicional como agentes antiinflamatorios y anti-cancerígenos. los cuales estos supuestos
beneficios se han seguido analizando en estudios preclínicos y epidemiológicos(Liu, 1995).
Actualmente se estudian las bases moleculares de sus notables efectos como micronutrientes
en diversas enfermedades, entre las cuales cabe citar en el contexto de esta memoria su
actividad anti-tumoral (Karpova et al, 2006; Shishodia et al, 2003).
Por lo tanto, la búsqueda de compuestos nutritivos potenciadores y de baja toxicidad como los
TTPs que son capaces de inducir la apoptosis de las células cancerígenas, se encuentra aún en
investigación.
Figura 1. Estructura de ácidos triterpénicos.
5

6. Tabla 1. Contenido de ácidos triterpénicos (mg/Kg de oliva fresca) de olivas comerciales
Cultivo Presentación Ácido Maslínico Ácido Oleanólico
Manzanilla Aceitunas verdes 384.1 +/- 50.0 202.6 +/- 57.3
Manzanilla Aceitunas verdes sin hueso 497.3 +/- 87.8 330.0 +/- 185.7
Manzanilla Aceitunas verdes rellenas de pimiento 355.5 +/- 88.4 191.2 +/- 89.7
Hojiblanca Aceitunas verdes 904.7 +/- 259.6 565.2 +/- 107.1
Gordal Aceitunas verdes 414.2 +/- 89.3 294.3 +/- 4.5
Manzanilla Aceitunas negras 287.1 +/- 66.6 178.8 +/- 43.7
Manzanilla Aceitunas negras sin hueso 290.7 +/- 129.1 169.7 +/- 121.0
Hojiblanca Aceitunas negras 506.8 +/- 232.5 364.5 +/- 242.3
Cacereña Aceitunas negras 295.1 +/- 203.9 185.1 +/- 121.1
Manzanilla Aceitunas claras 824.9 +/- 179.5 247.2 +/- 61.4
Kalamata Aceitunas negras naturales 1318.4 +/- 401.0 841.4 +/- 162.9
Adaptado de: Romero C, et al. 2010
Tabla 2. Contenido de ácidos triterpénicos en leguminosas secas cocidas (µg/100 g producto
seco)
Compuesto Habas Garbanzo Guisante Guisante Lenteja Lenteja Frijol Frijol
amarillo verde larga redonda gigante grande
OLA 1237.9 358.9 929.8 716.1 419.8 528.7 1283.5 251.8
UA 1581.2 1994.7 nd Nd 447.2 473.5 nd Nd
MA nd 6191.4 nd Nd 3947.8 2625.9 nd Nd
Total TTPs 2819.1 8545.0 929.8 716.1 4814.6 3628.1 1283.5 400.3
Kalogeropoulos N, et al. 2010
1.1 Ácidos triterpénicos
Se realiza una descripción de las propiedades de tres de los TTPs más representativos
1.1.1 Ácido oleanólico (OLA):
Se ha identificado como una aglicona entre la multitud de saponinas triterpenoides de plantas
medicinales, como componente activo de plantas y contribuye varios efectos biológicos y
farmacológicos. Este compuesto presenta una serie de actividades que se describen a
continuación:
Actividad antiinflamatoria
Los efectos antiinflamatorios del OLA fue descrito en la década de los 60’s y su mecanismo de
acción puede resumirse así:
6

7. • La inhibición de la liberación de histamina desde mastocitos, inducida por 48/80
compuestos y la concanavalina A o por la adriamicina.
• La inhibición de la elastasa. Los estudios "in vitro" demuestran que los OLA y UA tienen
una actividad inhibitoria de la elastasa de los leucocitos humanos con valores similares
de IC 50.
• Actividad anti-complementaria, posiblemente por la inhibición de la convertasa-C 3.
• La inhibición de la actividad de la lipooxigenasa y la ciclooxigenasa, reduciendo en esta
vía algunos agentes proinflamatorios generados en vía araquidonica. El OLA inhibe la
síntesis y liberación de la prostraglandin E2 y la leucotrina B.
• La inhibición (en una forma dependiente de la concentración) de la generación del anión
superóxido por los neutrófilos humanos y este efecto parece ser a través de la vía de la
proteína quinasa C independiente.
Además de las acciones del OLA sobre los mediadores de la inflamación, este triterpeno
también muestra actividad antiartrítica de forma significativa(Herrera et al, 2006).
Actividad hepatoprotectora
En numerosos estudios se ha demostrado el efecto hepatoprotector del OLA, tanto in vivo como
in vitro contra diferentes sustancias tóxicas a nivel hepático. Estos estudios hacen énfasis en la
eficacia del OLA en el daño hepático causado por el tetracloruro de carbono (CCL4), cadmio,
acetaminofén, entre otros(Herrera et al, 2006). El efecto hepatoprotector se ha atribuido a que el
OLA produce la inhibición de la expresión de la isoenzima CYP2E1, pero además del efecto
inhibidor de este CYP también se describen efectos farmacológicos como la actividad
antiinflamatoria mencionada anteriormente y la actividad anti-cancerígena. En China es utilizado
como medicamento para el tratamiento de enfermedades como hepatitis crónica y aguda(Qu et
al, 1994).
Actividad Anti-VIH
Estudios recientes buscan el efecto del OLA en las células mononucleares y macrófagos del
VIH. Los resultados muestran que el OLA fue capaz de inhibir la replicación del VIH con éxito en
los sistemas celulares utilizados. Parece que el OLA actúa como un inhibidor de la proteasa del
VIH(Kashiwada et al, 1998).
7

