1. Producción de estreptavidina monomérica soluble con capacidad de unión reversible de biotina
- Unión de biotina requiere Trp120 de subunidad adyacente.
- Mutación (T76R, V125R)  efectiva para monomerizar.
- 1 muteina  (T76R, V125R, V55T, L109T); T76R, V125R(monomerizar), V55T, L109T(mejorar
hidrofobicidad en interfase).
- Muteína oligomérica efectiva en avidina  D61A, W120K
- Estreptavidina  homotetramérica, Trp adyacente importante para unión de biotina y
comunicación de subunidades.
- Monómero de avidina  solo en ausencia de biotina.
- 2ª generación de monómero de avidina N54A, W110K
- Asp61 y Trp120 Al cambiarlos por AK no se convierte en monómero como en avidina.
- Monómero a través de mutaciones de 3 Ala  baja afinidad por biotina.
- Val55, Thr76 y Val125 en combinación con L109T se creó estreptavidina, producida por B. Subtilis
- A medida que se produce su forma soluble sin replegamiento, se analiza el estado oligomérico
por SDS-PAGE. Se purificaron muteínas y se confirmo estado monomérico.
- Unión de biotina se determino por biosensores de resonancia de plasmones superficiales.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Construcción de muteinas
- 5 mutantes (V125R, V125T, V55R, V55T, T76R) fueron construidos usando pSSAV-Tcry.
- Resultaron 5 plásmidos (pV125R, pV125T, pV55R, pV55T, pT76R).
- 2 mutaciones dobles  M2 (T76R, V125R, AK (D61A, W120K).
- M4 (T76R, V125R, V55T, L109T)  1º Fragmento (T76R, L109T) se amplifico usando primers y
plantilla, se digirió por enzima y se recupero el fragmento en pV555T, pT76R, L109T. 2º fragmento
digerido del pV125R fue usado para reemplazar el fragmento correspondiente y generar pV55T,
T76R, L109T, V125R.
Producción y purificación
- Estreptavidina salvaje fue producida y secretada por B. Subtilis WB800 en medio definido y
agarosa iminobiotina. Se purifico la proteína producida.
- Producción y purificación de muteína  se usa medio super nutritivo y agarosa-biotina como
matriz de afinidad.
- Concentración de estreptavidina purificada fue determinada espectrofotómicamente.
- Tamaño de moléculas  filtración en gel y dispersión dinámica de luz.
Proteasa K, digestión de estreptavidina y muteinas
- Estreptavidina y muteinas purificadas fueron tratadas por proteasas K a 30º en 50mM de Tris-HCl
a pH 8. La reacción fue detenida por precipitación con acido tricloroacético.
Análisis cinético de muteinas
- Se usa biosensores BIAcoreX de resonancia de plasmones superficiales.
- Biotina conjugada del suero de albumina fue usada para estudiar la reversibilidad de unión de la
biotina.
RESULTADOS
Selección de principales residuos de estreptavidina por mutagénesis de sitio directo

2. - Interacción más extensa entre subunidad A y B (C y D)
- A – B  17 pte H y 2 pte salino y muchos van der Waals
- A – D  2 pte H
- A – C  interacciones más débiles
- Enfoque atractivo  introducir repulsiones de carga e impedimento estérico en interface.
- A ácidos interfaciales en superficie rígida y maximizar repulsión.
- Estreptavidina  8 hebras antiparalelas (lamina beta). A ácidos seleccionados deberían ser de la
lámina beta.
- A acido seleccionado debe estar cerca del A acido equivalente o cargado de otra subunidad 
fueron seleccionado Thr76, Val125 y Val 55.
Efectos de las mutaciones simples en la monomerización
- Análisis del sobre nadante no hervido por SDS-PAGE  efecto de mutación, muestras analizadas
en ausencia y presencia de biotina (biotina fortalece interacción de subunidades).
- Impacto de subunidades débiles T76R > V125R < V125T ~ V55R < V55T.
- T76R (M1) permaneció monomérica en presencia de biotina, al contrario V55T permaneció
tetramérica aun en ausencia de biotina.
- Otras mutaciones, en presencia de biotina se desplazaban a tetrámeros.
- Cambiando VR tiene mayor impacto que VT (V125 y V55).
Efectos de múltiples mutaciones en la monomerización
- M2 (T76R y V125R).
