Este documento describe los métodos utilizados para la identificación molecular de Podosphaera pannosa mediante el análisis de la secuencia de la región ITS del ADN ribosomal. Se extrajo ADN de muestras, se amplificó la región ITS mediante PCR y se secuenciaron los productos. Las secuencias se compararon con las de la base de datos NCBI para confirmar la identidad.

1. Caracterización molecular
Primers
ITS1F (5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3') (Gardes y Bruns, 1993)
ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') (White et al., 1990)
Leus et al., 2006
La secuencia obtenida fue alineada en la base de
datos del NCBI. La secuencia se deposito en el
GenBank.

2. Caracterización molecular
Extracción 50 mg de tejido pulverizado + 300 µL de Plant DNAzol +
300 µL de Cloroformo al 100%
14 000 rpm x 12 min
Precipitación ADN Sobrenadante obtenido + 300 µL de metanol al 100% 12 000 rpm x 4 min
Lavado ADN 300 µL de solución (Plant DNAzol + cloroformo)
300 µL de etanol al 75% 7500 rpm x 4 min
Solubilización ADN Agua Desinonizada (Libre de RNAsas, DNAsas,
Proteasas, etc.)

3. La identificación morfológica se confirmó mediante análisis de
secuencia de la región ITS del ADNr (Leus et al., 2006).
Primers utilizados para la amplificación del ADN
Primers
ITS1F (5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3') (Gardes and Bruns, 1993)
ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') (White et al., 1990)
Un forward y un reverse se utilizaron en una reacción de PCR para amplificar el ADN
ribosomal de la región ITS, con una pequeña porción de los genes 18S y 28S, la región
completa ITS1, el gen completo 5.8S y la región completa ITS2.

4. Solución
(20 µL volumen final) 1X
Agua 6.60 µL
2x Phire Plant PCR Buffer 10 µL
ITS1F 1 µL
ITS4 1 µL
DNA 1 µL
Phire Hot Start II DNA
Polymerase
0.4 µL
20 µL
Mezcla de reacción
 Amplificación por PCR

5. Programa del termociclador
ETAPA Temp.
°C
Tiempo Ciclos
Iniciación 94 5 min
Desnaturalización 94 1 min 35
Alineación 65 1 min
Extension 72 2 min
Extensión final 72 10 min
(Leus et al., 2006), con algunas modificaciones.

6. Para asegurar que el material se amplificó, el producto de PCR se
detectó mediante la ejecución de 5 μL del producto de la PCR en 2 μL de
buffer de carga sobre gel de agarosa al 1% en 1X TAE buffer (Tris-
acetate-EDTA, Thermo Scientific) y se visualizó en un transiluminador
(GVM20 Syngene, UK).

7.  Purificación del ADN
DNA Clean & Concentrator™ -5

8. El producto de la PCR fue secuenciado en ambas direcciones con ayuda del
BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1, en un analizador genético ABI
Prism 3130XL (Applied Biosystem®, USA). Las secuencia obtenida se alineó y
comparó con las secuencias de la base de datos del National Center for
Biotechnology Information (NCBI) mediante el Basic Local Alignment Search
Tool (BLAST® 2.2.) (Zhang et al., 2000).

9. La identificación morfológica se confirmo mediante análisis de secuencia de
la región ITS del ADNr (Leus et al., 2006).
Primers utilizados para la amplificación del DNA
IDENTIFICACION MOLECULAR DE Podosphaera pannosa
Primers
ITS1 (5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3') (Gardes and Bruns, 1993)
ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') (White et al., 1990)
ITS5 (5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3') (White et al., 1990)

10. EXTRACCION DE ADN
Extracción 50 mg de tejido pulverizado + 300 µL de Plant DNAzol + 300 µL de
Cloroformo al 100%
14 000 rpm x 12 min
Precipitación
ADN
Sobrenadante obtenido + 300 µL de metanol al 100% 12 000 rpm x 4 min
Lavado ADN 300 µL de solución (Plant DNAzol + cloroformo)
300 µL de etanol al 75% 7500 rpm x 4 min
Solubilización
ADN
Agua Desinonizada (Libre de RNAsas, DNAsas, Proteasas, etc.) Protocolo Plan DNAzol