8. Actividad antitumoral
En experimentos se ha encontrado acción antitumoral del OLA, este efecto es mas remarcable
a nivel de tumores en promoción tanto en ensayos in vivo como in vitro(Ohigashi et al, 1986),
inhibe la angiogénesis(Sohn et al, 1995) y también atenúa la proliferación de los linfocitos
(leucemia). En Japón se recomienda el OLA para tratamiento del cáncer.
Efectos cardiovasculares
Se ha reportado los efectos benéficos del OLA y su isómero UA en eventos cardiovasculares.
Estudios preliminares han demostrado que estos dos compuestos son capaces de inhibir el
desarrollo de la hipertensión. En OLA y UA se ha observado efectos hipolipemiantes,
antioxidantes, diuréticos y hipoglicémicos en estudios in vivo, lo que contribuye a la acción anti-
hipertensiva (Herrera et al, 2006).
En un estudio realizado con OLA se ha logrado encontrar que este presenta posibles
propiedades terapeúticas en células embrionarias del riñón, como la activación del promotor
PPAR-α. Este efecto podría ser responsable del aumento metabólico en patologías como la
diabetes(Huang et al, 2005).
1.1.2 Ácido ursólico (UA)
En años recientes este compuesto ha atraído el interés porque ofrece efectos farmacológicos
combinados con baja toxicidad. Tanto en estudios in vitro como in vivo se ha demostrado que
presenta importantes funciones biológicas, como ejemplo la supresión de la expresión de la
inducción del lipopolisacarido (LPS) en células RAW264.7 y de 12-O-tet-recanoylprobol-13-
acetato (TPA)- inducido en la expresión tumoral(Ikeda et al, 2008). El UA es capaz de inducir
apoptosis en células tumorales y evitar la transformación maligna de las células
normales(Novotný et al, 2001). Este triterpeno es recomendado para terapia de cáncer de piel y
la preparación de cosméticos que contengan UA han sido patentados en Japón para la
prevención del cáncer de piel(Ikeda et al, 2008). Investigadores de la Universidad de Granada
han demostrado que la actividad de este compuesto es un inhibidor de proteasas, lo que
sugiere una posible aplicación en la lucha contra el VIH(Herrera et al, 2006). Las actividades
antioxidantes del UA contra radicales libres se ha venido estudiando. En esos experimentos se
8

9. observó que el UA reduce significativamente la peroxidación de lípidos por barrido de radicales
libres(Ikeda et al, 2008).
Adicionalmente una serie de nuevos derivados del UA, tienen efectos antioxidantes y anti-
inflamatorios y ahora son utilizados para el desarrollo de nuevos agentes quimiopreventivos que
pueden ser útiles para la terapia de tumores malignos(Ikeda et al, 2008).
1.1.3 Ácido maslínico (MA)
Investigaciones han demostrado recientemente que es un inhibidor de las proteasas, lo que
sugiere su actividad contra el VIH. Este ácido parece ser eficaz en el tratamiento de
enfermedades causadas por la serín-proteasa como es en el VIH. Adicionalmente se ha
reportado que el MA puede ser representante de una nueva clase de inhibidores de la
glucógeno fosforilasa y la actividad hipoglucemiante en ratones diabéticos inducidos por la
adrenalina (Wen et al, 2006). En un estudio realizado en ratones KK-Ay se encontró que el MA
genera una disminución significativa en los efectos hipoinsulinémicos, lo que hace que a este
compuesto un prometedor agente natural contra la diabetes, además de que ayuda a disminuir
los niveles de glucosa en sangre, el MA otorga efectos preventivos contra complicaciones de la
diabetes(Liu et al, 2007).
9