- M4 (T76R, V125R, V55T, L109T)  capacidad de unión de biotina reversible. VVV, V y L fueron
cambiados por hidrofóbicos.
- AK (D61A, W120K)  equivalente a avidina
Purificación de muteinas
- Proteína parcialmente purificada por cromatografía de intercambio iónico se pasa en columna de
agarosa biotina.
- M4 es eluida con biotina por un tampón y luego la biotina se saca por diálisis.
- M1 se demora mas en eluir (puede no tener propiedad de unión a la biotina reversible).
Determinación de tamaño por filtración en gel
- M2 (19.95 kDa) en ausencia de biotina.
- M4 (21.87 kDa) en ausencia de biotina.
- Muteinas son monoméricas porque su masa es más pequeña que los dímeros.
- AK (56.66 kDa) en ausencia de biotina (naturaleza oligomérica).
Determinación de masa por dispersión de luz dinámica
- M2 y M4 son monomérica (sin biotina).
- AK es oligomérica (con o sin biotina).
Sensibilidad a proteasa K
- Estreptavidina salvaje fue convertida a su forma natural (en ausencia o presencia de biotina).
- Estreptavidina natural fue resistente a la degradación por proteasa K.
- M2 y M4 eran más susceptibles (consistente con naturaleza monomérica).
- Ak igual era susceptible pero se porto diferente.
- Eran mas susceptibles en presencia de biotina.

3. Reticulación de estreptavidina y muteinas
- Usando sulfo-EGS como agente y reacciona con alfa amino en N-terminal y el grupo épsilon
amino en la cadena lateral de Lys.
- Estreptavidina salvaje  8 residuos de lisina en cada subunidad. Lys121 (A) está a 14.1 A de
Lys121 (D).
- Sulfo-EGS  radio espaciados de 16.1 A, fácil Reticulación de A-B y C-D.
- Se debe reconocer estreptavidina tetramérica y monomérica.
- Lisozima se utilizó como control negativo (es monomérica en solución).
- Se mostró que con sulfo-EGS las subunidades fueron reticuladas a dímero y oligómero.
- M2 y M4 se comportaron de manera similar, migraron como monómeros con pequeñas
cantidades de dímeros.
- AK mostró perfil similar a estreptavidina salvaje (oligomérica).
Interacción reversible entre muteinas y biotina
- Variación de interacción fue determinado por biosensores Blacore de resonancia de plasmones
superficiales.
- M2, M4 y AK  Kd ~10-7 M (AK era ligeramente más bajo que M2 y M4).
- Masa molecular afecta la Ka (rango superior)  AK es oligomérica pro ende puede influir.
DISCUSION
- Avidina y estreptavidina tiene estructura 3D parecida, pero la monomerización de estreptavidina
es más difícil.
1) Estreptavidina tiene interacciones interfaciales más fuertes que la avidina y son requeridas
mutaciones mas fuertes para debilitar las interacciones.
2) Monomerización de estreptavidina puede resultar en la exposición de A ácidos hidrofóbicos
que están en la interface.
- Avidina es glicosilada con cadena carbohidratada en cada subunidad.
- T76R puede ser muy efectiva para monomerizar .
- M1 fue eluida a una posición correspondiente a la forma monomérica.
- M2  2 mutaciones (T65R, V125R)  monómero, mejora en el perfil de elusión, cerca de 90%
fue recuperada.
- Para que el monómero permanezca estable la interface AB (CD) tiene 3 residuos hidrofóbicos
(Val55, Leu109, Val125), V125 se cambio por R y V55 y L109 se cambiaron por T, ya que si se
cambiaban por R su pI subía y se incrementaban interacciones no específicas de la columna.
- M4  perfil de elusión muy agudo con su purificación usando biotina-agarosa, 95% fue
recuperado en la columna.
- Cambiar T76 por R para lograr máxima repulsión electrostática e impedimento estérico con R59
de las otras subunidades.
- Val125 en A tiene interacción con B, C y D  si se cambia por R habrá repulsión en D e
impedimento estérico en B, C y D.
- Val55 en A solo se acerca a R59 en B, no tiene impacto cambiar VR.
- AK  oligomérico (importancia de seleccionar residuos críticos para alcanzar la máxima
monomerización).