11. Solución
(20 µL volumen final) 1X
Agua 6.60 µL
2x Phire Plant PCR Buffer 10 µL
ITS1f 1 µL
ITS4 1 µL
DNA 1 µL
Phire Hot Start II DNA
Polymerase
0.4 µL
20 µL
MEZCLA DE REACCION
AMPLIFICACIÓN PCR

12. PROGRAMA DEL TERMOCICLADOR
ETAPA Temp.
°C
Tiemp
o
Ciclos
Iniciación 94 5 min
Desnaturalización 94 1 min 35
Alineación 65 1 min
Extension 72 2 min
Extensión final 72 10
min
(Leus, et al., 2006), con algunas modificaciones

13. 1. Marcador de peso molecular 100 pb
2. Producto PCR Anidado (con leche)
3. Producto PCR Anidado (sin leche)
4. Producto PCR Anidado (con leche)
5. Producto PCR Anidado (Sin leche)
6. Producto PCR (con leche)
7. Producto PCR (Sin leche)
100 pb
200 pb
300 pb
400 pb
500 pb
600 pb
700 pb
Gel de agarosa 1%
1 2 4 5 6

14. PURIFICACION DEL ADN
DNA Clean & Concentrador ™ -5

15. ALINEACIÓN NCBI PAIS Y HOSPEDANTE SIMILARIDAD (%)
KF571742 China/Rosa chinensis 100%
AB525939 Japón/Rosa maltiflora 100%
AB022348 Japón/Rosa sp. 100%
DQ139427 Alemania/ Rosa sp. 100%
KF753690 México/Rosa sp. var. opera 100%
AF011323 Estados Unidos/ Rosa sp. 99%
AF298543 Suiza/ Rosa sp. 99%
AB525937 Argentina/ Rosa rubiginosa 99%
Comparación de secuencias de Podosphaera pannosa en Rosa sp. Var. Samourai
alineadas en el banco de genes del NCBI.
PCR directo

16. ALINEACIÓN NCBI PAIS Y HOSPEDANTE SIMILARIDAD (%)
KF753690 México/Rosa sp. var. opera 99%
DQ139427 Alemania/ Rosa sp. 99%
AB022348 Japón/Rosa sp. 99%
AF298543 Suiza/ Rosa sp. 99%
KF571742 China/Rosa chinensis 98%
AB525939 Japón/Rosa maltiflora 98%
AB525937 Argentina/ Rosa rubiginosa 98%
AF011323 Estados Unidos/ Rosa sp. 98%
Comparación de secuencias de Podosphaera pannosa en Rosa sp. Var. Samourai
alineadas en el banco de genes del NCBI.
PCR Anidado

17.  Abs 260 / Abs 280 mayor de 1.75: corresponde a un grado de pureza adecuado.
 Abs 260 / Abs 280 menor de 1.75: la preparación está contaminada con proteínas.
Los pasos para calcular la concentración del ADN en el Biofotómetro son los siguientes:
1. Conectar y Encender el Biofotómetro.
2. Seleccionar la función ADN doble cadena o en su caso ADN cadena sencilla.
3. Seleccionar “Medir Blanco” (Agua Bendita)
4. Realizar la dilución 1:100 (10 μL de la muestra en 990μL de agua bendita) en una Cubeta y posteriormente
introducirla en el Biofotómetro.
5. Elegir la función “Dilución” y anotar las cantidades de la dilución realizada en el paso 4.
6. Finalmente presionar la tecla “Muestra” y nos arroja la concentración de la muestra de ADN en μg/mL o ng/μL .
Si al presionar la tecla Muestra no da un valor, presionar la tecla “Enter”.