10. 2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo general del trabajo de investigación
Se examina los efectos antiproliferativos del OLA que fue aislado de la oliva (Olea europaea)
como agente único o en combinación con el fármaco antitumoral doxorubicina (DXR) para
estudiar si OLA potencia los efectos del fármaco en células SW982 (human synovial sarcoma
cell line) y SK-UT-1 (Human Leiomyosarcoma cell line), que presentan resistencia al fármaco.
2.2 Objetivo específico del trabajo de investigación
Evaluar de forma experimental el potencial efecto biológico del OLA como potenciador de la
actividad antitumoral del fármaco Doxorubicina mediante diversas técnicas experimentales. En
concreto:
- Viabilidad celular por MTT para determinar la muerte celular por acción de los fármacos.
- Doxorubicina intracelular mediante la citometría de flujo.
- Acumulación intracelular de R-123.
- Expresión de Pgp en la célula tumoral a causa del tratamiento con DXR y OLA por la
técnica de electroforesis SDS PAGE.
10

11. 3. MATERIALES
3.1 Compuestos purificados
El ácido triterpénico purificado OLA, la DXR y la R-123 fueron adquiridos en Sigma-Aldrich Co.
3.2 Cultivo celular
El termino cultivo celular se define como el proceso mediante las células pueden cultivarse en
condiciones controladas.
El cultivo celular se realiza con 2 tipos de líneas celulares como son las SW982 y las SKUT-1,
las cuales fueron adquiridas en American Type Culture Collection (Manassas VA). Estas células
utilizan medio de cultivo establecido, para SW982 se utiliza el medio Leibovitz suplementado
con 10 % SBF, hepes 1mM y antiobioticos. Para las células SKUT-1 el medio D MEM
suplementado con 10 % suero, piruvato 1mM, hepes 1mM y aminoácidos no esenciales.
Las células SW982 fueron aisladas de un sarcoma sinovial bifásico de una mujer caucásica de
25 años de edad. Las células SKUT-1 fueron aisladas de un tumor mesodérmico consistente
con leiomiosarcoma en el útero en una mujer caucásica de 75 años.
4 MÉTODOS
4.1 Protocolo del cultivo celular
Se cuenta con células SKUT-1 y SW982 ya descongeladas y que permanecen en incubación a
37 ° con sus respectivos medios. Es necesario cont ar las células para cada tipo de
C
experimento en la cámara de neubauer.
El siguiente protocolo es para el cultivo de un tipo de células.
- Se retira el medio de cultivo de cada uno de los tipos de células que permanecen en las
botellas NUNC de cultivo.
- Se lava las células que permanecen en el fondo de la botella con PBS y posteriormente este
se retira.
- Se agrega 5 ml (aprox.) de solución de tripsina (20 % v/v en PBS) para soltar del fondo de la
botella las células y se introduce la botella a incubación por 5 min. (aprox.).
11

12. - Observar que las células estén sueltas del fondo de la botella en microscopio.
- Agregar 10 ml de medio respectivo al tipo de célula a la botella que permanece las células
con solución de tripsina.
- Se divide en volumen iguales (aprox. 7,5 ml) en tubos y se procede a centrifugar por 5 min. A
1800 rpm.
- Se desecha el sobrenadante y se agrega 1 ml de medio respectivo a uno de los tubos y se
mezcla con el pelet del otro tubo.
- Se lleva el resultado a un tubo de 50 ml y se le agregan 9 ml de su respectivo medio.
- Se toman las células que se necesiten utilizar para el experimento determinado conservando
como mínimo 1 ml que va a ir de regreso a la botella para su reproducción.
4.2 Fundamento de un experimento de viabilidad celular
La doxorubicina (DXR), es un antibiótico del tipo antraciclina(Figura 3), que es el actual
estándar de quimioterapia para sarcomas en tejido blando (STSs), que es un grupo
heterogéneo de neoplasmas(Villar, 2010). A pesar de la utilización clínica extensa, los
mecanismos de acción de DXR permanecen en debate. Los mecanismos encontrados son la
intercalación en su rol como agente intercalante, este fármaco encaja entre las bases de ADN y
bloquea su síntesis y su transcripción. Este agente además inhibe la actividad de la
topoisomerasa II, llevando al rompimiento en el ADN genómico. Los mecanismos anteriores
llevan a la ruptura del ADN que termina en la muerte celular(Head & Dodd, 2004).
Este ensayo de viabilidad celular se refiere a la cantidad de células que sobreviven a una
situación en particular. En este caso a las células cancerígenas que sobreviven a los
tratamientos planteados, como son el tratamiento con DXR y OLA.
4.2.1 Protocolo del Experimento de Viabilidad celular por MTT (Method of transcriptional
and translational)
Se utiliza el método desarrollado por Mosmann 1983. Este se basa en la reducción metabólica
del Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) realizada por la enzima
mitocondrial succinato-deshidrogenasa en un compuesto coloreado de color azul (formazan),
12

13. permitiendo determinar la funcionabilidad mitocondrial de las células tratadas. Se realizará un
estudio de viabilidad celular por MTT en un tiempo de 24 horas. Las células se siembran
(11.000 células SW982 y 8.000 células SKUT-1 por pozo) en placas de 96 pozos y dejan en
incubación por 24 horas, después de pasado ese tiempo se someten las células al tratamiento
planteado y se deja en incubación por 24 horas.
Para este ensayo se prepararon 5 mg de MTT por cada ml de buffer PBS. Se prepararon las
disoluciones a las concentraciones de los compuestos a utilizar en las células. En este ensayo
se analizará a los efectos de la DXR como único agente a diferentes concentraciones y en
acción conjunta con el OLA para observar sus efectos potenciadores. Posteriormente se
sometieron las células a un periodo de incubación por 2 horas aproximadamente. Una vez
pasado este tiempo se procede a medir la absorbancia en el equipo lector de placas (ASYS
UVM 340), en donde se obtiene los datos.
La longitud de onda utilizada fue de 590/650 nm para las células SKUT-1 y para las células
SW982 570 nm.
Tabla 3. Distribución de grupos viabilidad celular MTT
Células SW982 Células SKUT-1
Control Control
DXR 0,1 µM y DXR 0,1 µM+ OLA 80 µM DXR 0,1 µM y DXR 0,1 µM+ OLA 80 µM
DXR 0,5 µM y DXR 0,5 µM+ OLA 80 µM DXR 0,5 µM y DXR 0,5 µM+ OLA 80 µM
DXR 1 µM y DXR 1 µM+ OLA 80 µM DXR 1 µM y DXR 1 µM+ OLA 80 µM
DXR 5 µM y DXR 5 µM+ OLA 80 µM DXR 5 µM y DXR 5 µM+ OLA 80 µM
DXR 10 µM y DXR 10 µM+ OLA 80 µM DXR 10 µM y DXR 10 µM+ OLA 80 µM
4.3 Citometría de flujo
La citometría es el análisis de las características de las células, ya sea mediante la inspección
al microscopio o midiendo de manera automatizada propiedades particulares de las células.
13

14. 4.3.1 Fundamento de un experimento de Citometría de flujo
La citometría de flujo es una técnica de análisis celular que implica medir las características de
dispersión de luz y fluorescencia que poseen las células conforme se las hace pasar a través de
un rayo de luz.
4.3.2 Protocolo de DXR intracelular por citometría de flujo
En este ensayo se pretende cuantificar la retención de DXR por la célula tumoral, buscando
efectos potenciadores entre la DXR y el OLA. Se cuenta con 2 placas de cultivo de 24 pozos
cada una. En una de ellas se encuentran sembradas células SKUT-1 y en la otra placa células
SW982. En cada pozo se sembraron 40.000 células. Las células SW982 serán tratadas con
DXR 1 µM, las SKUT-1 con DXR 0,1 µM y cada una de estas líneas celulares serán también
tratadas con OLA a diferentes concentraciones de forma independiente y también se realizarán
mezclas entre estos para analizar los efectos potenciadores, este ensayo se realiza por
duplicado. Se agregaron 450 µL de las disoluciones en cada uno de los pozos según
correspondiera.
Tabla 4. Distribución de los grupos DXR intracelular
Células SW982 Células SKUT-1
Control + Etanol Control + Etanol
DXR 1µM DXR 0,1µM
OLA 10 µM OLA 10 µM
OLA 50 µM OLA 50 µM
OLA 80 µM OLA 80 µM
DXR 1 µM + OLA 10 µM DXR 0,1 µM + OLA 10 µM
DXR 1 µM + OLA 50 µM DXR 0,1 µM + OLA 50 µM
DXR 1 µM + OLA 80 µM DXR 0,1 µM + OLA 80 µM
14

15. Debido a que el OLA es poco soluble en DMSO, se utiliza el etanol al 0,8 % para lograr su total
disolución, motivo por el cual los controles llevan etanol para descartar que los efectos sean por
este compuesto.
Las células de las 2 placas se incubaron por 24 horas para evaluar el efecto del tratamiento con
los compuestos en este tiempo. Después de pasado este tiempo se aplicó el protocolo
correspondiente (retirar las disoluciones, lavar PBS las células, retirar PBS, agregar tripsina 20
% v/v en PBS e incubación hasta flotación de las células, bloqueo de la tripsina con medio de
cultivo (300 µL) para cada tipo de células). A continuación se procedió a centrifugar por 5 min. A
1800 rpm, se desechó el sobrenadante y se re-suspende el pellet con 300 µL de PBS.
Finalmente se utilizó el citómetro de flujo (COULTER EPICS XL-MCL™) en donde se contaron
15000 eventos y posteriormente se recopilan los datos en el software EXPO32.
4.4 Acumulación intracelular de Rodamina 123 por citometría de flujo
Se han identificado unos sustratos específicos de la proteína Pgp, mediante la cual se busca
que la aplicación de estos sustratos en las células tumorales el OLA produzca una disminución
en la actividad de esta proteína. La Pgp es una de las tantas que se han descrito junto con la
ABCC1 encargadas de expulsar a los fármacos que se utilizan en la quimioterapia(Braga et al,
2007). El sustratos a utilizar en este experimento es Rodamina 123 (R-123).
En células cancerígenas, la sobre expresión de Pgp es codificada por el gen MDR1 que
contribuye a la multidroga resistencia (MDR), la cual es actualmente considerada como uno de
los mayores obstáculos en la quimioterapia del cáncer(Ambudkar et al, 2003; Trambas et al,
1997).
Se cuenta con células SW982 (1 placa de 24 pozos). Se sembraron 40.000 células por pozo.
Se utilizó R-123 (Sigma-Aldrich Co) en concentraciones de 0,5 µM para estas células, la cual
fue disuelta en el medio respectivo.
En este experimento se contó con 4 grupos, entre los cuales se tenía un control, tiempo 0, OLA
10 µM, OLA 50 µM y OLA 80 µM. Adicionalmente se utilizó un grupo denominado control sin
marca, el cual se mantuvo intacto durante todo el experimento.
El experimento se realizó para las SW982 en un tiempo de 2 horas. Inicialmente se retiró el
medio de cultivo de las células y se agregó 450 µL de R-123 en su respectivo pozo, excepto al
15

16. grupo tiempo 0 y control sin marca como se mencionó anteriormente. Posteriormente se pasó a
incubación de las células a 37° C por 30 min. Despu és de transcurrido este tiempo se retira la
R-123 y se lava con PBS 3 veces, seguido se procedió a agregar los compuestos (OLA
diferentes concentraciones) en el pozo correspondiente y a continuación se incubó las células
con este tratamiento por 2 horas. Cuando faltaban 30 min para cumplirse el tiempo (2 horas) se
agregó la R-123 al grupo tiempo 0, con el fin de que esta entre a la célula en ese tiempo y se
encuentre en las mismas condiciones de tiempo de incubación. Después del tiempo trascurrido
se lavaron las células 3 veces con PBS, se agregó 300 µL de tripsina y se esperó que las estas
se soltaran, posteriormente se bloqueó la tripsina con 300 µL del medio de cultivo para este tipo
de células y se centrifugó a 1800 rpm por 5 min. Finalmente se re-suspendieron los pellet con
PBS y se procedió a pasar la suspensiones por el citómetro de flujo (COULTER EPICS XL-
MCL™) en donde se contaron 15000 eventos y posteriormente se recopilaron los datos en el
software EXPO32.
4.5 Western blot.
Este es un método en biología molecular para la detección de proteínas en una muestra de un
tejido homogenizado o extracto. O en un proceso de purificación de proteínas. Se fundamenta
en una electroforesis en geles de poliacrilamida para separar las proteínas desnaturalizadas
(SDS-PAGE) y un revelado específico con anticuerpos. Permite cuantificar la cantidad de
proteínas en la muestra y comparar los niveles de presencia entre varios grupos.
4.5.1 Expresión de Pgp en la célula tumoral por SDS-PAGE revelado por Western Blot
Se cuenta con un cultivo celular SW982 (8.000 células por pozo), las cuales se pretende tratar
con DXR en concentración fija de 0,1 µM, OLA a 10, 25 y 50 µM y tres mezclas de DXR+OLA.
Después de aplicar el tratamiento se incubó por 72 horas. Después de este tiempo las células
fueron lavadas con PBS y re-suspendidas con buffer de lisis (20M Tris/acetate, pH 7.5, 270 mM
sucrose, 1 mM EDTA, pH 8.8, 1 mM EGTA, pH 8.8, 1% Triton X-100, 1 mM ortovanadate, 1 mM
sodium glycerophosphate, 5 mM sodium fluoride, 1 mM sodium pyrophosphate, 5 mM
bmercaptoethanol, 1 mM benzamidine, 34.8 lg/ml PMSF, 5 lg/ml leupeptine. Las muestras
fueron sonicadas y calentadas a 100° C por 2 min y se procede a medir proteína utilizando el kit
BCA (Pierce Biotechnology, Rockford, USA). Para el análisis de western blot se cargaron 15 µg
de proteínas en 6 % SDS-gel poliacrilamida y se transfirieron a la membrana de nitrocelulosa
(Bio-Rad Laboratories, Richmond, C, USA). Las membranas fueron bloqueadas por incubación
16

17. en buffer TBS (0,1 % de Tween 20 y 5 % de leche en polvo desnatada) por 1 hora a
temperatura ambiente y lavadas 3 veces con buffer TBS de 0,1 % Tween 20. Se incubó
overnight el anticuerpo primario anti PGP 1/1000 (mouse de Santa Cruz Biotech, USA).
Después de esta tiempo se lavó con buffer TBS de 0,1 % Tween 20 por 5 minutos 3 veces y a
continuación se pone el anticuerpo secundario el cual es un anti-mouse 1/5000 acoplado a
peroxidasa que está en una solución bloqueadora. Se lavó 3 veces con buffer TBS de 0,1 %
Tween 20 por 5 minutos y finalmente se reveló con ECL (GE Healthcare UK Limited)
4.6 Estadística
Los datos utilizados son la media +/- SEM. Se utiliza ANOVA de un factor con análisis Post Hoc
de Bonferroni. Valores de P<0,05 fueron considerados estadísticamente significativos. Software
utilizado GraphPad 5.03.
17

18. 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se han realizado los siguientes experimentos:
5.1 Viabilidad de las células SKUT-1 y SW982 mediante el tratamiento con DXR y con
DXR+OLA
Se estudia el efecto potenciador del OLA sobre el fármaco DXR de forma independiente y en
mezcla entre estos en las células SKUT-1 y SW982.
% OLA - DXR 24 SKUT-1 % OLA - DXR 24 SW982
120 DXR
120
OLA- DXR
OLA- DXR
100 100 OLA
OLA
80 80
DXR
* * * *
60 60
*
* * 40
40
20 20
0 0
-9 -8 -7 -6 -5 -4 -9 -8 -7 -6 -5 -4
DXR DXR
Gráfico 1. Experimento de viabilidad celular, en el que se analiza la muerte de células SKUT-1 y SW982 ocasionado por
tratamiento de 24 horas con DXR, OLA y DXR+OLA. La concentración DXR varía en el experimento, mientras la concentración
de OLA permanece fija a 80 µM (ver Tabla 3). Experimento realizado 4 veces de forma independiente. Se realiza ANOVA con
análisis post hoc de Bonferroni para establecer diferencias estadísticamente significativas con. P<0.05.
Al realizar la ANOVA de un factor se puede observar que existen diferencias significativas en el
ensayo de viabilidad celular, tanto en células SKUT-1 como en SW982. En ambos tipos de
células las diferencias se generan según lo esperado en la mezcla DXR+OLA y se observa que
disminuyen la cantidad de células que permanecen después de este tratamiento. Para las
células SKUT-1 la mezcla DXR 0,1 µM + OLA 80 µM, genera un descenso en la viabilidad
celular del 31 %, en la mezcla DXR 0,5 µM + OLA 80 µM el descenso en la viabilidad es de 40
% y en la mezcla DXR 1 µM + OLA 80 µM el descenso es de 43 %. Las diferencias en las
células que permanecen entre el segundo y tercer punto no son significativas, queriendo decir
que el efecto potenciador se podría dar en la mezcla con DXR a una concentración de 0,5 µM y
que no es necesario tener concentraciones más elevadas de DXR como son el caso de la
18

19. mezcla DXR 5 y 10 µM con OLA 80 µM, en el cual estos efectos serían los mismos que el
tratamiento exclusivo con DXR a esas mismas concentraciones.
Para las células SW982 existen 3 mezclas con diferencias significativas en concentraciones
DXR 0,1 µM , DXR 5 µM y DXR 10 µM mezclado con OLA 80 µM, en los cuales se generaron
descenso en l viabilidad celular de 22, 30 y 27 % respectivamente. La mezcla de mayor
efectividad es DXR 5 µM + OLA 80 µM, no siendo la mezcla con mayor concentración de DXR
probada, sugiriendo que podría no ser necesario el aumento de la concentración de este
compuesto para obtener mejores resultados, lo cual es benéfico debido a que el tratamiento con
este antibiótico puede generar cardiotoxicidad(Andreadou et al, 2009; Lorusso et al, 2007),
debido a que presenta radicales libres que causan peroxidación de lípidos; y en donde podría
entrar a jugar un rol importante la actividad antioxidante de los TTPs(Herrera et al, 2006) en la
reducción de esta cardiotoxicidad.
5.2 DXR intracelular en líneas celulares SKUT-1 y SW982
Se presentan histogramas de DXR intracelular de las líneas celulares SKUT-1 y SW982 en
experimento a 24 horas.
Gráfico 2. Histograma del experimento de DXR intracelular a 24 h por citometría de flujo para las líneas celulares SKUT-1 y
SW982 sometidas a tratamiento con DXR y OLA a diferentes concentraciones y a sus respectivas mezclas.
19

20. Se realiza una comparación entre cada uno de los grupos con el fin de establecer diferencias
significativas en DXR intracelular por sometimiento de las líneas celulares SKUT-1 y SW982 a
tratamiento con DXR y OLA a diferentes concentraciones. En este experimento no se quiere
matar a las células durante un tratamiento a altas concentraciones con DXR, debido a que si
estas mueren se permeabilizan y permitirían la entrada del compuesto dentro de la célula, lo
que podría arrojar resultados erróneos. Por este motivo en estudios realizados anteriormente se
ha establecido que las células SKUT-1 necesitan menores concentraciones de DXR que las
células SW982.
SKUT-1 sw982
6 ** 15
*
* *
4 10
UR UR
2 5
0 0
+ 0,1
l
0, OL 5
0, OL 0
O 50
O 0
5
O 10
O 50
80
ro
+ X1
D +O A5
D + O 10
O 50
O 0
5
O 10
O 50
80
l
D 1+ E1
8
ro
D 1 + LA
LA
8
nt
LA
LE
A
LA
LA
LA
0, DX
nt
LA
1 LA
LA
LA
LA
LA
D
L
O
co
O
X1 O
co
O
+
1
+
1
1
0,
1
X
X
X
X
X
X
X
D
D
D
D
Gráfico 3. Análisis de la citometría de flujo de DXR intracelular para las líneas celulares SKUT-1 y SW982 en 24 horas, tratadas
estas células con DXR y OLA a diferentes concentraciones y a sus respectivas mezclas. Experimento realizado 4 veces de forma
independiente. Se realiza ANOVA con análisis post hoc de Bonferroni para establecer diferencias estadísticamente
significativas con P<0.05.
Al realizar el análisis estadístico ANOVA se encuentran 2 tipos mezclas con diferencias
significativas en cada uno de los tipos de células. En las células SKUT-1 y SW982, las mezclas
de DXR con OLA 50 µM y OLA 80 µM generan estas diferencias significativas con respecto al
grupo control y al tratamiento único con DXR (Gráfico 3). La mezcla de DXR 0,1 µM+OLA80 µM
para las células SKUT-1 presenta diferencias significativas con respecto a la mezcla DX 0,1 µM
+ OLA 50 µM, lo que sugiere que la primera de estas 2 mezclas tendría los mejores efectos.
Para línea celular SW982 no se encuentra diferencias significativas entre las mezclas DXR 1
µM + OLA 50 µM y DXR 1 µM + OLA 80 µM. Como se puede observar en el pico de los
20

21. histograma para estas mezclas (Gráfico 2), en donde este se mueve hacia la derecha, dando
como resultado una media superior que en las otras mezclas y que los compuestos sin mezclar.
El OLA es un compuesto que no tiene fluorescencia, mientras que el DXR si la presenta tal cual
como se puede observar en el gráfico 3. En este caso los datos entregados por el citómetro de
flujo son el DXR que permanece dentro de las células.
Está claro que la mezcla de los compuestos aumenta el DXR intracelular, lo cual es un efecto
benéfico, debido a que el OLA permitiría que el DXR permanezca más tiempo dentro de las
células tumorales y así realicé el efecto esperado, el cual es el rompimiento del ADN
conllevando a la muerte celular..
5.3 Acumulación intracelular de R-123 por citometría de flujo
En estos experimentos se buscaba la inhibición de la actividad de la Pgp por acción del OLA.
Se mide la salida de R-123 de la célula, si ésta permanece más tiempo dentro de la célula es
porque el OLA está inhibiendo la actividad de la Pgp, por el contrario si la célula expulsa
rápidamente a la R-123, podría suponerse que los compuestos estudiados no tienen efecto
sobre la actividad de esta proteína.
En un experimento realizado anteriormente, se determinó que las células SKUT-1 expresan
muy poco a la PgP debido a su baja actividad mitocondrial, mientras que las células SW982 si
la expresan de manera significativa (Imagen 1). De este modo se explica porque este
experimento se realizo únicamente con las células SW982.
Imagen 1. Expresión de la Pgp en las líneas celulares SKKUT-1 y SW982.
21

22. Se presenta el histograma del experimento acumulación intracelular de la Pgp por acción del
OLA en un tratamiento de 2 horas.
Grafico 4. Histograma del experimento de acumulación intracelular de Pgp por acción del OLA a diferentes concentraciones
por citometría de flujo en un tratamiento de 2 h para la línea celular SW982.
4
3
UR
2
1
0
H
0
10
50
80
TO
po
LA
LA
LA
em
lE
O
O
O
ro
Ti
nt
co
Gráfico 5. Acumulación intracelular de R-123 para la línea celular SW982 en 2 horas, tratadas con OLA a diferentes
concentraciones. Experimento realizado 4 veces de forma independiente. Se realiza ANOVA con análisis post hoc de
Bonferroni para establecer diferencias estadísticamente significativas con P<0.05.
La Pgp o también conocida como ABCB1 es un proteína que se sobre-expresa en las células
tumorales, la cual se ha estudiado que es una de las proteínas además de la ABCC1 que se
encargan de expulsar a los compuestos con los que se hace quimioterapia. Si el OLA es capaz
22

23. de disminuir la actividad de la ABCB1, podría utilizarse en conjunto con la DXR para que esta
permanezca más tiempo dentro de la célula y que sea efectivo el tratamiento contra el cáncer.
Al analizar el histograma (Gráfico 4) se puede observar como el OLA en diferentes
concentraciones no disminuye la actividad de la Pgp, lo cual se ratifica en el análisis estadístico,
en donde se realiza ANOVA de un factor (Gráfico 5) y no se encuentra ninguna diferencia
significativa entre los grupos comparados. Estos resultados coinciden con un estudio realizado
por un grupo de investigación de la Universidad Federal de Rio de Janeiro (Braga et al, 2007),
en el cual encontraron que OLA no afecta la actividad de Pgp, pero por otro lado se encontró
que el OLA modularía la actividad y no incrementaría la expresión de la proteína ABCC1 (Braga
et al, 2007), lo cual genera buenas proyecciones sobre este TTPs.
5.4 Expresión de Pgp en célula tumoral revelado por Western Blot
Se observan si existen diferencias en la actividad de la Pgp por tratamiento con OLA a
diferentes concentraciones por 72 horas en la línea celular SW982. La técnica utilizada fue la
electroforesis SDS-PAGE y revelado por Western Blot.
Imagen 2. Expresión de la proteína Pgp (ABCB1) en células SW982 tratadas con DXR y OLA. Las células fueron incubadas con
DXR, OLA y DXR+OLA por 72 horas y la expresión de Pgp fue cuantificada en el software TotalLab (GE Healthcare by the
TotalLab, USA). Imagen representativa de 2 experimentos.
23

24. A continuación se presenta el gráfico de barras de la cuantificación de la expresión de la Pgp
por tratamiento con DXR, OLA y la mezcla entre estos a diferentes concentraciones.
Expresión Pgp
2.0
1.5
UR
1.0
0.5
0.0
10
25
50
10
50
l
ro
1
25
0,
nt
LE
LE
LE
e
e
e
X
ol
0l
co
0l
D
O
O
O
X
X
X
D
D
D
Tratamiento
Gráfico 6. Expresión de la proteína Pgp (ABCB1) en células SW982 tratadas con DXR y OLA. Las células fueron incubadas con
DXR, OLA y DXR+OLA por 72 horas Experimento realizado 2 veces de forma independiente. Se realiza ANOVA con análisis post
hoc de Bonferroni para establecer diferencias estadísticamente significativas con P<0.05.
Al realizar la cuantificación en el software TotalLab, se establece que existe una disminución en
la expresión, pero al realizar el tratamiento estadístico mediante una ANOVA esta disminución
no alcanza a ser estadísticamente significativa. Se debe decir que los 2 experimentos
presentaron resultados que variaron uno con respecto del otro, lo cual se puede observar en el
SEM (estándar error of the mean) en el gráfico de barras (Gráfico 6). Los resultados apuntan a
que el OLA tiene tendencia a disminuir la expresión de la Pgp en las células tumorales SW982,
pero esto tendría que confirmarse o descartarse con otra serie de experimentos.
24

25. 6. CONCLUSIONES
La ingesta de OLA como micronutriente tiene un efecto saludable. El triterpeno OLA tiene un
efecto antitumoral limitado pero actúa de potenciador del fármaco antitumoral DXR. OLA
aumenta la permanencia del DXR en la célula tumoral aumentando el porcentaje de muerte
celular. El efecto combinado de OLA con el fármaco DXR disminuye la viabilidad celular, y
permite disminuir el grado de cardiotoxicidad del fármaco.
OLA no disminuye la actividad y la expresión de la proteína de membrana Pgp que actúa como
bomba de expulsión del fármaco DXR. Es necesario realizar otra serie de experimentos para
confirmar estos resultados y obtener datos estadísticamente aceptables.
25

26. 7. REFERENCIAS
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